Méthodes d'étude des pectines

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1 Méthodes d'étude des pectines C. Renard UMR SQPV, Avignon Fév 2010

2 Plan Les pectines: définition et structure Méthodes d'étude des pectines Rappels Dosages des constituants Le fractionnement et les techniques lourdes Les pectines en tant qu'additifs: sources, méthodes d'extraction, propriétés et réactivité Les enzymes pectolytiques Les pectines in situ: biosynthèse, rôles dans les parois et dans la transformation des fruits et légumes Quelques exemples de nos travaux

3 Structure des différents oses ose Polyalcool portant une fonction réductrice (aldéhydique ou cétonique) HC= HC-H HC-H aldose H HC-H HC= HC-H cétose Dérivé du glyceraldéhyde (D ou L): oses de la série D ou L. D L

4 Construction de la série des aldoses

5 Cyclisations Les plus courants: cinq ou six carbones => pentoses ou hexose Possibilité de cyclisation => furanose ou pyranose selon taille du cycle H 2 C-H HC= H-CH HC-H HC-H CH 2 H Cétose Fischer HC= HC-H H-CH HC-H HC-H CH 2 H Aldose CH 2 H 6 5 C H H H C 4 1 C H H H H C C 3 2 H H Haworth β α Carbone anomérique

6 La structure dans l espace

7 Dérisés des sucres dans les pectines Acides: acides uroniques : fonction carboxylique en C6 Acide D-galacturonique Acide D-glucuronique Déoxy: déoxyhexose (méthylpentose): CH 3 en C1 L-rhamnose 6-déoxy-L-mannose L-fucose 6-déoxy-L-galactose

8 La liaison glycosidique Liaison glycosidique: entre la fonction hémiacétal d'un ose et un alcool d'un autre; plus rarement entre deux fonctions hémiacétal. 6 5 Les plus courantes: Possibilité de ramification En général une extrémité réductrice (hémiacétal libre)

9 Stratégie d analyse des pectines La logique: Des renseignements les plus globaux aux plus détaillées Des méthodes les plus simples aux plus couteuses Les points clés: Détermination de la composition Méthodes de fractionnement et d'étude de la distribution intermoléculaire Dégradations controlées Méthodes physiques: RMN, Masse, IR

10 Dosage de l acide galacturonique Le plus classique: titrimétrie Standardisation Teneur en GalA et estérification (mais acétyls?) CMe CH Pectine NaH V 1 NaH V 2 NaH HCl DM = V 2 /(V 1 +V 2 ) GalA = C NaH (V 1 +V 2 ) Les précautions indispensables NaH fraichement dosé Eau bouillie (carbonatation) Correction acide: V

11 Dosage de l acide galacturonique Colorimétrie: le plus adapté aux échantillons nombreux Mais acide En milieu acide concentré et à chaud: formation de dérivés furfuriques, différents chromophores (polycycliques aromatiques) globales ou spécifiques (méthode de Dubois phénol sulfurique) Méthode au mhdp Méthode au carbazole

12 Dosage au mdhp Pectine ou GalA en solution 3 tubes par échantillon (1 blanc, 2 dosages) Ajout acide sulfurique concentré de manière répétable Déshydratation Chauffage en présence d acide sulfurique concentré (1 / 6) Circa 5 min 100 C Echantillons, blancs et standards Refroidissement Ajout chromophore: 100 µl Mhdp 0,8 g/l dans NaH 0,125 M (5g/L) (blanc: NaH) Homogénéiser H 15 min à température ambiante Lecture 520 nm

13 Quelques pièges et astuces Ajout tétraborate de sodium: Na 2 B 4 8 Égalise la réaction des différents acides uroniques Faire par bouteille entière (dissolution: 1 nuit, garder au froid) Attention à l hydratation de l acide sulfurique Ajout Température et durée de la déshydratation Stabilité des solutions Garder le mhdp à 4 C et abri de la lumière

