Université Joseph Fourier Département Licence Sciences & Technologie RAPPORT DE STAGE

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1 Université Joseph Fourier Département Licence Sciences & Technologie RAPPORT DE STAGE INFLUENCE DU NOMBRE DE PETITS DANS LES PORTEES SUR LE FONCTIONNEMENT MITOCHONDRIAL HEPATIQUE: ETUDE D'UN MODELE MURIN. Cabanettes Aurore Laboratoire d accueil : LBFA Directeur du laboratoire : SCHLATTNER Uwe Responsable du stage : COUTURIER Karine Licence biologie 2 ème année parcours biologie Année universitaire :

2 Remerciements Nous avons pu mener cette étude durant notre stage grâce à la formation fournie par les membres du laboratoire qui nous ont enseigné des connaissances théoriques et pratiques. Je tiens donc à remercier toutes l équipe du laboratoire, et plus précisément Karine Couturier et Cecile Batandier, nos responsables de stage qui nous ont offerts leur confiance et leur temps, ainsi que Dubouchaud Hervé, Demaison Joelle, Mourmoura Evangelia et Ounas Fayçal. 2

3 Sommaire I) Ressentis sur ce stage ) les points positifs ) les points négatifs... 4 II) Généralités sur le laboratoire... 4 III) Introduction du sujet... 5 IV) Protocole expérimental ) mise en place de l'expérience ) Préparation des mitochondries de foie ) Dosage des protéines mitochondriales ) Oxygraphie ) mesure des ROS V) Résultats ) Oxygraphie ) ROS VI) Conclusion

4 I) Ressentis sur ce stage 1) les points positifs Ce stage m'a permis d'approfondir mes connaissances en laboratoires suite à un premier stage effectué en première année de biologie. Il est intéressant d'avoir fait un deuxième stage dans un autre laboratoire, où le fonctionnement et les méthodes de travail sont vraiment différentes. Ce stage m'a permis d'acquérir d'avantage de connaissances vis à vis de la démarche expérimentale. Il s'agit donc toujours d'un dispositif que j'encourage. Les personnes qui nous encadrent durant les stages se montrent impliqués et instructives, nous accordant une grande confiance malgré notre faible niveau d'étude. 2) les points négatifs Il y a peu de points négatifs concernant ce stage. De manière générale, sur le site du dlst, peut-être serait-il utile de préciser dans la description du stage quel sera le rôle du stagiaire (en plus de la description du thème) pour faciliter le choix des étudiants. Même si je pense que ce n est pas toujours faisable selon les laboratoires. II) Généralités sur le laboratoire J'ai été accueillie par les membres du LBFA (laboratoire de biologie fondamentale et appliquée). Le Laboratoire de Bioénergétique Fondamentale et Appliquée (LBFA) est un laboratoire reconnu à la fois par le Ministère de l'education Nationale, de l'enseignement Supérieur et de la Recherche (MENESR) et l'institut National pour la Santé et la Recherche Médicale (INSERM). Il est dirigé par Uwe Schlattner. Il a été créé en 1994 et a évolué au cours des années pour aboutir à sa structuration actuelle. Les activités de recherche menées sont centrées autour de la bioénergétique ou l'étude des 4

5 mécanismes de production, de distribution et d'utilisation d'énergie, de leurs régulations, que ce soit au plan fondamental ou appliqué. Les travaux s'intéressent aux interrelations entre métabolisme énergétique et grandes fonctions cellulaires. Depuis quelques années, l'évolution des connaissances modifie les notions classiques de la régulation du métabolisme énergétique, ouvrant des perspectives nouvelles dans les domaines de la régulation de l'homéostasie cellulaire et des transferts d'énergie dans la cellule. Il ressort, entre autres, que la mitochondrie a un rôle central dans la vie des cellules qui va bien au-delà de la seule synthèse d'atp. En effet, elle aurait aussi un rôle dans la régulation des grandes fonctions cellulaires via des modifications de rendement de son fonctionnement. Le projet actuel de l'unité est organisé autour de 2 thèmes complémentaires (plus d'infos...) centrés sur ces aspects. Le LBFA a la particularité de regrouper des personnels de 4 UFR de l'université Joseph Fourier (Activités Physiques et Sportives, Biologie, Médecine et Pharmacie), de l'inserm, de l'inra et du CHU de Grenoble auxquels s'ajoutent de nombreux collaborateurs français et étrangers. Les travaux menés font appel à des techniques de biochimie, de biologie cellulaire et moléculaire, de modélisation et d'imagerie appliquées à différents modèles physiologiques d'intérêt. Ces techniques reposent également sur certains équipements mi-lourds qui sont mutualisés avec d'autres laboratoires du campus. (D après III) Introduction du sujet Intitulé : Influence du nombre de petits dans les portées sur le fonctionnement mitochondrial hépatique: étude d'un modèle murin. «Il est depuis longtemps reconnu que l environnement lors de la vie intra utérine et post natale est capital pour la santé de l individu. Le statut métabolique des individus ne semble, en effet, pas seulement déterminé par leurs gènes, leur prise alimentaire ou encore leur capacité à faire de l'exercice. Il semblerait également que des facteurs intervenant in utero et dans la période post natale pourraient avoir une influence. L'alimentation en période post natale semble être un des facteurs centraux influençant la santé du futur adulte. Or chez le rat, qui est un modèle d'étude privilégié en physiologie, la nutrition post natale assurée par l'allaitement peut énormément varier en fonction de la taille des portées. En effet dans une 5

