Difficulté de la technique
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- Ghislaine Dupont
- il y a 8 ans
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1 Difficulté de la technique Le tissu dans 95% des cas, tissu fixé l ADN est de mauvaise qualité (cassé, modifié chimiquement par les fixateurs) artefacts au séquençage. Si un artefact est suspecté, il faut refaire la PCR et le séquençage Problématique technique
2 Au sein du réseau CONTICANET (Connective tissue cancer network) 11 laboratoires participants 50 échantillons analysés Chaque échantillon est analysé par 4 groupes différents Au total, 200 rapports de mutation
3 Au sein du réseau CONTICANET KIT PDGFRA centre Sample 1 c.1676t>g c.1988g>t c.2446g>c 5, 6* Imatinib treatment Sample 36 c.1664a>g c.1955g>c 11 Primary tumor Sample 40 c.1669_1674del 8 Imatinib treatment Sample 35 c.1679_1714del 7 5 out of 8 samples Sample 31 c.1504_1509dup 8 Primary tumor Sample 29 c.1669_1725del 7 Primary tumor Sample 24 c.1678_1680del 1 Imatinib treatment Sample 22 c.1663_1719del 7 primary tumor In italic : the mutation that was not detected * : centre 5 and 6 didn t detect respectively KIT exon 17 and 13 mutation.
4 KIT PDGFRA centre Sample 1 c.1676t>g c.1988g>t c.2446g>c 5, 6* Imatinib treatment Sample 36 c.1664a>g c.1955g>c 11 Primary tumor Sample 40 c.1669_1674del 8 Imatinib treatment Sample 35 c.1679_1714del 7 Sample 31 c.1504_1509dup 8 Primary tumor 5 out of 8 samples Sample 29 c.1669_1725del 7 Primary tumor Sample 24 c.1678_1680del 1 Imatinib treatment Sample 22 c.1663_1719del 7 primary tumor
5 PROBLEMES MAJEURS 8 sur 50 échantillons: la mutation n est pas détectée»16% de résultats faux négatifs Faux negatifs par laboratoire (6/11) 0% à 15% (moyenne=4.5%) Faux positif? (1 cas)
6 Problèmes sans implication thérapeutique Polymorphisme non détecté Absence d amplification de produit de PCR Erreur dans le rapport
7 Mutation rapportée c.1656_1670del p.tyr553_trp557del c.2524_2535del p.asp842_his845del c.1670_1678del p.trp557_val560delinsphe Mutation c.1655_1669del p.met552_trp557delinsarg c.2526_2537del p.ile843_asp846del c.1670_1675del p.trp557_val559delinsphe c.1669_1671del p.trp557del c.1667_1669del p.gln556_trp557delinsarg c.1668_1673del p.trp557_val559del) c.1668_1676del p.gln556_val559delinshis
8 L expérience germanique 6 laboratoires Analyse de KIT EX9, KIT EX10, PDGFRA EX18 Etude de la reproductibilité: 6 laboratoires 10 échantillons extraits de FFPE» 5 échantillons discordants» 3 mutés détectés WT dont 2 cas par le même laboratoire 1 cas mutés KIT ex11 mal retranscrit 1 cas mute PDGFRA ex18 délétion WT, erreur de retranscription, muté ex11, mutation ponctuelle ex18
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10 2 ème round 6 laboratoires et 12 échantillons
11 Contrôle qualité UKNEQAS Mise en place en 2011 du contrôle qualité pour la recherche des mutations dans les GIST au catalogue Cas1: Un homme de 48 ans présentant une anémie avec déficience en fer et une tumeur gastrique proximale mesurant 55mm. La tumeur ne montre pas d immuno positivité pour le CD117 ni pour DOG1. L analyse des mutations a été demandée pour confirmer ou non le diagnostic de GIST KIT
12 PDGFRA Conclusion: Absence de détection de mutations en défaveur d un diagnostic de GIST
13 Cas2: Homme de 66 ans presentant une douleur abdominale et une tumeur gastrique distale de 120 mmm. La tumeur est diagnostiquée comme étant un GIST mais son exérèse est incomplète et le traitement par imatinib est envisagé. L analyse des mutations est demandée PDGFRA EX18 p.asp842val Conclusion: Détection d une mutation dans l exon 18 du gène PDGFRA. Cette mutation est résistante à l imatinib.
