Pr. BEKKI Doctorat d état en Microbiologie Université des Sciences de NICE. France Directeur Labo de Recherche et responsable de plusieurs projets de

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1 Pr. BEKKI Doctorat d état en Microbiologie Université des Sciences de NICE. France Directeur Labo de Recherche et responsable de plusieurs projets de recherche JEAI SYMED-IRD Porteur du L3 HCFAUR Master Biotechnologie Doctorat LMD

2 Masters ouvrant droit à l inscription au concours par ordre de priorité: MASTER SNV * Rhizobiologie *Microbiologie ou équivalent SYMED PNR-CNEPRU

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4 PROGRAMME Chapitre I : Le monde microbien Historique Place de microorganismes dans le monde vivant Caractéristiques générales de la cellule procaryote Chapitre II Techniques d observation de la cellule bactérienne La morphologie cellulaire La paroi Composition chimique Structure moléculaire Fonctions Coloration de Gram La membrane plasmique 4.1. Composition chimique Le cytoplasme 5.1. Les ribosomes 5.2. Les substances de réserve Le chromosome 6.1. Morphologie 6.2. Composition 6.3. Réplication chimique 6.4. Structure Structure Fonctions Les plasmides 7.1. Structure Pilli La capsule Les cils et flagelles La spore Morphologie Structure Phénomènes de sporulation Propriétés Germination Réplication Propriétés Structure Fonction Morphologie Composition chimique Fonctions Mise en évidence Structure Fonctions

5 CHAPITRE I: Le Monde Microbien Historique Place des Microorganismes dans le monde vivant Caractéristique de la cellule procaryote

6 1-1- Définition Microbiologie domaine d études s intéressant aux organismes de taille microscopique, en particulier aux bactéries, protozoaires, virus et certains champignons (levures) et algues unicellulaires de petite taille.

7 Définition suite La microbiologie englobe l e n s e m b l e d e s disciplines biologiques qui concernent ces micro-organismes : bactériologie, mycologie, virologie et parasitologie.

8 Définition suite étudie non seulement la morphologie des microorganismes, mais également leur mode de vie, leur métabolisme, leur structure moléculaire, leurs éventuelles propriétés pathogènes et leurs caractéristiques antigéniques (propres à susciter une réponse du système immunitaire).

9 1-2-HISTORIQUE EMPIRIQUE Utilisation des microbes sans les connaître (conservation des aliments, production de fromage, boissons)

10 DECOUVERTE DU MICROSCOPE Antonie Van Leeuwenhoek en 1674)

11 Naturaliste hollandais, fabricant de microscopes Né à Delft, aux Pays-Bas, Atonie Van Leeuwenhoek ne bénéficia pas d'un enseignement scientifique particulier. Placé comme apprenti chez un drapier d'amsterdam après quelques années d'étude dans un collège, il s'installa en 1649 comme maître drapier dans sa ville natale.

12 C est en exerçant son métier qu il chercha à améliorer le pouvoir grossissant des loupes. Le comptage des fils par unité de surface est en effet indispensable pour déterminer la qualité du drap. Il inventa donc, à ses heures perdues, une petite lentille biconvexe (dont il garda d'ailleurs le secret, de sorte que, jusqu'au développement du microscope composé au XIXe siècle, personne ne put concurrencer ses travaux)

13 en insérant la lentille entre deux plaques d argent ou de cuivre percées d un très petit orifice. L objet à étudier est maintenu à la distance focale au sommet d une tige dont on peut régler la hauteur par un système de vis. À travers cet appareil, il pouvait voir les objets sur des têtes d'épingle, les agrandissant de 50 à 300 fois (un grossissement dépassant nettement celui d'appareils plus anciens).

14 La curiosité de van Leeuwenhoek était illimitée. Grâce à son invention, il explora le monde de l'infiniment petit, en examinant tout ce qui lui tombait sous la main. Il en fit des descriptions d'une très grande précision. En 1668, il confirma et étoffa la découverte de l'anatomiste italien Marcello Malpighi sur les capillaires, démontrant comment les globules rouges circulent à travers les capillaires de l'oreille du lapin ou de la patte de grenouille.