6 portée avec 2 animaux, les petits auront un accès illimité à la nourriture alors qu'à 14 ou plus la nourriture se ferra plus rare (seulement 12 mamelles chez la rate). C'est pourquoi notre équipe a voulu s'assurer que la taille de la portée n'avait pas d'influence sur la composition corporelle des petits d'une part et d'autre part sur le fonctionnement mitochondriale hépatique.» On étudie alors le fonctionnement des mitochondries des petits en mesurant la production de ROS et la respiration mitochondriale. Pour cela on réalise une extraction de mitochondries de foie. IV) Protocole expérimental 1) mise en place de l'expérience Nous avons travaillé sur 30 ratons. Nous avons pesé régulièrement les ratons. Nous avons répartit les ratons de façon à avoir 3 groupes de mères différents : des mères avec 2 ratons, des mères avec 8 ratons et des mères avec 14 ratons. Nous avons essayé, autant que possible, de faire en sorte que le nombre de ratons en charge de chaque mère soit proche du nombre de petits qu'elle a mis au monde. Nous avons fait en sorte que les ratons soient sacrifiés à peu près au même âge. 2) Préparation des mitochondries de foie Afin de récupérer le sang et pour ne pas modifier les propriétés des mitochondries, les ratons sont sacrifiés par décapitation. Nous récupérons ensuite le sang, le foie, les deux muscles gastrocnémiens, et le tissus adipeux péritonéal (des deux côtés). On pèse chacun de ces organes et tissus. Le sang, les muscles et le tissu adipeux nous servent pour des expériences complémentaires et pour ajuster nos résultats. Préparation du foie (ce protocole est appliqué pour 2 rats sacrifiés successivement) _Après l'avoir pesé, placer le fois dans 30ml de tampon d'isolement (dans un bécher dans la glace) _couper le foie en petits morceaux et agiter pour éliminer un maximum de sang (presser avec un ciseaux). Vider le liquide dans l'évier. Remettre 30ml de tampon d'isolement. _En chambre froide (4 C) transvaser le contenu du bécher dans un potter. Broyer au Potter- 6

7 Eljevehm (vitesse 500 tours) en faisant monter et descendre le piston en téflon environ 13 fois. _Verser le contenu du potter dans un tube à centrifuger gros volume (80ml). Compléter avec du tampon jusqu'en haut du tube en rinçant le potter. _Centrifuger à 800g (rcf) pendant 10 à 4 C _Eliminer les lipides du surnageant avec un papier essuie-tout par capillarisation. _Récupérer le surnageant et éliminer le culot (contenant les noyaux et les débris cellulaires). Compléter avec du tampon pour équilibrer les tubes. _ Centrifuger à 5000g (rcf) pendant 10 à 4 C _Eliminer le surnageant en renversant les tubes. _récupérer le culot et éliminer les lipides sur la paroi des tubes avec un papier essuie-tout. _Ré-suspendre le culot avec 1ml de tampon d'isolement. La ré-suspension se fait à la pipette par projection du tampon en décollant doucement le culot et en l'homogénéisant (tout ceci en maintenant le tube dans la glace.) _Compléter avec du tampon d'isolement jusqu'à remplir le tube. _Centrifuger à 5000g (rcf) pendant 10 à 4 C _Eliminer le surnageant par renversement des tubes. _Mettre le tube à l'envers sur du papier absorbant afin d'éliminer au maximum le tampon restant. _Resuspendre dans 400µl de tampon d'isolement. Transférer la suspension dans un tube eppendorf. Rincer le tube de 80ml avec 100µl de tampon. Les transférer dans le même tube eppendorf. _garder les mitochondries dans la glace. 7