14 Dosage du méthanol Dosage spécifique après saponification Saponification: NaH 0,1 M, 4 C, 2h MeH et AcH par HPLC MeH par méthodes colorimétriques (enzymatiques) xydation en méthanal: alcooloxydase, permanganate Complexation avec MeH par CPG Très faibles températures MeH par GC-MS Standard interne: deutériométhanol Saponification et head-space (Renard & Ginies, 2009) Infra-rouge

15 Infra-rouge DM mais aussi amidation Déconvolution nécessaire Calibration DM Guillotin et al. 2007

16 Dosage des sucres Deux étapes: Passage du polymère aux monomères Identification et dosage des monomères L étape la plus cruciale est celle de la libération des sucres Hydrolyse ou solvolyse hydrolyse acide (H 2 S 4, TFA) méthanolyse (HCl dans MeH) enzymes Problème: les liaisons glycosidiques ont des résistances à l'hydrolyse/solvolyse TRES variables; difficulté d'avoir une hydrolyse enzymatique totale. AUA-AUA >> N-AUA > AUA-N >> Hex-Hex > Pent-Pent...

17 Hydrolyse CH 2 H H H CH 2 H H 3 2 H 1 CH 2 H H H H + (hydrolyse acide) H 4 6 CH 2 H 5 H 3 2 H 1 H Polysaccharide Mélange d oses libres Hydrolyse Acide sulfurique prétraitement par H 2 S 4 13 M pour "dissoudre" la cellulose hydrolyse par H 2 S 4 1M Acide trifluoroacétique 2M 120 C Risque de dégradation Xyl, AUAs

18 Exemples de cinétique d hydrolyse Glucose en fonction du temps de préhydrolyse (MIA carotte) % de la teneur maximale mesurée Durée de préhydrolyse (min) ses pectiques en fonction du temps d'hydrolyse (paroi de betterave) % de la teneur maximale mesurée Ara Gal Rha Durée d'hydrolyse (h)

19 Méthanolyse Méthanolyse: Rupture des liaisons glycosidiques et formation de méthylglycosides (HCl; anhydre) Non quantitative pour les polygalacturonates CH 2 H H H CH 2 H H 3 2 H 1 CH 2 H H H Polysaccharide H + (MeH) H 6 CH 2 H 5 4 H H CH 3 Mélange de méthylglycosides libres

20 Détection et quantification Directe par HPLC: HPAEC: fractionnement par échange d'ions en ph fortement basique. détection en ampérométrie pulsée. TRES sensible (<0.1 mg/l) mais problème de stabilité des réponses. Plus adapté aux oligomères Après méthanolyse: HPLC phase inverse Détection: indice de réfraction Mais: très nombreux pics. Après hydrolyse par échange d'ion (Aminex HPX-87 : Détection: indice de réfraction Mais: mauvaise séparation.

21 Détection et quantification CPG après dérivatisation: But: rendre les oses volatils Siloxanes (greffés), FID Méthodes: Acétates d'alditols: simple et robuste mais seulement oses neutres; après hydrolyse. Dérivés triméthylsilylés: plus versatile mais nombreux pics / ose (4-6); après méthanolyse. Dérivés méthylés: analyse des liaisons Calculs: standard interne (inositol)

22 Acétates d alditols H 4 6 CH 2 H 5 H H Mélange d oses libres H NaBH 4 en milieu alcalin CH 2 H CHH CHH CHH CHH CH 2 H Anhydride acétique (N-méthylimidazole) CH 2 Ac CHAc CHAc CHAc CHAc CH 2 Ac Alditol Acétate d alditol Rhamnose Fucose Arabinose Xylose Mannose Galactose Inositol Glucose

23 Triméthylsylilés après méthanolyse mvolts c:\star\data\std_1.run Rha Xyl (Ara) Ara Ara * * Fuc Fuc Xyl * H * GlcUA GalUA 4 * * * Man * 6 CH 2 H 5 3 H * Gal * GalUA Gal * Glc * Glc * * * 2 H Mannitol * CH 3 Hexaméthyldisilane + triméthylchlorosilane pyridine Minutes CH 2 TMS 5 TMS 4 TMS 1 CH TMS (Kits commerciaux)

