Stratégie développée par le virus de la rage pour échapper au système INF I

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1 BMC 403- artiel du Sujet de Microbiologie (1heure) Répondre aux différentes questions dans les cadres destinés à cet effet Stratégie développée par le virus de la rage pour échapper au système INF I (D après une étude de Brzozka et al. ubliée en Mars 2006) Le système des interferons de type I (IFN α/β) est un système de défense puissant contre les infections virales. Synthétisés en réponse à l infection virale, les IFN α/β déclenchent la voie de signalisation Jak/Stat (figure 1) aboutissant à la transcription et à l expression de centaines de gènes appelés ISG (pour «interferon stimulated genes») conduisant à l établissement d un état anti-viral. IFNAR-1 IFNβ IFNAR-2 IFNα + STAT 1 STAT 2 Tyk2 Jak1 STAT 1 STAT 2 Stat 1 Stat 2 ISGF3 STAT 1 STAT 2 KR ADAR OAS 56 ISRE > 200 ISG Activités anti-virales Figure 1 1

2 Le virus de la rage (RV) possède un génome à ARN simple brin de polarité négative, codant pour 5 protéines virales : une nucléoprotéine (N), une phosphoprotéine (), une protéine matrice (M), une glycoprotéine (G) et une ARN-polymerase-ARN dépendante (L). RV est incapable de se répliquer dans des cellules traitées à l IFN α/β. Cependant, l IFN α/β n a aucun effet sur l infection virale, lorsque les cellules sont traitées quelques heures après le début de l infection. Question 1 : que suggère cette observation? Des cellules en culture ont été par RV pendant 18h puis transfectées par un plasmide codant pour la luciférase sous le contrôle d une séquence activatrice ISRE (Interferon Stimulated Responsive Element). 6 h après, ces cellules sont traitées par l IFNα, puis lysées pour doser l activité de la luciférase. Question 2 : quel est le but de cette expérience? Les résultats de cette expérience sont visibles dans la figure 2 : Facteur d activation de la luciférase Question 3 : après une analyse détaillée des résultats que pouvez vous conclure de cette expérience? IFNα Figure 2 2

3 Dans des cellules en culture par RV puis traitées par l IFNα, l expression de certains facteurs cellulaires impliqués dans la réponse IFN a été analysées par Western-Blot (voir figure 3). Question 4 : A quoi servent les différents contrôles? Quel est l effet de l infection virale sur l expression de STAT1, STAT2 et? Ce résultat est-il compatible avec celui de la figure 2? STAT2 STAT1 actine RV N RV RV M IFNα Figure 3 Dans les mêmes conditions expérimentales, un Western-Blot utilisant des anticorps spécifiques des formes phosphorylées de STAT1 (py701 et ps727 STAT1) et de STAT2 (py689-stat2) à été réalisé (voir le résultat sur la figure 4). Question 5 : ourquoi ce Western-Blot a-t-il été réalisé? Quel résultat met-il en évidence? Temps d incubation avec l IFNα en minutes py689-stat2 STAT2 py701-stat1 ps725-stat1 STAT1 RV N Figure 4 3

4 La localisation intracellulaire de Stat1 et Stat2 a été analysée par immunofluorescence et microscopie confocale dans les cellules par RV puis traitées ou non par l IFNα (voir figure 5). STAT1 RV- noyau superposition STAT2 RV- noyau superposition Figure 5 4

5 Question 6 : après une analyse détaillée de la figure 5, que pouvez-vous conclure de cette expérience? Question 7 : à ce stade de leurs recherches, les expérimentateurs soupçonnent très fortement la phosphoprotéine virale comme responsable des effets que vous avez analysés jusqu à présent. Imaginer un protocole expérimental permettant de confirmer ou d infirmer le rôle de. 5

6 Des cellules transfectées par un plasmide codant pour la protéine du RV, ont été traitées ou non par l IFNα puis lysées et immunoprécipitées avec un anticorps dirigé contre la protéine. Les protéines présentes dans l immunoprécipitat ont ensuite été révélées par SDS-AGE puis Western-Blot (voir figure 6) : Immunoprécipitat Lysat cellulaire IFNα - + Anticorps utilisé pour révéler le WB Anti- py689-stat2 Anti- STAT2 Anti- py70-stat1 Anti- STAT1 Anti- Anti- py689-stat2 Anti- STAT2 Anti- py70-stat1 Anti- STAT1 Anti- Figure 6 Question 8 : quel est le principe de cette expérience? Que met en évidence la figure 6? 6

7 Question 9 : à l aide d un schéma (inspiré de la figure 1) expliquez la stratégie utilisée par le virus de la rage pour échapper au système interféron : 7