8 3) Dosage des protéines mitochondriales On réalise ensuite un dosage des protéines mitochondriales afin de connaître la concentration de nos mitochondries. Cette donnée sera utilisée lors des mesures d'oxygraphie (mesure de la respiration des mitochondries) et de production de ROS. Protocole : _Réaliser une gamme étalon à partir de BSA: dans 5 tubes eppendorfs réaliser les dilutions suivantes : Tubes-concentrations Eau (µl) BSA (µl) Blanc , , , _Réaliser la dilution des mitochondries : mettre 10 µl de mitochondries dans 990 µl d'eau. _Remplir une microplaque avec la gamme étalon et la dilution des mitochondries selon le schéma suivant (en vortexant les tubes avant chaque prise) Blanc Blanc Blanc ,25 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5 0,75 0,75 0, Dilution mito 1 Dilution mito 1 Dilution mito 1 Dilution mito 2 Dilution mito 2 Dilution mito 2 Sachant que ce protocole s'applique à 2 rats sacrifiés successivement, la «dilution mito 1» correspond au rat 1 et la «dilution mito 2» correspond au rat 2. 8

9 Mettre le couvercle sur la microplaque et incuber 30 à 37 C Lecture de la plaque : Allumer le lecteur de plaque et ouvrir le logiciel KC Junior. Ouvrir un protocole précédemment définit selon le tableau ci-dessus. Placer la plaque dans le lecteur sans le couvercle et 'read plate'. Imprimer les résultats. 4) Oxygraphie L'oxygraphie permet de mesurer la respiration mitochondriale. Pour cela nous avons mis une certaine concentration de mitochondries (calculée à partir de la concentration obtenue lors du dosage) dans une chambre à 30 C reliée à une électrode, ellemême reliée à un ordinateur. Nous avons ajouté à différents temps des substrats qui agissent au niveau de la chaîne de transport des électrons comme présenté sur le schéma ci-dessous : membrane externe Chaîne respiratoire espace intermembranaire H + H + H + H + membrane interne Roténone e - complexe I NADH + H + NAD + matrice FADH 2 FAD succinate e - Ubiquinone complexe II fumarate Antimycine A Cytochrome C cytochrome oxydase complexe III KCN H + DNP UCP Oligomycine ATP 2 H + + 1/2 O H 2 O 2 ADP + Pi ATPsynthase inhibiteurs découplant 9

10 Nous obtenons ainsi sur l'ordinateur une courbe avec différentes pentes selon les substrats ajoutés. Ces pentes traduisent la respiration mitochondriale. Protocole : On réalise d'abord le tampon que l'on mettra dans les chambres avec les mitochondries. Ce tampon est composé de 10 ml de milieu de respiration + 67 µl de BSA délipidée à 15 % + 55 µl de Pi. On suit ensuite les étapes décrites dans le tableau ci-dessous : Substrat complexe 1 Substrats complexes I et II Substrats complexe I et II + substrat lipidique à courte chaine Substrats complexe II Mesure activité cytochrome oxydase G G/M/S OC S TMPD Tampon 520 µl 520 µl 520 µl 520 µl 520 µl Mito x µl x µl x µl x µl x µl Substrat(s) Attendre 2 5 µl glutamate/ malate Attendre 2 5 µl glutamate/ malate 3 µl succinate Attendre 2 3 µl M 1 µl octanoylcarnitine Attendre 2 3 µl Succinate Attendre 2 1 µl Antimycine A 2 µl Ascorbate ADP 100 mm 5,3 µl 5,3 µl 5,3 µl 5,3 µl Oligomycine 2mg/mL 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl 10 µl TMPD/Asc 10

11 DNP 1.5 µl 1.5 µl 1.5 µl 1.5 µl 1.5 µl 5) mesure des ROS Amplex red (λ exc = 560 nm, λ em = 584 nm) Dilution H 2 O 2 1/10 3 : 10 µl H 2 O 2 30% µl H 2 O => lire à 240 nm Dilution H 2 O 2 1/10 5 : 100 µl H 2 O 2 diluée au 1/ µl H 2 O => utiliser pour l'étalonnage La méthode de mesure de la production de H 2 O 2 sur mitochondries isolées est adaptée de celle de Barja G. Kinetic measurement of mitochondrial oxygen radical production. Methods in Aging Research, Edited by Byung Pal Yu, 1999, CRC Press-p La méthode initiale utilisait l'acide homovanillique (acide 4-hydroxy-3-méthoxyphenylacétique, HVA) qui réagit avec H 2 O 2 en présence de peroxydase du raifort (HRP) pour former un dimère hautement fluorescent (λ excitation: 312 nm, λ émission: 420 nm). Cette sonde fluorescente a été remplacée par de l Amplex Red ( excitation = 560 nm, émission = 584 nm). Les mesures sont effectuées dans les mêmes conditions que celles utilisées en oxygraphie (30 C, agitation constante et même tampon de respiration (125mM KCl, 20mM Tris, 1mM EGTA). Pour une cuve de spectrophotomètre de 1.5ml, on met 1 ml de tampon de respiration supplémenté en BSA (100µl de BSA à 15% pour un volume de 15ml de tampon) auquel on ajoute les mitochondries (0,25 mg protéines /ml). On ajoute l Amplex Red (2µl d une solution à 1mM( avec juste 1µl le signal s aplati) et la peroxydase du raifort (HRP 1 µl d une solution à 4400U/ml soit une concentration finale de 6 U/ml). Les substrats sont ensuite ajoutés (comme pour la respiration), et la fluorescence est détectée à l'aide d'un fluorimètre. On enregistre la fluorescence en absence de substrats (autoxydation de la sonde) puis on 11

