La communication synaptique et les approches électrophysiologiques et optogénétiques
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- Pierre-Yves Lamarche
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1 La communication synaptique et les approches électrophysiologiques et optogénétiques MASTER SCIENCES ET TECHNOLOGIE - Men2on : BIOLOGIE SANTE UE «SIGNALISATION : Méthodes et Concepts» (UMBS TC2) François Rassendren Ins.tut de Génomique Fonc.onnelle francois.rassendren@igf.cnrs.fr
2 La synapse: élément central de la communication nerveuse compar.ment spécialisé communica.on chimique entre les neurones excitatrice, inhibitrice, modulatrice zone élémentaire de l intégra.on de l informa.on
3 La synapse: éléments structuraux éléments pré- et post- synap.ques
4 Les épines dendritiques - compar.ments spécialisés des synapses - très dynamiques (plas.cité synap.que) - en moyennes 5000 par neurone - la somma.on des inputs conduit à l intégra.on des signaux entrants Dendrites axones
5 Circuits neuronaux base des comportement complexes intégra.on de différents inputs
6 et connectomes
7 De la synapse au comportement L ac.vité synap.que détermine l ac.vité électrique du neurones; Différentes ac.vité synap.que sont intégrées et traitées au niveau du neurones; les neurones fonc.onnent en réseau suivant à un câblage prédéfini; L ac.vité des réseaux contrôlent les comportements; Différentes pathologies sont associées aux disfonc.onnement de ce système; troubles psychiatriques et cogni.fs (au.sme, retard mental, schizophrénie ) troubles neurodégénéra.fs (parkinson, Alzheimer ) Nécessité d une meilleure connaissance des différents éléments de ces systèmes, de leurs modes de fonc.onnement et de régula.on. Nécessité d appréhender ces ques.ons du niveau moléculaire au niveau intégré.
8 Approches expérimentales de la synapse au comportement Approches électrophysiologiques synap.que intégrée in vivo Approches Optogéné2ques Channel rhodopsines opto- pharmacologie protéines photosensibles Développement d approches permeoant un contrôle spa2al et temporel de l ac2vité neuronale
9 Approches électrophysiologiques de la synapse Whole cell recordings enregistrement des courants (voltage clamp) ou des des varia.ons du poten.el d une cellule en.ère (current clamp) neurones en culture, tranche de cerveau
10 Voltage clamp: analyse directe de l activité synaptique mesure directe de l ac.vité des synapse: courants synap.ques miniatures lecture directe de l ac.vité de libéra.on des neurotransmezeurs (fréquence) lecture directe de la réponse post synap.que (amplitude) mesure de l ac.vité spontanée ou évoquée par une s.mula.on des afférences approches pharmacologiques, modula.on de l efficacité synap.que, plas.cité
11 ac.vité spontanée ac.vité évoquée
12 Current clamp: analyse directe de l activité neuronale
13 Enregistrements extracellulaires: field potentials enregistrement extracellulaire de l ac.vité d une popula.on de neurones Plas.cité synap.que, ac.vité des réseaux Approches pharmacologique, géné.ques
14 Avantages et inconvénients des approches ex vivo avantages: rela.ve simplicité lecture directe de l ac.vité synap.que ou neuronale approche moléculaire de la fonc.on synap.que études pharmacologiques, géné.ques Désavantages: modèles ex vivo, corréla.fs aux approches comportementales nécessité de contrôler de l excitabilité de la tranche (blocage pharmacologique) peu de spécificité spa.ale lors des s.mula.ons
15 Approches électrophysiologiques in vivo Enregistrement chez l animal éveillé en situa.on couplage entre le comportement et l ac.vité des réseaux; implanta.on chronique d électrodes dans les structures données
16 Limites des approches électrophysiologiques limites évidentes des modèles ex- vivo dans l étude des comportements intégrés Approches in vivo difficiles à mezre en œuvre; limite du contrôle de l ac.vité neuronale (uniquement excita.on) pas de contrôle spa.al de la s.mula.on (recruzement de différentes popula.ons neuronales) Nécessité de développer des approches permezant : un contrôle on/off de l ac.vité neuronal, de cibler une popula.on neuronale spécifique et ou localisée spa.alement, d agir sur les voies extra- et intacellulaires.
17 Approches optogéné2ques Techniques basées sur la photo isomérisa.on de molécules Historiquement: - molécules cagées : molécules inertes mais photosensibles qui sont transformées quasi instantanément en molécules ac.ves par photolyse. - les opsines, protéines naturellement photosensibles de par leur liaison à un chromophore (ré.nal et dérivés) présents naturellement dans les cellules. Ex: rhodopsine
18 les opsines de type I fonc2onnent comme des canaux ioniques Opsines de type I: protéines prokaryotes membranaires à 7- TM (GPCR, rhodopsine) - ac.vées par la photo- conversion du all- trans re.nal en 13- cis re.nal. - reconversion très rapide en all- trans tout en restant associé à l opsine. - la photo- isomérisa.on induit un changement de conforma.on des opsines conduisant aux transport d ions (ca.on, protons, anions).
