ÉCOLE POLYTECHNIQUE DÉPARTEMENT DE GÉNIE CHIMIQUE GÉNIE DU VIVANT- GCH 1520 EXAMEN PÉRIODIQUE 1

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1 DATE : 8 ars 2010 HEURE : 12h45 à 14h35 Toute docuentation perise Calculatrice approuvée par l AEP TOTAL : 20 points Notes: ÉCOLE POLYTECHNIQUE DÉPARTEMENT DE GÉNIE CHIMIQUE GÉNIE DU VIVANT- GCH 1520 EXAMEN PÉRIODIQUE 1 N oubliez pas d inclure toute explication pertinente et les unités de vos réponses. 6 pts 1. Questions à développeent Vous effectuez la culture d une souche de icroorganises (M. irealis) qui peret la production à grande échelle d une enzye particulière (EnzyeA-SH). En fait, cette souche catalyse la réaction suivante : EnzyeA + réactif EnzyeA-SH Vous devez donc ajouter dans le ilieu de culture une quantité appropriée d enzyea et de réactif avant le début de la production en réacteur. La souche de icroorganises fait partie du groupe des autotrophes photolithotrophes et est icroaérophile. Les icroorganises possèdent une paroi de chitine qui protège leur ebrane cellulaire. a. Les icroorganises sont-ils des actinoycètes ou des ycètes? Expliquez votre réponse. Rép : Il s agit de ycètes car ils possèdent une paroi de chitine. b. Donnez trois besoins spécifiques que vous devrez fournir aux icroorganises pour assurer une croissance optiale. Rép : CO2 coe source de carbone, luière coe source d énergie et de l oxygène en petites quantités. c. Vous devez d abord stériliser votre ilieu de culture. Vous optez pour l autoclave et utilisez les conditions suivantes : 121 o C, 115 psi durant 15 inutes. Vous vérifiez

2 ensuite la stérilité du ilieu et vous constatez que le ilieu n est pas stérile. Vous devez recoencer. Donnez une bonne raison qui pourrait expliquer l échec de la stérilisation. Rép : Teps de stérilisation trop court pour que tout le liquide soit à 121oC. d. S agit-il d une production par biosynthèse ou par bioconversion. Expliquez votre réponse. Rép : Bioconversion car on ajoute un substrat qui est légèreent odifié par les o. e. Une fois les enzyes produites en quantité désirée, vous voulez détruire les icroorganises dans le ilieu de culture ais conserver la qualité du produit (enzyes). On vous suggère d utiliser un agent anti-icrobien chiique : un aoniu quaternaire. Est-ce une bonne idée? Expliquez votre réponse. Rép : Non, car les agents chiiques agissent contre les protéines et notre produit qui est une enzye est une protéine. f. Vous déarrez une seconde production. Cette fois-ci, la production est arrêtée à cause de la présence de virus dans le réacteur qui détruisent les cellules. S agit-il de bactériophages? Expliquez votre réponse. Rép : non car il s agit de ycètes, cellules eucaryotes, et que les bactériophages sont des virus è bactéries donc à procaryotes. 1 pt (0,25 pt) 2. Questions à choix de réponse a. Lors de la déterination de K et V avec le odèle d Eadie-Hofstee : i. L abscisse à l origine est K. ii. La concentration du substrat représente la variable y dans le odèle linéarisé. iii. Il faut tracer 1/v en fonction de 1/[S]. iv. La pente a une valeur négative. v = V K v [ S]

3 (0,25 pt) b. Un inhibiteur réversible non copétitif : i. S attache au site actif de l enzye et l inactive. ii. Défore le site actif de l enzye, et le substrat ne peut plus s y attacher pour forer le coplexe enzye-substrat. iii. Fore une liaison covalente avec l enzye. iv. S attache au substrat et l inactive. (0,25 pt) (0,25 pt) c. Lors de la production d une protéine recobinante intracellulaire : i. Il faut lyser les bactéries gra-positives utilisées coe vecteurs pour la production de la protéine d intérêt car celles-ci ci n excrètent pas la protéine hors de la cellule. ii. Les ribosoes recobinants contiennent le code génétique de la protéine d intérêt. iii. Il faut conserver les cellules et se débarrasser du ilieu de culture avant de purifier la protéine d intérêt. iv. On utilise généraleent des cellules procaryotes coe les levures pour produire une protéine recobinante. d. Dans un cheostat : i. Le débit d alientation est plus élevé que le débit de sortie. ii. Le bioréacteur ne contient aucune cellule au départ. iii. Il y a accuulation de cellule dans le teps en régie peranent. iv. La vitesse de croissance des cellules dépend du débit d alientation. Réponse : a) iv b) ii c) iii d) iv 5 pts 3. Vitesse de réaction Vous calculez la vitesse de votre réaction enzyatique en fonction de la concentration de substrat pour deux tepératures et en présence ou en absence d inhibiteur. Vous obtenez alors les paraètres suivants :

4 Tableau 3.1: Paraètres obtenus lors du suivi de la reaction enzyatique [inhibiteur] T [substrat] v g/l C g/l g/l/in , , , , , , , ,500 0, ,100 0, ,167 0, ,222 0, ,250 (2 pts) a. En utilisant le odèle de Lineweaver-Burk, déterinez graphiqueent les constantes cinétiques K et V de la réaction enzyatique sans inhibiteur pour chacune des deux tepératures. Selon vos résultats, quelle tepérature favorise la réaction? K = + v V S V [ ] 1/v (in*l/g) L-B sans inhibiteur pour deux tepératures y = 8,2821x + 5,9692 R² = 0,9781 y = 13,487x + 1,259 R² = 0, C 32 C 0 0,2 0,4 0,6 1/[S] (L/g) 32 C 37 C 8, ,48718