12 ajoute les substrats comme pour la respiration. Protocole : Le tampon pour les ROS est différent de celui de l'oxygraphie :15 ml de tampon de respiration + 100µl de BSA 15%. Suivre ensuite le protocole suivant : Tampon respiration + BSA 15% G/M G/M/S OC S Etalonnage 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl Amplex Red 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl HRP 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl Mito (250 µg) x µl x µl x µl x µl x µl Lancer la mesure Lancer la mesure Substrat(s) 10 µl G/M 10 µl G/M 5 µl S Lancer la mesure 3 µl M 1,5 µl OC Lancer la mesure Lancer la mesure 5 µl S 5 µl H 2 O 2 "1/10 5 " (voir cidessous) Rot 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl 5 µl H 2 O 2 "1/10 5 " Antimycine A 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl 12

13 V) Résultats 1) Oxygraphie Consommation d'o2 par les mitochondries hépatiques en présence de GMS (substrat glucidique) 140 * * mmolo2/min/mg de proteines GP2 GP8 GP14 0 Etat 3 Etat 4 DNP 13

14 2) ROS Nous avons ensuite réalisé des statistiques sur nos résultats afin de voir si les différences 14

15 observées entre les groupes étaient significatives ou non. VI) Conclusion Les statistiques faites sur les ROS n ont pas révélées de différences significatives. Les statistiques faites sur l oxygraphie révèle une augmentation de l oxygraphie et donc de la respiration des mitochondries dans le groupe 8 par rapport aux groupes 2 et 14. Ces résultats nous permettent seulement de dire que le nombre de petits par portée modifie le fonctionnement de la mitochondrie. Il s agit donc d un paramètre à prendre en compte dans nos manipulations. 15

16 ANNEXE GV (2010) Tampons et solutions pour Oxygraphie et ROS Rappel : 1M=PM(g) dans 1litre ou 1M=PM(mg) dans 1ml Ou m(en g)=[c](en M) x PM x V(en litre) Ex : PMtris=121,14. Pour avoir du Tris 1M, il faudra donc diluer 121,14g de Tris dans 1 litre d eau OU diluer 121,14mg dans 1 ml. Glutamate/Malate (GM), succinate, TMPD, ascorbate et ADP sont préparés dans du tampon Tris 50mM ph=7,4. Tampon Tris 50mM :(Trizma Base, Sigma #T-1503) NH 2 C(CH 2 OH) 3 Molecular Weight:121.14: Diluer 60,57mg de Tris dans 10ml H2O MQ. Ajuster le ph à 7,4 avec HCl 1N Glutamate/Malate 500mM/250mM L-Glutamic Acid sodium salt : PM : g/mol (sigma G1626) (armoire XL 2 ème étage) L-Malic Acid disodium salt : PM (sigma M9138) (armoire XL 2 ème étage) Dissoudre g de Glutamate g dans 5ml d eau MQ. Avant de compléter à 5ml, neutraliser avec KOH 10N si non dissoudre directement dans TP Tris 50mM Pour 10 ml respectivement G/M g g. Succinate 1M (Succinate disodium salt, hexahydrate, Sigma #S-2378, PM=270,1) NaOOCCH 2 CH 2 COONa 6H 2 OMolecular Weight: (armoire XL 2 ème étage) Dissoudre 2,701g de succinate dans 10ml de Tris 50mM. Aliquoter et conserver à -20 C. DL-Octanoyl-Carnitine-HCl 110 mm : (Sigma O6751) C 15 H 30 NO 4 Cl Molecular Weight: g/5ml H2O (Boite GV congel périfusion ou RF 1er étage C9) Palmitoyl-DL-carnitine chloride 20 mm powder Sigma P4509 : C23H46NO4 Cl (Boite GV congel périfusion ou RF 1er étage C9) Molecular Weight: Diluer 43.6 mg dans 5ml d eaumq. Malate 0.25 M: L-Malic Acid disodium salt : PM (sigma M9138) g dans 5ml d eau MQ ou Tris 50mM. 16

