Les Lenti-Vecteurs, des outils pour écrire dans le génome des cellules vivantes

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1 Les Lenti-Vecteurs, des outils pour écrire dans le génome des cellules vivantes Sébastien BONI, PhD Ingénieur de Recherche Responsable technique plateforme LentiVec Bâtiment IBS-IRIS 4, rue Larrey CHU angers ANGERS Cedex 09 Tel : Fax : : boni.sebastien.pro@gmail.com Pr Guillaume Podevin. Unité de chirurgie pédiatrique, pôle FME.Responsable scientifique LentiVec, SFR ICAT 4208, IBS-IRIS, CHU, 4 rue Larrey ANGERS Secr : Port : Fax : /03/2017 Gen2Bio

2 SOMMAIRE 1. Généralités sur les lentivirus a. Classification b. Organisation & expression génomique c. Cycle viral d. La reverse transcription e. L import nucléaire f. L intégration 2. Utilisation des vecteurs lentiviraux a. Construction d un vecteur lentiviral b. Production des vecteurs lentiviraux c. Quantification des vecteurs lentiviraux d. Utilisation des vecteurs en recherche fondamentale & clinique 3. Nos prestations & services a. Bactériologie b. Biologie moléculaire c. Biologie cellulaire

3 a. Classification GÉNÉRALITÉS SUR LES LENTIVIRUS 2 catégories (exo- et endogène), 2 sous familles (orthoretrovirinae et spumaretrovirinae) et 7 genres au total Trois catégories sur le plan infectieux les oncovirus, les lentivirus et les spumavirus

4 GÉNÉRALITÉS SUR LES LENTIVIRUS b. Organisation et expression génomique

5 GÉNÉRALITÉS SUR LES LENTIVIRUS b. Organisation et expression génomique

6 GÉNÉRALITÉS SUR LES LENTIVIRUS c. Cycle viral Phases précoces Reconnaissance et fixation du récepteur virale au ligand cellulaire Fusion membranaire Décapsidation du génome et reverse transcription Transport du génome vers le noyau Intégration de l ADN viral au génome cellulaire Phases tardives Transcription du génome viral Traduction Assemblage et bourgeonnement des particules virales

7 GÉNÉRALITÉS SUR LES LENTIVIRUS d. La reverse transcription Etapes Hybridation d une amorce ARN (trna-lys) au niveau du site primaire d amorçage (PBS). - Début de la synthèse du brin (-) d ADN avec le trna-lys comme amorce, en 5 de l ARN génomique. - L ARN du complexe hybride ARN:ADN est dégradé,. - Le brin (-) d ADN néo-synthétisé est alors transféré à l extrémité 3 du brin (+) d ARN génomique et s hybride avec la région R pour continuer l élongation du brin (-) d ADN. - La synthèse de l ADN se poursuit, tandis que l activité RNase H dégrade le d ARN génomique du complexe ARN:ADN à l exception de 2 séquences spécifiques (cppt et 3 PPT). - L initiation de la synthèse du brin (+) d ADN débute en utilisant les séquences PPT comme amorces. - La séquence PBS du brin (-) d ADN est alors transférée et s hybride avec celle du brin (+) et la synthèse d ADN continue et se finit avec déplacement de brin. - Obtention d un ADN double brin linéaire bordé par 2 LTR, et contenant en son centre une structure caractéristique à 3 brins.

8 GÉNÉRALITÉS SUR LES LENTIVIRUS e. L import nucléaire Etapes Après décapsidation, la capside interagit avec les microtubules pour être acheminée au noyau Le complexe de transcription inverse (RTC) se dirige par saut rapide sur le réseau micro tubulaire vers le compartiment nucléaire. Le RTC migre des microtubules vers les filaments d actines, à proximité du compartiment nucléaire Les filaments d actine amène alors le RTC vers la membrane nucléaire Les capsides virales, contenant le génome viral, s ancrent aux complexes des pores nucléaires. L ancrage du RTC au pore nucléaire est plus rapide que la RT 1, la plupart de la synthèse de l'adn viral survient dans une capside virale intacte amarré au pore nucléaire Une fois, la reverse transcription achevée, et la formation d un brin central d ADN chevauchant, la capside virale se disloque et le complexe de reverse transcription se mature en complexe de pré-intégration (PIC). Le PIC est transporté à travers le pore nucléaire. Il correspond au génome dimérisé par 2 molécules d intégrases qui se fixent au niveau des LTR. Le PIC est transporté à travers le pore nucléaire. Le PIC subit un transport intranucléaire mal caractérisé. Il est alors soit intègré dans la chromatine hôte cellulaire ou circularisé en 1 ou 2 cercles-ltr.

