Rapport d activité APPEL D OFFRES Tests fonctionnels recombinants de l'hémagglutinine des virus Influenza H5N1.

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1 Tests fonctionnels recombinants de l'hémagglutinine des virus Influenza H5N1 circulant en Asie Contexte de la recherche Les virus influenza sont à l origine d épidémies saisonnières et de pandémies plus globales. Ces dernières posent bien évidemment un problème de santé publique, comme l illustre l introduction récente du virus A-H1N1 d origine porcine. Les pandémies sont initiées par l introduction d un virus, issu directement de la population humaine ou provenant d un intermédiaire porcin ou aviaire, dans la population humaine qui s avère dépourvue d immunité face à ce nouveau virus. Sur la base de l antigénicité des protéines h émagglutinine (HA) et neuraminidase (NA), on distingue 16 sous-types HA (H1 H16) et 9 sous-types NA (N1-N9). La protéine hémagglutinine (HA) est essentielle à la liasion avec le récepteur acide sialique et à la fusion membranaire, alors que l activité sialidase de la protéine NA est connue pour favoriser le relargage des virions et la dissémination néoformés en clivant les interactions entre la protéines HA et les acides sialiques à la surface des cellules productrices. Objectif L objectif de notre projet était de développer des outils virologiques permettant des analyses rapides et fiables des propriétés phénotypiques des glycoprotéines de surface des virus influenza, l hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA). Ils permettront de multiples études fonctionnelles sur les protéines HA et NA incluant la fusogénicité et la virulence, le tropisme cellulaire d'hôte et d'espèce, la susceptibilité à la neutralisation par les anticorps et la susceptibilité à des inhibiteurs spécifiques. Les deux tests développés sont : 1. Un test de fusion cellulaire dans lequel les cellules exprimant la protéine HA seront cocultivées avec des cellules cibles portant un système indicateur sensible et quantitatif. 2. Un test d'infectivité utilisant des pseudotypes dans lesquels la protéine HA est incorporée dans un vecteur dérivé de VIH portant un gène indicateur de l'infectivité, qui est très sensible. Principaux avantages et caractère innovant des tests proposés : Le(s) gène(s) codant les glycoprotéines d'influenza, HA et/ou NA, sont directement amplifié(s) par PCR à partir des échantillons de patients. Par conséquent, ces essais ne nécessitent pas l'isolement ni l'amplification du virus influenza en culture. 1

2 Le vecteur VIH pseudotypé est dépourvu du gène codant ses propres glycoprotéines d'enveloppe et ne peut donc pas se propager. Il n'est utilisable que dans des tests basés sur un cycle unique de réplication. Les systèmes rapporteurs des tests de fusion cellulaire et d'infectivité ont été optimisés pour leur sensibilité et permettre de tester des glycoprotéines d'enveloppe faiblement fonctionnelles. Contrairement aux tests in vitro (test de liaison de HA aux glyconjugués ou tests enzymatiques de l activité sialidase de NA), dans lesquels les propriéts de HA et de NA sont évalués séparemment, nos tests phénotypiques offrent l avantage d étudier l impact phénotypique de la co-expression des protéines HA et NA, qu elles soient issues d un même virus parental ou de deux virus différents, et donc leur équilibre fonctionnel. Résultats Nous avons dévellopé chaucun de ces deux tests. Les différentes étapes du test de fusion cellulaire se résument comme suit (Figure 1) : Des cellules adhérentes (HeLa) sont transfectées avec un vecteur d'expression des glycoprotéines HA d'intérêt et de la protéine transactivatrice du VIH-1, Tat. Les cellules transfectées sont cocultivées avec un nombre équivalent de cellules cibles (MDCK, par exemple) qui expriment les récepteurs des virus influenza appropriés et, qui après modification, portent un système rapporteur dans lequel le gène codant la β- galactosidase d'escherichia Coli est sous le contrôle transcriptionnel du promoteur "long terminal repeat" de VIH-1 (LTR). Le clivage du précurseur polyprotéique HA0 en ses deux sous-unités matures HA1 et HA2 consituent un prérequis au déroulement de la fusion membranaire. Pour se faire, la coculture requiert en traitement avec de la trypsine traitée TPCK lorsque le précurseur polyprotéique HA0 est doté d un site de clivage monobasique. En revanche, lorsque HA0 porte un site de clivage multibasique, comme cela est le cas pour les virus hautement pathogènes de soustypes H5 et H7, la coculture ne requiert pas ce traitement, puisque le précurseur est clivé intracellulairement, ce que nous avons validé. La coculture des deux types cellulaires mettant en jeu les glycoprotéines d'enveloppe de virus qui fusionnent dans les endosomes requiert un traitement transitoire à ph acide, qui permet l'induction de la fusion membranaire et la formation de syncytia Après que la fusion induite par la protéine HA a eu lieu, le mélange des cytoplasmes permet la transactivation du LTR de VIH-1 par la protéine Tat, et donc la synthèse de β- galactosidase. 2