5 b 5, , V 0, , K 1, ,71283 V en g/(l*in) et K en g/l. Réaction enzyatique favorisée à 37 C (2 pts) b. En analysant les données à 37 C, déterinez de quel type d inhibition réversible il s agit. Lineweaver-Burk à 37 C 12 1/v (L*in/g) y = 13,487x + 3,259 R² = 0,9992 y = 13,487x + 1,259 R² = 0,9992 sans inh avec inh Linear (sans inh) Linear (avec inh) 0 0,2 0,4 0,6 1/[S] (L/g) 37 C 37 C Sans inh Avec inh 13, ,48718 b 1, , V 0, , K 10, , Mêe pente donc anti-copétitive c. Quelle est la valeur de la constante d inhibition K i? K i [ I ] [ I ] = = V K 1 1 V app K app K i = 0,05/( (0,79/0,31) 1) =0,031 g/l 5 pts 4. Production de levure de boulangerie

6 Vous travaillez pour une entreprise qui fabrique de la levure de boulangerie en bioréacteur discontinu. Votre eployeur vous deande d analyser les résultats de la page suivante évalués à deux tepératures. Le substrat utilisé pour faire croître les levures est le glucose. Tableau 4.1: Suivi du glucose dans le teps pour deux tepératures Tepérature 20 C 40 C Teps [Glucose] [Glucose] h g/l g/l ln [X] où [X] est en g/l Teps (h) T=40 C T=20 C Figure 1: Graphique de la croissance cellulaire en fonction du teps (1,5 pt) a. Quelle est le taux de croissance axiale µ pour chacune de ces tepératures?

7 Puisque ln [X]/[X ] = µ t donc µ = 0 ln[ X ] ln[ X ] u est donc la pente calculée à partir de points en phase exponentielle u à 20 C = (3-2)/(10-6)= 0,25 h -1 u à 40 C = (5-3)/(10-6)= 0,50 h -1 t t (1,5 pt) b. À quelle tepérature obtient-on le eilleur rendeent bioasse-substrat Y X/S après 14h d incubation? Y =- X/S X X X = S S S 14h 0h 0h 14h Y X/S à 20 C = (e 3,5 -e 1 )/(50-0)= 0,61 g levures/g glucose (g cellules/g substrat) Y X/S à 40 C = (e 6 -e 2,5 )/(1000-0)= 0,39 g levures/g glucose (g cellules/g substrat) Tepérature pour laquelle on obtient un eilleur rendeent : 20 C (2 pts) c. Quelle serait le taux de croissance axial si vous odifiiez la tepérature du bioprocédé à 30 C sans changer les autres conditions expérientales? Soit résolu avec 2 équations pour 2 inconnus avec une ou l autre des équations cidessous : Ea Ea 1 µ = Aexp ou ln µ ln A RT = + R T Où R=8,314 J/(ol*K) ou 1,987 cal/(ol*k) 1/T (en K) lnu T=40 C 0, ,69315 T=20 C 0, ,38629

8 0 Arrhénius -0,2 0, ,0032 0, ,0033 0, ,0034 0, ,4-0,6-0,8-1 Arrhénius Linear (Arrhénius) -1,2-1,4-1,6 y = -3178,4x + 9,4615 R² = 1 Du graphique : -3178,39 b 9, Ea=*R= 26425,15 J/ol ou 6321,77cal/ol A=exp(b)= 12854,63 h -1 Si T= 30 C u 0, h -1 3 pts 5. Production de pénicilline en bioréacteur Vous produisez de la pénicilline dans un bioréacteur continu de type cheostat avec le chapignon P. chrysogenu et un ilieu de culture contenant de l aidon. Vous alientez votre cheostat de 240L à différents débits et vous suivez la concentration du substrat à la sortie du réacteur et le taux de croissance cellulaire associé.

9 Tableau 5.1: Concentration de substrat et taux de croissance associés au débit d alientation F [S] µ L/h g/l h , , , , , ,00 (1,5 pt) a) Quelle est la concentration de substrat pour laquelle µ équivaut à la oitié du taux de croissance axial? Sachant qu en cheostat µ=d=f/v µ ax[ S] 1 Ks 1 1 µ = D = = + K + [ S ] D µ [ S ] µ s ax ax 1/S 1/u L/g h 0,2 10 0,1 8 0,05 7,06 0,025 6,67 1/D = 1/u (h) Monod linéarisé sachant que u=d y = 19,219x + 6,1296 R² = 0, ,05 0,1 0,15 0,2 0,25 I/[S] L/g Du graphique : 19,2191

10 b 6, u ax 0, h -1 K s 3, g/l (1,5 pt) b) Pourquoi le taux de croissance est nul à 40L/h et 50L/h? Justifiez votre réponse par les calculs appropriés. Si on transfore les F en D, on voit que D = 0,167h -1 > µ ax = 0,163h -1 pour F=40 L/h et F=50L/h F D u L/h h-1 h ,100 0, ,125 0, ,142 0, ,150 0, ,167 0, ,208 0,00 On est donc en lessivage : le ilieu frais circule trop rapideent et les cellules n ont pas le teps de croître et sont entraînées hors du cheostat.