La spectrométrie de masse est-elle un progrès dans l identification des staphylocoques à coagulase négative?

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1 La spectrométrie de masse est-elle un progrès dans l identification des staphylocoques à coagulase négative? Alain Gravet Laboratoire de Microbiologie Hôpital Emile Muller - Mulhouse

2 Identification des staphylocoques Identification S. aureus Recherche de la coagulase libre, du facteur d affinité pour le fibrinogène, de la protéine A Tests d agglutination : Slidex Plus, Pastorex Staph Plus, Staphytect Plus, Staph aureus Fumouze Identification des S. non-aureus et S. aureus atypiques API les Api 20 Staph (biomérieux), ID 32 Staph (biomérieux) Vitek 2 (biomérieux, carte ID-GPC), BD Phoenix (Becton Dickinson, galeries PMIC ID16 et PID) l identification de 20 à 30 espèces en 2 à 24 heures Les pourcentages d identifications correctes sont très variables

3 La spectrométrie de masse Technique MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time Of Flight) Principe : ionisation douce permettant l analyse des biomolécules des microorganismes, protéines membranaires et ribosomales suivie d une séparation en fonction de la masse et de la charge. En pratique : Dépôt d une partie de la colonie directement ou après extraction sur une plaque d acier polie, Ajout d une matrice, séparation des bioprotéines et formation de cristaux Tir laser afin d obtenir un spectre qui est comparé aux spectres d une base de données

4 Axima - Saramis Axima Assurance Fréquence du Laser : 50 Hz Longueur du trajet au détecteur 1,2 m Plaques 44 dépots dont 2 pour contrôle (souche E. coli) Saramis Algorithme 2300 Superspectres (spectres moyens) Algorithme > spectres

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6 Méthode de dépôt HCCA Ac. formique 25% dépôt 1 µl, sécher ajout 1 µl de matrice Plaque Maldi Évaporation du sovlant (T ambiante) Dépôt simple mais exige : matériel adapté précision un certain entrainement Analyse automatique du spectre

7 Algorithme Spectre SuperSpectra s s Reference Spectra > Spectra

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11 Souches analysées L enquête 2009 de l Observatoire des résistances bactériennes du Collège de Bactériologie Virologie Hygiène (ColBVH) Envoi de toutes les souches de staphylocoques à coagulase négative isolées d hémocultures et cliniquement significatives au laboratoire de Microbiologie de CH de Mulhouse Identification en spectrométrie de masse, comparaison avec l identification de routine utilisée par l ensemble des participants 219 souches isolées, 201 isolats reçus

12 Identification des 201 souches par les techniques conventionnelles Espèces Nombre pourcentage Staphylococcus epidermidis ,1% Staphylococcus hominis 15 7,5% Staphylococcus capitis 12 6,0% Staphylococcus haemolyticus 5 2,5% Staphylococcus lugdunensis 5 2,5% Staphylococcus warneri 5 2,5% Staphylococcus auricularis 2 1,0% Staphylococcus schleiferi 2 1,0% Staphylococcus cohnii 2 1,0% Staphylococcus caprae 1 0,5% Staphylococcus xylosus 1 0,5%

13 Techniques d identification utilisées

14 Protocole d analyse en spectrométrie Réensemencement des souches, 2 subcultures Extraction acide formique 25% (v/v) Dépôts en duplicats Acide alpha 4-cyano-4- hydroxycinnamique Saramis Base Novembre 2009

15 Résultats identification en spectrométrie 4 isolats éliminés : isolement d une souche non staphylococcique (Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Morganella morganii, Micrococcus luteus) 193 sur 197 (98,0%) isolats identifiés en superspectres 1 souches identifiée en spectre (S. cohnii subsp cohnii) 3 souches non identifiées à l espèce

16 Comparaison spectrométrie versus techniques classiques (n=197) Nombre d isolats Concordances ,3% Non identifié à l espèces par la spectrométrie de masse Identifications de 2 espèces pour un même isolat 3 1,5% 1* 0,5% Discordances 19 9,6% Pourcentage * Isolement de 2 types de colonies : S. epidermidis (identifié biochimiquement initialement) et S. haemolyticus.

17 Les concordances (n=174) Espèces Nombre Concordances pourcentage Staphylococcus epidermidis ,0% Staphylococcus hominis ,3% Staphylococcus capitis ,6% Staphylococcus haemolyticus % Staphylococcus lugdunensis % Staphylococcus warneri ,0% Staphylococcus auricularis 2 0 0% Staphylococcus schleiferi % Staphylococcus cohnii ,0% Staphylococcus caprae 1 0 0% Staphylococcus xylosus 1 0 0%

18 Identification par biologie moléculaire Séquençage du gène de la super-oxyde dismutase (soda) Séquençage du gène codant sous-unité de l ARN polymérase (rpob) Séquençage de l ARN 16S, moins discriminant Les souches discordantes, les souches non identifiées à l espèce, la souche identifiée en spectre Séquençage réalisé par le laboratoire de Microbiologie du CH de Versailles (Béatrice Pangon)