3 La détection de l'activité β-galactosidase se réalise après lyse de la coculture cellullaire, et incubation de celle-ci avec un substrat chromogène de la β-galactosidase (CPRG) qui permet la quantification de la fusion cellulaire par mesure d'absorbance. Les différentes étapes du test d infectivité se résument comme suit (Figure 2) : Le test d'infectivité repose sur l utilisation de particules VIH-1 pseudotypées avec les glycoprotéines HA et/ou NA sont incorporées dans des pseudo-particules VIH-1 et portant un gène rapporteur indicateur de l'infectivité. Des cellules adhérentes (293-T) sont co-transfectées avec un clone moléculaire proviral VIH-1 délété de son gène codant les glycoprotéines d'enveloppe (env) et dans lequel le gène nef est remplacé par celui codant la luciférase de Renilla, avec un vecteur d'expression de HA et avec éventuellement un vecteur d'expression de NA. Les surnageants viraux sont normalisés par quantification de l'antigène de capside de VIH-1, p24, et sont utilisés pour infecter des cellules cibles réparties en plaques de microtitration. Les cellules infectées sont lysées 48 heures après l'infection. Les lysats sont alors testés pour leur activité luciférase après addition d'un substrat spécifique, qui est mesurée à l'aide d'un luminomètre (Lumat LB, Berthold) disponible au laboratoire. Les pseudotypes qui portent leur propre gène rapporteur permettent d utiliser un large panel de cellules cibles (lignées ou cellules primaires). La nature et la quantité des récepteurs cellulaires, qui sont des acides sialiques conjugués selon une liaison α2,6 ou α2,3 à un résidu galactose (SAα2,6Gal ou SAα2,3Gal, respectivement est suivie, à l aide d un test ELISA développé dans notre laboratoire, sur la base de leur réactivité à des lectines couplées à des fluorochrome, Sambucus nigra (SNA) et Maackia amurensis (MAA), respectivement. D autre part, le niveau d expression de la protéine HA, tant à la surface des cellules effectrices/productrices que des virions peut être aisément quantifiée par western-blot ou avec des tests immunologiques utilisant des anticorps anti-ha. En revanche, la relativement faible immuogénicité de la protéine NA requiert l utilisation d un test enzymatique (MUNANA), également développé dans le laboratoire, qui permet une quantification indirecte du niveau d expression de NA à la surface des cellules ou des virions. 3

4 Publications Deux manuscrits portant sur cette thématiques sont soumis. Enhancement of the influenza A hemagglutinin (HA)-mediated cell-cell fusion and virus entry by the viral neuraminidase (NA) Bin Su 1, Sébastien Wurtzer 1, Marie-Anne Rameix-Welti 2, Dominic Dwyer 3, Nadia Naffakh 2, Sylvie van der Werf 2, François Clavel 1, and Béatrice Labrosse 1, * 1: Inserm U941, Génétique et Ecologie des Virus, Institut Universitaire d Hématologie, Hôpital Saint-Louis, Université Paris Diderot-Paris 7, Paris, France 2: Institut Pasteur, Unité de Génétique Moléculaire des Virus à ARN, CNRS URA 3015, Université Paris Diderot-Paris 7, rue du Dr Roux Paris cedex 15, France 3: Centre for Infectious Diseases and Microbiology, ICPMR Westmead Hospital, University of Sydney, Westmead 2145, NSW, Australia. Dans ce travail mené par Bin Su, étudiant en deuxième année de thèse sous ma direction, nous avons validé le test phénotypique de fusion cellule-cellule, en évaluant en particulier la nécessité de traiter ou non la coculture avec de la trypsine selon qu elle impliquait une H1 issue d un virus humain (HA0 monobasique) ou bien une H7 issue d un virus aviaire hautement pathogène (HA0 multibasique). 4

5 Nous avons principalement établi avec les deux tests phénotypiques développés que la protéine NA n agissait pas seulement à un stade tardif de la réplication virale, mais était capable d influer via sona ctivité sialidaes sur la capacité et l eficacité de la protéine HA à induire la fusion membranaire ou l entrée virale. Reverse genetics provides direct evidence for a correlation between neuraminidase stalk length and virulence of a waterfowl influenza A virus in chickens. Munier S. 1, Larcher T. 3, Cormier-Aline F. 2, Soubieux D. 2, Su B. 4, Guigand L. 3, Labrosse B. 4, Cherel Y. 3, Quere P. 2, Marc D. 2, Naffakh N. 1* 1 Institut Pasteur, Unité de Génétique Moléculaire des Virus à ARN, CNRS URA 3015, Université Paris Diderot-Paris 7, rue du Dr Roux Paris cedex 15, France 2 INRA UR1282, Infectiologie Animale et Santé Publique, IASP, Nouzilly, France 3 INRA UMR 703, APEX, Ecole Nationale Vétérinaire, B.P , Nantes, France 4 INSERM U941, Unité de Génétique et Ecologie des Virus, IUH, Hôpital Saint-Louis, 1 rue Claude Vellefaux, Paris Cedex 10, France Nous avons collaboré à ce travail qui visait à établir si la délétion survenant dans la tige de la protéine NA, et qui est fréquemment associée à un phénotype de haute pathogénicité des virus aviaires. Elle s établit lors de la transmission d un virus aviaire faiblement pathogène issue d oiseaux aquatiques sauvages aux volailles. Pour se faire les phénotypes multiplication virale, de pathogénicité et virulence de deux virus H1N1 de canard, se distinguant par la présence ou non d une délétion dans la tige de la protéine NA ont été testées in vitro et in vivo dans un modèle de poulet. Notre test d nfectivité basé sur l utilisation de pseudoparticules VIH a mis en évidence que les deux types de virus étaient produits avec la même efficacité des cellules embryonnaires de canard DF1, suggérant que la délétion dans la tige de la protéine NA n altère pas le relargage des virions néoformés. D autres investigations sont en cours dans notre laboratoire afin d évaluer l éventuel impact de cette délétion sur les étapes précoces du cycle réplicatif. 5