15 En 1674, il fit le premier la description anatomique des globules rouges du sang. Puis il observa la présence de micro-organismes tels que les protozoaires et les bactéries dans l'eau stagnante et dans la salive humaine. En 1677, il décrivit l'anatomie du spermatozoïde, sans se douter de sa fonction

16 L'invention de van Leeuwenhoek lui valut rapidement une réputation telle que beaucoup de ses compatriotes et les étrangers les plus haut placés (notamment le tsar Pierre le Grand de passage à Delft) lui demandent la faveur d être admis à regarder dans l appareil les merveilles du monde inconnu des infiniment petits. En reconnaissance de ses découvertes, il fut nommé membre de la Royal Society de Londres.

17 EPOQUE PASTORIENNE

18 Né le 27 décembre 1822, Louis Pasteur fréquente l école puis le collège d Arbois. Elève doué, il s installe en octobre 1838 dans une pension du Quartier Latin qui prépare à l entrée à l Ecole Normale. Mais le jeune homme supporte difficilement cette nouvelle vie et rentre à Arbois pour poursuivre ses études au collège royal de Besançon

19 Pasteur s installe de nouveau à Paris et est reçu quatrième au concours de l École Normale Supérieure en Il passe alors ses dimanche après-midi avec le préparateur du célèbre chimiste JeanBaptiste Dumas.

20 Il soutiendra d ailleurs deux thèses en 1847, l une en chimie et l au t re e n ph ys iq u e. Ses recherches se portent alors sur la polarisation de la lumière par les c r i s t a u x.

21 Il découvre que certains cristaux de structures identiques ne dévient pas la lumière de la même façon. Certains la dévient vers la droite, d autres vers la gauche. Pasteur vient de mettre en évidence l isomérie.

22 fait une découverte capitale : les levures sont des êtres vivants à part entière responsables de la fermentation et non des sous-produits de celle-ci, comme de nombreux chimistes le c r o i e n t.

23 M a i s d e p u i s , Pasteur est en bute aux p a r t i s a n s d e l a génération spontanée et plus particulièrement à Félix Archimède Pouchet

24 Félix Archimède Pouchet communique une note à l Académie des Sciences en décembre 1858 sur des proto-organismes nés spontanément dans l air. Pasteur lui réplique aussitôt qu il a tort

25 Le 7 avril 1864, Pasteur donne une conférence à la Sorbonne. Ses expériences conquièrent le public, la commission d experts et les médias. Pouchet est vaincu et avec lui la thèse de la génération spontanée.

26 Les problèmes de contamination seront rapidement réglés par l équipe de Pasteur qui met au point le filtre Chamberland (un filtre en porcelaine qui retient les germes de l eau), l autoclave et le flambage des vases

27 En Allemagne, Robert Koch prouve par ses expériences qu un type donné de microbe provoque un certain type de maladie. La découverte du staphylocoque par Pasteur suivra

28 Staphylocoque au microscope après coloration

29 Staphylocoque

30 charbon des moutons, choléra des poules, rage des chiens Pasteur s intéresse plus aux maladies qu il peut cultiver sur des organes : charbon des moutons, choléra des poules, rage des chiens.

31 Découverte du vaccin En été 1879, Pasteur et ses collaborateurs, Roux et Duclaux, découvrent que les cultures vieillies du microbe du choléra injectées aux poules ne déclenchent pas la maladie. De plus, elles résistent à de nouvelles infections.

32 Première vaccinnation Le 5 mai 1881, un troupeau de moutons est vacciné. Le 2 juin, les résultats sont là : un véritable succès.

33 La maladie de la rage infection aiguë du système nerveux central de l homme et des animaux, provoquée par un virus qui pénètre dans l organisme sain à la suite de la morsure ou du léchage d une plaie par un animal contaminé.

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35 Pasteur a débuté ses recherches sur la rage en 1880, suite à la mort d un enfant à l hôpital Sainte-Eugénie. Mais alors que l étude de la virulence de la maladie avance

36 Le 6 juin 1885, Pasteur reçoit la visite de Marie-Angélique Meister dont le fils Joseph a été mordu par un chien soupçonné de porter la rage. Il commence les injections et trois mois plus tard, l enfant sauvé, Pasteur présente ses travaux à l Académie des Sciences qui lui offre un accueil enthousiaste

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38 L Institut Pasteur naît en Outil de recherche, de formation et de soins, l établissement s exporte rapidement en Australie et au Viêt-nam. Pasteur restera à la tête de l Institut jusqu à sa mort, le 28 septembre 1895

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40 Pasteur a obéi toute sa vie à l idéal le plus pur, à un idéal supérieur de science. L avenir le rangera dans la radieuse lignée des apôtres du bien et de la vérité. " C est avec ces mots que Poincaré accompagne la dépouille mortelle de Louis Pasteur, en La France pleure alors un de ses plus grands scientifiques.