14 Cas3: Un homme de 67 ans précédemment opéré pour une GIST de l estomac présentent des métastases au foie. Le traitement par imatinib est envisagé et la recherche des mutations a été demandée sur la tumeur primitive KIT exon 11 TAC AGTGGAAGGTTGTTGAGGTATAAATGGAAACAATTATGTTT.CACAACTTCC TAC CACAACT TCCTT Conclusion: détection d une mutation dans l exon 11 de KIT(p.Gln556_Thr574delinsPro) sensibilisante à l imatinib
15 Recommandations Pour qu un laboratoire recherche les mutations de KIT et PDGFRA il faut: un nombre suffisant de cas analysés/an une expérience de l analyse moléculaire à partir de tissus fixés il faut une personne dédiée à cette activité
16 DECOUVERTE DE DISCORDANCES Découverte de quelques cas dicordants wave/séquence Vérification de tous les GIST WT ( 12V/86WT) Quelques cas intéressants : Cas 1 : F11 no wave / del séquence Cas 2: F11 no wave / del homozygote Cas 3 : B9 V wave / no séquence
17 T no Vérif GIST WT X wave F11 54 C T muté profil normal CAS X séquence : mutation homozygote c.1727t>c (p.leu576pro)
18 Vérif GIST WT Y T no T muté Cas Y wave F11 54 C profil normal Cas Y séquence : délétion hétérozygote c dup (p.val560dup)
19 CAS 1 (muté en exon11) 06/04/09 : PCR wave normal (ADN dilué 1/10) 08/04/09 : PCR séquence = délétion homozygote (ADN 1/10) 11/05/09 : PCR séquence = normal (ADN 1/10) Test à plusieurs dilutions d ADN : 20/05/09 : PCR séquence ADN 1/10 : ni ADN 1/100 : ni ADN 1/200 : del hétérozygote 27/05/09 : PCR séquence ADN 1/10 : séquence normal ADN 1/100 : ni Test en gamme de dilutions ADN Comparaison avec 2 techniques d extraction d ADN (kit Wizard et kit FFPE)
20 CAS 1 (c.1669_1672delinsg) PCR du 18/06/09 ADN extrait avec le kit wizard : dilutions successives - ADN 1/5 = del hétérozygote (allèle muté minoritaire) 1/5 - ADN 1/10 = del hétérozygote (allèle muté majoritaire) - ADN 1/20 = normal - ADN 1/50 = normal - ADN 1/100 = ni - ADN 1/200 = normal 1/20 1/10 ADN extrait avec le kit FFPE : dilutions successives FFPE 1/5 -ADN 1/5 = del hétérozygote (50/50) - ADN 1/10 = del hétérozygote (allèle muté minoritaire) -ADN 1/20 = del hétérozygote FFPE 1/10 - ADN 1/50 = del hétérozygote - ADN 1/100 = del homozygote - ADN 1/200 = ni FFPE 1/100 FFPE 1/20
21 T No Cas 2 CAS 2 (muté exon 11) T muté wave F11 54 C = profil normal (ADN 1/100) séquence = del hétérozygote c.1657_1674del (ADN 1/5)
22 CAS 2 (c.1657_1674del) PCR du 31/08/09 : dilutions successives ADN 1/5 T No ADN 1/5 ADN 1/10 ADN 1/10 ADN 1/100 T muté ADN 1/100 (séquençage des PCR wave, ADN 1/50 ni)
23 T No CAS 3 (muté exon 9, série 108) T muté Cas 3 wave B9 54.0c = profil variant (PCR du 18/08/09, ADN 1/10) séquence = normal (PCR du 24/08/09, ADN 1/10)
24 CAS 3 (c.1504_1509dup) PCR du 31/08/09 : dilutions successives ADN 1/5 ADN 1/5, 1/10, 1/100 : dup homozygote ADN 1/10 ADN 1/50 ADN 1/100 ADN 1/50 : dup hétérozygote (allèle muté majoritaire) PCR du 18/10/09 : test autre couple d amorces B9+/B9- -ADN ½ : dup homozygote - ADN 1/5 : dup homozygote - ADN 1/10 : dup hétérozygote (allèle V majoritaire) - ADN 1/50 : normal - ADN 1/100 : dup homozygote - ADN 1/200 : ni C9+/9R -ADN ½ : dup homozygote - ADN 1/5 : dup homozygote - ADN 1/10 : dup hétérozygote (allèle V majoritaire) - ADN 1/50 : dup hétérozygote (allèle V majoritaire) - ADN 1/100 : dup homozygote - ADN 1/200 : dup hétérozygote (50/50)
25 CAS 3 (c.1504_1509dup) PCR du 31/08/09 : dilutions successives ADN 1/5 ADN 1/5, 1/10, 1/100 : dup homozygote ADN 1/10 ADN 1/50 ADN 1/100 ADN 1/50 : dup hétérozygote (allèle muté majoritaire) PCR du 18/10/09 : test autre couple d amorces B9+/B9- -ADN ½ : dup homozygote - ADN 1/5 : dup homozygote - ADN 1/10 : dup hétérozygote (allèle V majoritaire) - ADN 1/50 : normal - ADN 1/100 : dup homozygote - ADN 1/200 : ni C9+/9R -ADN ½ : dup homozygote - ADN 1/5 : dup homozygote - ADN 1/10 : dup hétérozygote (allèle V majoritaire) - ADN 1/50 : dup hétérozygote (allèle V majoritaire) - ADN 1/100 : dup homozygote - ADN 1/200 : dup hétérozygote (50/50)
26 Vérification de toutes les délétions homozygotes et de tous les GIST WT pour l exon 11 - Pour chaque ADN : dilutions successives = 1/5, 1/10, 1/50, 1/100, 1/200, 1/500 - Toutes les dilutions sont passées sur wave (hétéroduplex non mélangés avec du normal) - Pour les cas bizarres : séquençage des PCR passées sur wave aucun GIST WT retrouvé muté 22 patients del homozygote testés (28ADN) Exemple de cas «normal» Exemple de cas «bizarre»
27 CAS 4 (c.1673_1675del) 1/5 1/10 1/50 1/100 1/200 1/500 Del homozygote Del hétérozygote Del3 ADN 1/5 à ADN 1/100 ADN 1/200 à ADN 1/500
28 CAS 5 (c.1670_1675del) ADN 1/10 et ADN 1/50 : del homozygote Del6 1/10 1/50 1/100 ADN 1/100 : del hétérozygote
29 CAS 6 (c.1671_1676del) 1/200 1/500 Del6 ADN 1/5 à 1/200 = del homozygote ADN 1/500 = del hétérozygote
30 CAS 7 (c.1669_1683del) Del hétérozygote A revoir
31 CAS ASSURANCE QUALITE CONTICANET ADN 38 1/5 = séquence normale ADN 38 1/2 = del24 homozygote Del24 Autre cas : ADN5 - ADN5 1/10 = del21 homozygote - ADN5 1/100 = séquence normale ADN testé à Lyon : PCR faite plusieurs fois et del non retrouvée à chaque fois ADN envoyé à Leuven (centre de référence des mutations GIST) : séquence normale
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