24 Les séquences correctes Paroi (avec cellulose) Préhydrolyse + hydrolyse: oses neutres et GalA (Hydrolyse: oses neutres par différence estimation cellulose) Saponification: méthanol Pectines extraites Saponification: mméthanol et GalA Hydrolyse: oses neutres

25 Identification des liaisons glycosidiques: la réaction de perméthylation 6 CH 2 H 5 H H Polysaccharide 1 1- Méthylation CH 2 CH 3 CH 3 CH 3 Polysaccharide perméthylé 2- Hydrolyse CH 2 CH CHDAc CHCH CHDH CHCH 3 H CH 3 H CHCH 3 CHAc CHAc 4- Acétylation CHCH 3 CHH CHH 3- Réduction (deutérium) CH 3 ses partiellement méthylés 6 CH 2 CH 3 Acétates d alditols partiellement méthylés 6 CH 2 CH 3 D-alditols partiellement méthylés

26 Perméthylation Méthylation: en milieu anhydre (DMS) dissolution dans DMS anhydre présence d'anion methylsulfinylméthanide (dimsyl) généré par KH, NaH, n-butyllithium, NaH solide purification: dialyse, échange de phase, LH-20 (chloroformeméthanol) Hydrolyse: à peu près idem polysaccharide initial; TFA. Réduction: deutéro-réduction: marque les C-1 (NaBD 4 dans NH 4 H, 3h). Acétylation: anhydride acétique N-méthylimidazole, T...

27 Quelques cas particuliers Polysaccharides acides: réduire les fonctions carboxyliques: NaBH 4 (NaBD 4 ), ph 7, carbodiimide LiAlH 4 en milieu organique (éther) ligomères: éviter la dégradation des oses réducteurs ("peeling"): préréduction (NaBH 4 )

28 Identification des oses partiellement méthylés CPG: deux colonnes pour résoudre les pics superposés, de polarités différentes (V1 (diméthylsiloxane), V225 (cyanoalkylphénylsiloxanes)) Standard interne (Inositol) mais utilisation de facteurs de réponse calculés. Identification par spectrométrie de masse (impact électronique) rupture préférentielle entre deux méthylés. perte de CH 3 C +. fragmentation secondaire: sur le C en β: perte de méthanol (-42) ou d'acide acétique (-60).

29 Schéma de fractionnement

30 Exemples de spectres 1,2,5,6-tetra--acetyl-(2-deuterio)- 3,4-di--methyl hexitol 1,4,5-tri--acetyl-(1-deuterio)- 2,3,6-tri--methyl hexitol

31 Méthodes de fractionnement Précipitations sélectives Ethanol Pectines très facilement précipitées: oligomères (% EtH, T ) Arabinanes Cuivre (puis lavage acide) Chromatographies: échange d'ions: fractionnement en fonction de la densité de charges Contre-ion NH 4+ pour un rendement élevé exclusion stérique Dégradations sélectives: enzymes hydrolyse acide controlée

32 Chromatographie d échanges d ions Séparation en fonction de la densité de charge DEAE (faible), QAE (fort oligomères) polysaccharides chargés / neutres pectines: en fonction DM et distribution Na + - Cl Na Cl Na + + Cl - - Cl Cl - - Cl - Na + - Liaison (faible teneur en sels) Désorption (forte teneur en sels) - Na + -

33 Quelques exemples de fractionnements en échange d ions Suivi de déméthylation des pectines PME pomme à ph 7,0 PME A.niger à ph 4,5 Réponse colorimétrique DM Tampon acétate (M) Réponse colorimétrique DM Tampon acétate (M) Volume d'élution (ml) monochaîne Volume d'élution (ml) multichaîne

34 DEAE préparative Exemple du safou (Ella-Missang) Absorbance (arbitrary unit) A B C D E Sodium acetate buffer molarity Elution volume (ml) Monosaccharide composition (mol%) DM DA Fractions Gal.A Rha Fuc Ara Xyl Man Gal Glc Gal.A/Rha (%) (%) A B C D E