9 f. L intégration GÉNÉRALITÉS SUR LES LENTIVIRUS Etapes Dimérisation de l IN. - Fixation de l IN sur l ADN proviral Coupure et élimination de di-nucléotides en 3 de l ADN proviral par l IN Fixation du complexe dimérique d IN couplé à l ADN proviral sur l ADN génomique cellulaire. - Coupure du génome cellulaire en quinconce. - Jointure des extrémités d l ADN génomique et proviral par l IN. - Elimination des mésappariements de di-nucléotides par des enzymes cellulaires. - Remplissage des lacunes par des enzymes cellulaires. - Ligation par des enzymes cellulaires. - Intégration de l ADN proviral. - Apparition de formes circulaires épisomiques à 1-LTR ou 2-LTR. Développement de vecteurs lentiviraux déficient dans l intégration

10 UTILISATION DES LENTI-VECTEURS Outils unique avec de nombreux avantages Système intégratif Longue et stable expression du transgène Système non réplicatif Infection de cellules quiescentes Non immunogène Spécificité Pseudotypage et promoteur tissus spécifique

11 UTILISATION DES LENTI-VECTEURS a. Construction des vecteurs lentiviraux Délétion des séquences virales pathogènes Conservation des séquences requises dans : - Transcription inverse - Import nucléaire - Intégration cppt PPT Insertion de séquences d intérêts : Séquences multicistronique Séquence promoteur Gènes rapporteur Séquences multidirectionnelles

12 UTILISATION DES LENTI-VECTEURS b. Production des vecteurs lentiviraux Plasmide d encapsidation Plasmide vecteur Plasmide d enveloppe Transfection au phosphate de calcium Procédure : Jour -1 : Préparation des cellules (80x10 3 cellules/cm -2 ) Jour 0 : Transfection au phosphate de calcium des cellules à l aide des 3 plasmides Jour 1 : Observation de l efficacité de transfection et changement de milieu Jour 2 : récupération du surnageant, clarification, filtration et titration Lignée 293T Concentration et/ou purification

13 UTILISATION DES LENTI-VECTEURS c. Quantification des vecteurs lentiviraux Mesure du nombre de particules physique Mesure du nombre de particules infectieuses Mesure du nombre de particules fonctionnelles Procédure : Jour -1 : Préparation des cellules (25x10 3 cellules/cm -2 ) Jour 0 : Changement du milieu et infection en dilution limite Jour 4 : Préparation des cellules selon la méthode de titration

14 UTILISATION DES LENTI-VECTEURS d. Utilisation des vecteurs en recherche fondamentale & clinique

15 a. Bactériologie NOS PRESTATIONS & SERVICES Plasmide Transformation (HS ou EP) Bactéries compétentes (JM109, TOP10, Stellar,...) Amplification et contrôle qualité du plasmide Pré-cultures (3-5 ml) & MiniP Culture ( ml) & MaxiP Forme native plasmidique fondamentale pour l efficacité de transfection 260/ /280 > 2 1,8 et 2

16 NOS PRESTATIONS & SERVICES b. Biologie moléculaire Méthodes de clonage classique remplacées par le système In-Fusion Procédure : Jour 1 : Amplification de l insert par PCR et préparation du vecteur par restriction enzymatique Jour 2 : Purification de l insert et du vecteur sur gel, réaction In-Fusion, transformation Jour 3 & 4 : Validation des clones sélectionnés Permet d augmenter la réussite de clonage de vecteurs lentiviraux complexes Au final système plus simple, rapide,, efficace et flexible (mutagénèse dirigée, clonage one step de plusieurs fragments,...)

17 RFP NOS PRESTATIONS & SERVICES c. Biologie cellulaire Différentes prestations impliquant la production & utilisation de vecteurs lentiviraux Projet NDFSU4 Objectif : Caractérisation fonctionnelle de l expression de la copie (+) du gène NFSU4 dans des fibroblastes primaire de patients File: VP35_ Sample ID: J1 Méthodologie & résultats : Gated Events: 9571 Total Events: Clonage moléculaire du gène sauvage dans un vecteur lentiviral exprimant un gène de sélection In-Fusion File: VP35_ Production d un vecteur contrôle LV-RFP-IRES-PURO et du vecteur d intérêt LV-NDFSU4-IRES- R1 PURO Evaluation de l infectivité des cellules par un vecteur lentiviral exprimant la RFP Fibroblastes humain primaires infectés par 1x10 5 TU/mL de LV-RFP-IRES-PURO R1 R1 CNRS 6214/INSERM 1083 Quad Events % Gated % Total Y Mean Y Geo Mean UL *** *** UR LL *** *** LR Sample ID: J1 Gated Events: 9537 Total Events: Quad Events % Gated % Total Y Mean Y Geo Mean 87 % UL *** *** UR LL *** *** LR File: VP35_ Sample ID: J1 Gated Events: 9319 Total Events: Quad Events % Gated % Total Y Mean Y Geo Mean UL *** *** UR LL *** *** LR Evaluation de la dose optimale de l agent de sélection FSC - LV + LV 1 µg/ml Puro 1 µg/ml Puro Production du vecteur d intérêt et livraison

18 REMERCIEMENTS