19 les opsines de type I une famille en expansion Première ChR découverte dans les 70 s, mise en évidence d une perméabilité ionique 2002; Contrôle op.que de l excitabilité neuronal 2005; >20 ChR en 2011; Différentes perméabilités: Ca.on, Cl-, H+; Différents spectres d ac.va.on; Différentes ciné.ques ac.va.on inac.va.on; Améliora.on des propriétés biophysiques et cellulaires (trafficking, perméabilité, op.misa.on des codons )
20 Boîte à ou2ls des opsines
21 Contrôle op2que de l excitabilité neuronale Nature Neurosci. 2005, 8:1263 Expression de la ChR2 dans les neurones hippocampiques en culture. Contrôle de l excitabilité par la lumière.
22 Contrôle précis de l excitabilité et de la transmission synap2que
23 Nature 2007, 446:633 Inhibi2on de l ac2vité électrique: Halorhodopsine NpHR
24 Contrôle bidirec2onnel de l ac2vité neuronal
25 Contrôle op2que d un comportement in vivo
26 Applica2on aux études comportementales Nécessité d une expression ciblée des ChR (popula.on cellulaire précise): combinaison des systèmes cre et d approches virales Expression spécifique de ChR2 dans les neurones DA H Tsai et al. Science 2009;324:
27 Développement technologique pour délivrer la lumière in situ, in vivo. Possibilité de couplage avec des enregistrements électrophysiologiques
28 La photoactivation des neurones DA induit un comportement de préférence de place. induc.on d un préférence de place en fonc.on du profil de s.mula.on des neurones DA comportement aversifs et addic.fs Première démonstra.on que l on peut induire un comportement par photos.mula.on
29 Raffinements du système Op.misa.on géné.que de différentes opsines Développement de stratégies transgénique et virales pour un ciblage cellulaire spécifique promoteurs spécifiques Recombinases (cre, flp ) AAV pseudotypés Combinaison des différentes approches Nat Methods Jul;11(7): Targe.ng cells with single vectors using mul.ple- feature Boolean logic.
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31 Applica2ons Nombreuses et variées: Bases neurales des comportementales: Circuits des noyaux de la bases (Parkinson, mémoire aversive, ) Carte fonc.onnelle des circuits neuronaux Couplage à d autres approches fmri, s.mula.on profondes Applica.ons thérapeu.ques encore ques.onnables Optogene2c tool box hzp://web.stanford.edu/group/dlab/optogene.cs/
32 Autres approches optogéné2ques Autres protéines photosensibles: Interac.ons protéine- protéines photo- induites cryptomchrome 2 phytochrome B Light oxygen voltage Doug Tischer and Orion D. Weiner. Illumina.ng cell signaling with optogene.c tools. Nature Reviews molecular cell biology, 15, 2014
33 Optopharmacologie: Basée sur l u.lisa.on de ligands photosensibles pour ac.ver ou inhiber la fonc.on de protéines membranaires (RCPG, canaux ) La plus part du temps demande une modifica.on de la protéines d intérêt. Nécessite la caractérisa.on et la synthèse de molécules photosensibles spécifiques. Canaux potassiques, récepteurs du glutamate ionotropiques et métabotropiques, récepteurs nico.niques, récepteurs P2X Richard H Kramer et al. Optogene.c pharmacology for control of na.ve neuronal signaling proteins. Nature Neuroscience, 16, 2013
34 Massimo Scanziani & Michael Häusser. Electrophysiology in the age of light. Nature, 461, 930:939, 2009 Ofer Yizhar, Lief E. Fenno, Thomas J. Davidson, Murtaza Mogri and Karl Deisseroth. Optogene.cs in neural systems. Neuron 71, Kay M. Tye1,2 and Karl Deisseroth. Optogene.c inves.ga.on of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Rev. Neurosci, 2012, 13. Doug Tischer and Orion D. Weiner. Illumina.ng cell signaling with optogene.c tools. Nature Reviews molecular cell biology, 15, Kenji F. Tanaka et al. Expanding the Repertoire of Optogene.cally Targeted Cells with an Enhanced Gene Expression System. Cell Reports, 2, Arnaud Gau.er et al. How to control proteins with light in living systems. Nature Chem. Biol. 10, Richard H Kramer et al. Optogene.c pharmacology for control of na.ve neuronal signaling proteins. Nature Neuroscience, 16, Edward S. Boyden. A history of optogene.cs: the development of tools for controlling brain circuits with light. F1000 Biology Reports 2011, 3:11.
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