41 CHAPITRE I: Le Monde Microbien Place des Microorganismes dans le monde vivant Caractéristique de la cellule procaryote

42 1-3-Place des Microorganismes dans le monde vivant

43 1-3-Caractéristique de la cellule procaryote Cellule Procaryote Cellule Eucaryote

44 Organisation génétique Cellule procaryote Cellule eucaryote Absente Présente Généralement 1 > 1 Oui* Non Histones Absentes Présente Nucléole Absent Présent Transfert unidirectionnel Fusion de gamètes Méthionine ou Nformylméthionine Méthionine Membrane nucléaire Nombre de chromosomes Chromosome circulaire Echange génétique Premier acide aminé initiant la synthèse d'une chaîne polypeptidique

45 Structures cellulaires Procaryote Eucaryote Réticulum endoplasmique Absent Présent Appareil de Golgi Absent Présent Lysosomes Absents Présents Mitochondries Absentes Présente Chloroplastes Absents Présents chez les plantes Microtubules Absents** Présents

46 Structures cellulaires (suite) Présence de stérols dans les membranes Endospores Taille des ribosomes Localisation des ribosomes Procaryote Eucaryote Non*** Oui Parfois présente Absentes 70 S 80 S (sauf mitochondries et chloroplastes) Dispersés dans le cytoplasme Liés au réticulum

47 CHAPITRE II 2-1-Techniques d observation 2-2- La morphologie cellulaire 2-3- Constituants de la cellule bactérienne

48 microscopie optique (G x fois). microscopie électronique (G x > fois)

49 2-2- La morphologie cellulaire En reconnaît la morphologie des bactéries par observation microscopique Morphologie = dimensions (taille), Forme, arrangement ou groupement

50 Taille La taille des bactéries se situe entre les virus et les protozoaire. cad Les plus grandes bactéries ont la taille d un protozoaire

51 Figure

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53 La Forme Les formes des bactéries sont très variable. Il existe 3 classe principales A- La forme sphérique ou cocoïde = les cocci B- La forme cylindrique = Batonnet C- La forme spirale ou hélicoïdale

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55 Forme Cylindrique (en Bâtonnet - Bacille)

56 Forme sphérique

57 Forme en spirale (spirille) et autres formes Steptomyces Mycobactérie

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59 2-3- Constituants de la cellule bactérienne

60 Morphologie d une cellule bactérienne

61 2-3- Constituants de la cellule bactérienne Les constituants obligatoires

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63 A- La paroi Enveloppe rigide qui (20% PS de la cellule), elle confère à la cellule sa forme, lui donne sa résistance et entoure une autre enveloppe plus mince, la membrane cytoplasmique.

64 A1- Composition chimique La paroi est formé d un polymère appelé, Le Peptidoglycane ou Mucopeptide ou Mucocomplexe (figure 3)

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66 Paroi des Gram+ et Gram- Il existe une différence entre la composition de la paroi des gram+ et Gram- comme le montre le tableau 3, Figure 4 et 5

67 Tableau 3 : Composition chimique de la paroi des bactéries Gram+ et GramLes éléments Osamines Acides Amininés Nombre A. aminés Acides teichoique Bactérie Gram+ Bactérie Gram à 35% 50% 4 à à Oses (sucres) 20 à 60% 20 à 60% Lipides 1 à 2.5 % 10 à 22 %

68 Structure des paroi Gram+ 20 à 80 nm

69 Structure des paroi Gram- 7à 8 nm 2 à 7 nm

70 Structure des paroi Gram+ et Gram- ( GRAM+ GRAM-

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74 A3- Coloration de Gram La coloration de Gram mise au point en 1884, s'effectue en trois temps.. Dans un premier temps, les bactéries sont colorées en violet par un colorant basique tel que le violet de gentiane puis par une solution de lugol (mordançage).. Dans un deuxième temps, qualifié de temps de différenciation, les bactéries sont soumises à l'action de l'alcool ou d'un mélange alcool + acétone. Les bactéries se répartissent en deux catégories : celles qui conservent la coloration violette et qui sont qualifiées de bactéries à Gram positif et celles qui sont décolorées et qui sont appellées bactéries à Gram négatif.