19 Identification conventionnelle Méthode utilisée Spectrométrie de masse S. capitis MICROSCAN S. epidermidis S. capitis API 32 STAPH S. epidermidis S. capitis VITEK S. epidermidis S. capitis API 20 STAPH S. hominis S. caprae VITEK S. capitis S. cohnii spp cohnii MICROSCAN S. epidermidis S. epidermidis API 20 STAPH S. aureus S. epidermidis VITEK S. aureus S. epidermidis VITEK S. haemolyticus S. epidermidis VITEK S. haemolyticus S. epidermidis API 20 STAPH S. hominis S. epidermidis API 20 STAPH S. hominis S. epidermidis VITEK S. hominis S. epidermidis VITEK S. hominis S. hominis VITEK S. epidermidis S. warneri VITEK S. capitis S. warneri VITEK S. capitis S. warneri VITEK S. haemolyticus S. xylosus API 32 STAPH S. epidermidis

20 Identification conventionnelle Séquençage du gène soda Spectrométrie de masse S. capitis S. epidermidis S. epidermidis S. capitis S. epidermidis S. epidermidis S. capitis S. epidermidis S. epidermidis S. capitis S. hominis S. hominis S. caprae S. capitis S. capitis S. cohnii spp cohnii S. epidermidis S. epidermidis S. epidermidis S. aureus S. aureus S. epidermidis S. aureus S. aureus S. epidermidis S. haemolyticus S. haemolyticus S. epidermidis S. haemolyticus S. haemolyticus S. epidermidis S. hominis S. hominis S. epidermidis S. hominis S. hominis S. epidermidis S. hominis S. hominis S. epidermidis S. hominis S. hominis S. hominis S. epidermidis S. epidermidis S. warneri S. capitis S. capitis S. warneri S. capitis S. capitis S. warneri S. haemolyticus S. haemolyticus S. xylosus S. epidermidis S. epidermidis

21 Identification conventionnelle Séquençage du gène soda Spectrométrie de masse S. capitis S. epidermidis S. epidermidis S. capitis S. epidermidis S. epidermidis S. capitis S. epidermidis S. epidermidis S. capitis S. hominis S. hominis S. caprae S. capitis S. capitis S. cohnii spp cohnii S. epidermidis S. epidermidis S. epidermidis S. aureus S. aureus S. epidermidis S. aureus S. aureus S. epidermidis S. haemolyticus S. haemolyticus S. epidermidis S. haemolyticus S. haemolyticus S. epidermidis S. hominis S. hominis S. epidermidis S. hominis S. hominis S. epidermidis S. hominis S. hominis S. epidermidis S. hominis S. hominis S. hominis S. epidermidis S. epidermidis S. warneri S. capitis S. capitis S. warneri S. capitis S. capitis S. warneri S. haemolyticus S. haemolyticus S. xylosus S. epidermidis S. epidermidis

22 Absence d identification à l espèce Identification classique S. auricularis (Vitek) S. warneri (Vitek) S. auricularis (Vitek) S. cohnii (Vitek) Spectrométrie de masse Staphylococcus sp. Staphylococcus sp. Staphylococcus sp. S. cohnii subsp cohnii Séquençage gène soda Séquençage ARN 16S S. auricularis NR S. pasteuri S. pasteuri Staphylococcus sp. S. cohnii S. pettenkoferi NR

23 Superspectres de la base 22 espèces en superspectres : S. aureus, S. auricularis, S. capitis, S. caprae, S. chromogenes, S. cohnii, S. delphini, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. hyicus, S. intermedius, S. kloosii, S. lugdunensis, S. pseudintermedius, S. saprophyticus, S. schleiferi, S. sciuri, S. simulans, S. vitulinus, S. warneri, S. xylosus

24 Espèces en simples spectres Espèces S. arlettae, S. equorum, S. felis, S. gallinarum, S. lentus, S. lutrae, S. pasteuri, S. pettenkoferi Sous espèces S. capitis subsp. capitis, S. capitis subsp. ureolyticus, S. carnosus subsp. carnosus, S. carnosus subsp. utilis, S. cohnii subsp. cohnii, S. cohnii subsp. urealyticus, S. schleiferi subsp. coagulans, S. schleiferi subsp. schleiferi, S. sciuri subsp. carhaticus, S. sciuri subsp. sciuri

25 Souches non identifiées à l espèce S. auricularis : 1 Superspectre 15 spectres S. pasteuri : Pas de superspectre 6 spectres S. pottenkoferi : Pas de superspectre 3 spectres S. cohnii subsp cohnii Pas de superspectre (mais 3 spp S. cohnii) 8 spectres Le nombre de spectres élément important pour la sensibilité de la méthode

26 Répartition des souches

27 S. hominis S S R S R S R S R S R R R R R R S R R R

28 Conclusions Pas d erreurs d identification pour la spectrométrie de masse Identification correcte 98,5% versus 89,6% Excellente identification en superspectre Plusieurs spectres dans la base pour une identification, «diversité» d une même espèce Pas de séparation en fonction de la résistance à la méticilline Spectrométre plus puissant (réflectron), utilisation d une autre matrice (DHB) Analyse et comparaison d une partie du spectre

29 Conclusions Spectrométrie de masse, technique Précision Enrichissement de la base Faible coût hors investissement Possibilité d identifier tous les flacons d hémoculture, les prélèvements polymicrobiens

30 Remerciements Membres du COLBVH pour leur participation Béatrice Pangon, CH de Versailles pour les identifications en biologie moléculaire Anna-Rosa Peluso, technicienne