35 Utilisation conjointe des échanges d ions et exclusion stérique BP Echange d'ion sur BioRad AG 1X8 (après dialyse) Pulpe de betterave Rha: 25 mg/g Concentration (mg/l) 800 Conductivité (ms) Soluble Rha 6 mol% GalA 13 mol% Ara 65 mol% Gal 13 mol% Volume d'élution (ml) Fractions retenues: AUA, Rha

36 Purification et caractérisation Concentration (mg/l) Rha/GalA: 1/ ,0 0,5 1,0 K av

37 Chromatographie d exclusion stérique Principe Diffusion dans un gel poreux (K av ) Distribution des volumes hydrodynamiques Courbes de calibration le rayon hydrodynamique R H peut être décrit comme la partie de la molécule qui ne permet pas la libre circulation du solvant. Théorique 10 6 Mw K av = 0 Exclusion totale 10 3 K av = 1 V 0 V t V e K av = V e -V 0 /V t -V 0

38 SEC pour les pectines Il faut écranter les charges NaN3 0,1M, acétate Na 0,4M ph 3 Calibration Le volume hydrodynamique des PS est > protéines pour même masse molaire Le volume hydrodynamique des pectines est > pullulanes et dextranes HPSEC-MALLS Utilisation en suivi de dégradation

39 Exemples Ion-exchange Size-exclusion 24h-CW 7h-CW 1h-CW 24h-CW 0.5 Buffer molarity Elution time (min) K av values Colorimetric response (mv) Colorimetric response (mv) 7h-CW 1h-CW

40 Xylogalacturonane de pois NaH HCl + RGase ph 7

41 Electrophorèse capillaire Distribution intermoléculaire des groupements carboxyles libres Position et forme des pics Influence DP

42 Interprétation des courbes d EC Densité de charge Mobilité électrophorétique Fraction de carboxyles libres

43 RMN Enchaînement des sucres ligosaccharides Distribution des groupements méthyles RMN du proton ou du 13C RMN du proton: les H4, H1 et H5 ont des signaux qui shiftent selon l état de substitution du GalA et de ses voisins Calcul de la distribution intra moléculaire 80 C, D 2, pectines ou homogalacturonanes neutralisés (ph 6) puis deux échanges D 2

44 Signaux caractéristiques GalA H-1 H-4 Int Rhamnogalacturonane r.e. (α/β) 5,28/4,55 4,38/4,32 n.r.e. 5,00 4,29 Lié au Rha en r.e. (α/β) 5,08/5,16 4,41 U-n.r.e. 5,13 5,81 Rha H-1 H-4 Int r.e. (α/β) 5,22/4, /3.33 n.r.e. 5, Homogalacturonane H-4 Acide 4.45 Estérifié 4.50 H-1 Aa 5.10 Ae 5.15 Ea 4.92 Ee 4.98 Dénes et al., 2000

45 Interprétation du spectre RMN 1 H D CR H-4 D CR D H-5 CR D H-1 D ppm EEE EEG GEE GEG GE GG 5.25 EE EG EGE GGE EGG GGG 4.75 E G 4.25 Spectres RMN 1 H : monades (H4), dyades (H1), triades (H5)

46 Méthodes de spectrométrie de masse Suivi de dégradations enzymatiques Nombre GalA, nombre Me MSn: identification d enchaînements

47 Principe de fractionnement en MSn Extrémité réductrice: 18 A: C et B: fragments contenant l extrémité non réductrice Y et Z: fragments contenant l extrémité réductrice B: rupture du cycle glycosidiques

48 Conclusion Etude de la structure des pectines: Extraction Fractionnement: échange d ions, (SEC) Fractions purifiées: Analyse des liaisons Dégradations enzymatiques Purification des oligomères: établissement des séquences RMN MS: FAB, ESI-MS (HPAEC-MSn)