75 Coloration de Gram suite Dans un troisième temps, afin de mieux visualiser les bactéries décolorées, on procède à un traitement par la fuchsine ou par la safranine. Les bactéries à Gram positif apparaissent alors violettes et les bactéries à Gram négatif se recolorent en rouge ou en orange... Le mécanisme de cette coloration est connu. Le violet de gentiane se fixe sur des composants cytoplasmiques et après ce temps de coloration, toutes les bactéries sont violettes. Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi, riche en lipides, laisse passer l'alcool (ou le mélange alcool + acétone) qui décolore le cytoplasme alors que, chez les bactéries à Gram positif, la paroi constitue une barrière (A. Teichoique) imperméable à l'alcool et le cytoplasme demeure coloré en violet.

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81 Pourquoi cette différence de couleur (Voir tableau) Les éléments Bactérie Gram+ Bactérie Gram à 35% 50% Nombre A. aminés 4 à à 17 Acides teichoique Osamines Acides Amininés Oses (sucres) 20 à 60% 20 à 60% Lipides 1 à 2.5 % 10 à 22 %

82 Composition Chimique de la Paroi Les éléments Bactérie Gram+ Bactérie Gram à 35% 50% Nombre A. aminés 4 à à 17 Acides teichoique Osamines Acides Amininés Oses (sucres) 20 à 60% 20 à 60% Lipides 1 à 2.5 % 10 à 22 %

83 N-Acetylglucosamine CH2OH OH NAcetylglucosamine OH HO NH-CO-CH3

84 N-Acetyl muramique CH2OH OH HO NH-COCH3 H3C-CH-COOH Acide N-acetylmuramique

85 CH 2O H CH2OH O H O H H O NHCOCH3 OH NAcetylgluc osamine HO O H NH-COCH3 H3C-CH-COOH Acide N-acetylmuramique

86 La Galatosamine Présente chez certaines espèces seulement et en faible proportion

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92 A2- Rôle de la paroi Elle assure la forme de la cellule Résistance à la pression interne de la cellule Siege de la fixation des bactériophages

93 LES ACIDES AMINES D- et L- ALANINE A. GLUTAMIQUE L- LYSINE

94 ACIDES TECHOIQUES Absent chez les gram- Polymères de: POLYRIBITOL-PHOSPHATE ou POLYGLYCEROL-PHOSPHATE

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96 Oses (Sucres) Glucose Galactose Mannose Fructose Certains sont spécifiques (ex. Rhamnose chez les streptocoques du groupe A)

97 2-3- Constituants de la cellule bactérienne Les constituants obligatoires (constants)

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99 B- Membrane cytoplasmique Elle entoure le cytoplasme. Elle est constituée d'une double couche d'unités de phospholipides (30-40 %) et de % protéines qui lui sont associées (figure 8 a et b).

100 Figure 8 a: structure de la membrane cytoplasmique

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102 La membrane cytoplasmique des bactéries se distingue de celle des cellules eucaryotes par l'absence de stérols. Elle est caractérisée par son extrême fluidité qui est liée au déplacement et à la rotation des groupements lipidiques.

103 La membrane cytoplasmique (suite) Certaines de ces protéines jouent un rôle dans la synthèse du peptidoglycane et sont appelées protéines de liaison aux pénicillines (PLP) ou penicillin-binding-proteins (PBP) car elles sont également la cible d'action des bêtalactamines, famille d'antibiotiques à laquelle appartient la pénicilline.

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105 C- Le cytoplasme Le cytoplasme est contenu dans une membrane cytoplasmique. Le cytoplasme des cellules bactériennes est un hydrogel colloïdal comprenant une phase dispersante (sels minéraux et composés solubles de nature lipoprotéique) et une phase dispersée formée de nucléoprotéines et de lipides. Son ph est compris entre 7 et 7.2. Le cytoplasme contient des ribosomes, des acides ribonucléiques, des substances de réserves et quelques organites spécialisés.