17 Avant de compléter à 5ml, neutraliser avec KOH 10N ou dissoudre dans du Tris 50mM TMPD 25mM/Ascorbate (10mM) T3134Sigma N,N,N,N -Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 95%, powder C 6 H 4 [N(CH 3 ) 2 ] 2 2HClMolecular Weight: (armoire XL 2 ème étage) Dissoudre mg de TMPD dans 5 ml d eau ou Tris 50mM Ajouter 8.8mg d ascorbate (Sigma A7506) Attention si on a de l ascorbate de sodium, ajouter 9.9 mg. (Sigma A7631). Protéger de la lumière. Ascorbate de sodium 0.5 M : A7631Sigma(+)-Sodium L-ascorbate crystalline, 98% C 6 H 7 NaO 6 Molecular Weight: Dissoudre 495.2mg dans 5 ml d eau ou de Tris 50mM mais pas obligatoire. Ou 990.1mg dans 10ml d eau. Aliquoter en 500µL et stocker à -20 C Sensible à la lumière. ADP 100mM (ADP sodium salt, Sigma #A-2754): (Frigo C7 2ème étage) A2754 Sigma Adenosine 5 -diphosphate sodium salt bacterial, 95% (HPLC) Diluer 42,72mg d ADP dans 1ml de Tp Tris 50mM. Aliquoter par 500µl puis conserver à -20 C. Ou Diluer mg d ADP dans 5 ml de TP Tris 50 mm. BSAfaf 15% : (Albumin, Fraction V fatty acid free, Roche # ) (Frigo C7 2ème étage): Diluer 1.5g de BSAfaf dans 10ml d H2O MQ. Aliquoter par 500µl puis conserver à -20 C. DNP 20mM (2,4 Dinitrophénol): Diluer 3,682mg de DNP dans 1ml de DMSO. Aliquoter puis conserver à -20 C. Oligomycine 2mg/ml : O4876 Sigma Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes ~65% oligomycin A basis (Composition given on label), 90% total oligomycins basis (HPLC) Diluer 2mg d oligo dans 1ml d EtOHabs. Aliquoter puis conserver à -20 C. Antimycine A 1mM : A8674 Sigma Antimycin A from Streptomyces sp. The product is a mixture of antimycins, each with a unique molecular weight. The approximate molecular weights (g/mole) for the components are A1: 548.6; A2: 534.6; A3: 520.6; A4: The percentages of each component are lot specific and are determined by HPLC. This information can be found on the Certificate of Analysis. We averaged the molecular weights for four lots and obtained an approximate molecular weight of 532 g/mole. Diluer 2.66 mg d AA dans 5ml d EtOHabs. Aliquoter puis conserver à -20 C. 17

18 Roténone 2mM : PM g/mol R8875 Sigma Rotenone 95% (F5 périfusion) Diluer 3.95mg de Rot dans 5ml d EtOH absolu. Aliquoter puis conserver à -20 C et protéger de la lumière. Phosphate inorganique (Pi) 1M : PM : Acide phosphorique 85% = 14.7M (d=1.695 Kg/L) ml d acide phosphorique 85 % pour qsp 200ml d eau (soit ml) Avant d ajouter la totalité de l eau ajuster le ph avec du Tris-Base en poudre (très long!). Il en faut beaucoup. HRP 5000 U/ml (Peroxidase from horseradish, 100KU, Sigma#P8250) P8250 Sigma (F5 périfusion) Peroxidase from horseradish Type II, essentially salt-free, lyophilized powder, units/mg solid (using pyrogallol) 1mg de HRP correspond environ à 200U. Pour avoir de la 5000U/ml, diluer 25mg de HRP100KU dans 1ml d H2O MQ. Aliquoter par 100µl puis conserver à -20 C. Amplex Red 1mM : Molecular Probes, Invitrogen. Amplex Red reagent Amplex Red reagent Molecular Formula: C14H11NO4 Molecular Weight: Cat. No. A12222 Stock à 20mM dans DMSO Puis 1mM dans éthanol. Flacon avec 5mg ajouter 972µL de DMSO pour avoir du 20mM Puis diluer 50µL dans 950 d éthanol abs. (Congel RF 1 er étage) 18