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107 Parmi les substances de réserves, l'amidon et plus souvent le glycogène, l'acide β hydroxybutirique, des polyphosphates organiques, du soufre, du fer, etc. Les bactéries photosynthétiques possèdent des chromatophores. Ces organites jouent chez ces bactéries le rôle que jouent les chloroplastes chez les plantes vertes. Toutefois, l'ultrastructure et la nature des pigments de ces organites en sont différents.

108 Certaines bactéries (cyanobactéries, bactéries pourpres et bactéries vertes) possèdent des vacuoles à gaz. Ces bactéries sont photosynthétiques. Ces vacuoles à gaz sont utilisées par ces bactéries pour se sustenter (s alimenter) à différentes profondeurs dans les masses d'eau qu'elles fréquentent.

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110 D- L'appareil nucléaire L'appareil nucléaire bactérien n'est pas entouré d'une membrane, contrairement au noyau de la cellule eucaryote. il n'y ait qu'un chromosome. La cellule serait donc haploïde. le chromosome bactérien (E. coli) est circulaire et comprend paires de bases échelonnées le long d'une double hélice.

111 L'appareil nucléaire (suite) La molécule d'adn des bactéries est de grande taille. Déroulée, elle atteindrait plus d'un millimètre de longueur (figure 9).

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113 D- L'appareil nucléaire (suite) L'appareil nucléaire est en relation avec les invaginations de la membrane plasmique appelées mésosome. Il semble que c'est au niveau du mésosome que soient concentrées les sites enzymatiques qui permettent à l'adn d'exprimer ses différentes fonctions (ADN polymérases, ADN ligases, déroulases, gyrases, etc.)

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115 E- Les plasmides Les plasmides sont des éléments génétiques extrachromosomiques capables d'autoréplication. Les plasmides sont des petits fragments d'adn, environ cent fois moins volumineux que l'adn chromosomique.

116 Les plasmides (suite) Parmi leurs propriétés, l'une d'elle, très importante, est de conférer aux bactéries des résistances aux antibiotiques ou aux métaux lourds (sels mercuriels, de cadmium, de bismuth ou de plomb, composants fréquents des antiseptiques).

117 Les plasmides (suite) Les plasmides sont aussi responsables de la synthèse des bactériocines (colicines, vibriocines, pyocines, etc.). Ces substances de nature protéique ont un pouvoir bactéricide puissant.

118 2-3- Constituants de la cellule bactérienne Les constituants faculatifs

119 A- La capsule de nombreuses bactéries élaborent des substances organiques visqueuses qui entourent leur paroi d'une couche plus ou moins compacte. Toutes les bactéries ne produisent pas de capsule.

120 La capsule (suite) Au sein d'une espèce, certaines souches en produisent, d'autres pas. L'élaboration de la capsule est influencée par certaines conditions du milieu. Les glucides jouent un rôle important dans la présence ou non de la capsule.

121 Le rôle de la capsule La capsule joue un rôle important dans la défense des bactéries, d'abord contre la dessiccation, mais aussi contre les prédateurs (protozoaires) ou les parasites (les bactériophages sont incapables de se fixer sur une bactérie capsulée).

122 Le rôle de la capsule (suite) La capsule empêche les bactéries d'être phagocytées dans l'organisme, elle joue un rôle pathogénique. Ainsi, les pneumocoques capsulés se révèlent pathogènes, alors que les pneumocoques non capsulés ne le sont pas.

123 B- Les cils et les flagelle Les bactéries mobiles se déplacent soit par glissement (cyanobactéries), soit par rotation autour d'un axe central (spirochètes), soit au moyen de cils ou de flagelles.

124 Les cils et les flagelle (suite) Les cils et les flagelles confèrent une certaine mobilité aux bactéries qui peuvent se déplacer dans les milieux liquides ou à la surface des géloses. Certaines espèces peuvent même envahir les milieux de culture, masquant par là même les autres colonies. C'est le cas des Proteus ou des Pseudomonas.

125 La mobilité pour les bactéries n'a d'intérêt que pour se nourrir (s'approcher des substances nutritives) ou pour fuir les prédateurs ou les molécules toxiques (antibiotiques, antiseptiques, etc.). Ces comportements relèvent de chimiotactismes. Les bactéries sentent donc leur environnement grâce à des récepteurs chimiques (pariétaux ou membranaires?).

126 Les différents types d insertion Il existe quatre grands types d'insertion des cils ou des flagelles sur les bactéries : insertion polaire : monotriche, lophotriche, amphitriche et insertion péritriche (figure 10). Le point d'insertion des cils et des flagelles se situe dans le cytoplasme, au contact de la membrane plasmique.

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129 Les bactéries Gram négatif, surtout, possèdent, à leur surface, des appendices filiformes très courts, rigides et cassants. Ces pili ou fimbriae confèrent aux bactéries l adhésion (agglutination) (pili commun). Certains de ces pili, renflés, appelés pili sexuels, joueraient un rôle dans l'échange d'adn entre deux bactéries quand elles rentrent en conjugaison

130 D- Les spores bactériennes Certaines bactéries ont la propriété de former de petites unités sphériques douées d'une extraordinaire résistance. Ces unités sont appelées spores ou endospores, car elles se forment à l'intérieur de la cellule bactérienne.

131 Structure d une Spore bactérienne La spore (figure 11) est constituée par un cytoplasme de texture homogène, pauvre en ARN, en enzymes et en eau mais contenant une quantité d'adn proche de celle de la cellule végétative. La membrane cytoplasmique, analogue à celle de la cellule végétative, est entourée de la paroi sporale et du cortex.

132 Structure de la spore (suite) Le cortex, très transparent aux électrons, contient la quasi totalité d'un constituant spécifique des spores, l'acide dipicolinique sous forme de dipicolinate de calcium. Appliqué contre le cortex on trouve la ou les tuniques (appelées alors intine ou tunique interne et exine ou tunique externe) formées de protéines riches en ponts disulfures puis, éventuellement, l'exosporium.

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134 Propriétés des spores Les spores sont en effet douées d'une longévité et d'une résistance importante. La longévité est difficile à apprécier mais elle pourrait atteindre plusieurs milliers d'années pour certaines espèces de Bacillus. La thermorésistance est très variable selon les espèces et même selon les souches, selon l'âge des cultures et selon les conditions de culture. Quelques valeurs de la thermorésistance des spores sont données dans le tableau 4.

135 Espèces Clostridium tetani 5 Bacillus subtilis 5 à 10 Clostridium thermosaccharolyticum 4 à 5 Bacillus stearothermophilus 4 à 5 Desulfotomaculum nigrificans 2 à 3 Bacillus coagulans 0,1 Clostridium sporogenes 0,1 à 0,5 Clostridium botulinum A ou B 0,1 à 0,2 Bacillus anthracis 1 à 6 Temps en minutes pour détruire 90% des spores chauffées à 120 C

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137 formation et germination des spores

138 Formation de la Spore La transformation de la forme végétative en spore est la sporulation :. Temps : jusqu à 10 heures à 37 C pour Bacillus megaterium.

139 Sporulation quand? déclenchée par des modifications de l'environnement tel épuisement en matières nutritives.

140 Les étapes de la sporulation La sporulation est un processus complexe qui peut être divisé en 7 étapes suivantes:

141 Étape 1: Formation du filament axial de matériel nucléaire Étape 2: Invagination de la membrane cellulaire isolant une partie de ADN et constituant le Septum de la préspore phase 1 et 2 durent 4 h

142 Étape 3: après 5.5 h La membrane continue a se développer et entoure la spore et formation d une seconde enveloppe Étape 4 : après 6.5 h Formation du cortex et accumulation du calcium et de l acide dipocolinique

143 Étape 5: après 8 h Formation des protéines de la tunique autour du cortex. Étape 6: Maturité de la spore Étape 7: Libération de la spore duréé totale de la 10.5h

144 Germination de la spore La transformation des spores dormantes en cellule végétative (germination) est aussi complexe que la sporulation. Elle se déroule en trois étapes

145 Les étapes de la germination des spores Étape 1: Activation Cette étapes est essentielle pour la préparation de la germination. Elle peut être provoquée par un chauffage. Étape 2: Germination Gonflement de la spores, rupture de la tunique et augmentation de l activité métabolique de la spore. Étape 3: Croissance: Le protoplaste de la spore synthétise de nouveaux composé et naissance de la bactérie active

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