Chap IV La paroi 17/09/2008. La paroi bactérienne

Transcription

1 Chap IV La paroi La paroi bactérienne Introduction Deux types de bactéries (G+ et G-) survivent dans l environnement malgré une forte pression osmotique interne ; elles sont généralement impliquées dans des pathologies différentes. Définitions Enveloppe externe rigide et résistante protégeant la MC (sauf chez les formes L) caractérisée par une macromolécule géante : le peptidoglycane. Mise en évidence de son individualité anatomique Microscopie optique (coloration de Gram, plasmolyse) et électronique (montre une ultrastructure très différente entre les bactéries G+ et G-). 1

2 Comparaison de la paroi des bactéries G- et G+ Principe et étapes de la coloration de Gram coloration au cristal violet mordant (iode) décoloration Et-OH contre coloration la safranine 2

3 Coques G+ et bacilles G- Plasmolyse: choc en milieu hypertonique 3

4 Ultrastructure de la Paroi des bactéries Gram-négatif Couche externe = membrane externe : lipopolysaccharide, phospholipides, protéines (porines) Couche intermédiaire : lipoprotéine de Braun, enzymes périplasmiques Couche dense : peptidoglycane(2-3 nm) Périplasme: Enzymes périplasmiques. 4

5 Architecture de la paroi des bactéries G- Analyse topographique par cryodécapage; Modèle de Nanninga 5

6 Ultrastructure de la Paroi des bactéries Gram-positif Moins complexe, plus épaisse : nm d épaisseur, qui peut varier en fonction de l environnement (elle augmente dans les conditions défavorables ou lors du vieillissement). Absence de frontière nette entre le PG et le périplasme, car le PG se renouvelle en permanence dans cette région ; en outre, la surface externe présente un aspect fibreux (perte de PG). 6

7 Architecture de la paroi d une bactéries G+ : S. aureus Comparaison G+ / G- 7

8 Composition chimique Le peptidoglycane (PG) appelé aussi muréine et muropeptide. Hétéropolymère de très grande taille correspondant à l association d un héteropolysaccharide et d un peptide. Méthode d étude et purification: Chez les G+: broyage, traitement enzymatique (amylase) et formamide à chaud (élimination des acides lipoteichoïques). Chez les G-: SDS bouillant, protéolyse, hydrolyse chimique ménagée Structure du PG L hydrolyse au lysozyme permet d obtenir le monomère de base : NAG-NAM 8

9 Le tétrapeptide latéral Se greffe au niveau du chaînon lactyl du NAM (liaison amide), hydrolysé par une amidase. On observe une alternance entre des aas L et D (rigidité?).. Pont interpeptidique Les ponts interpeptidiques Relient entre elles les chaînes hétéropolysaccharidiques substituées par les tétrapeptides. Dans le modèle Copenhague, c est une pentaglycine; il en résulte un pontage généralisé = macromolécule géante englobant toute la bactérie. 9

10 Variations autour du modèle de PG On les observe essentiellement au niveau du tétrapeptide latéral et des ponts interpeptidiques: - variations quantitatives=réticulation(qui se mesure par la quantité de dimères obtenue après action du lysozyme) - Variations qualitatives: notamment de l acide aminé en position 3 et du lien interpeptidique: le DAP (spécifique des procaryotes) en position 3 du tétrapeptide et un lien direct entre les tétrapeptides constituent des caractéristiques des G- Variations quantitatives = réticulation 10

11 Variations qualitatives 11

12 Réactions de transpeptidation : formation des ponts interchaînes 12

13 Biosynthèse du peptidoglycane cytoplasme 13

14 En conclusion, la structure du PG est beaucoup plus variable et plus complexe chez les G+ que chez les G- (distorsions), ce qui est en accord un statut plus évolué des G-. 14

15 Composants spécifiques des bactéries Gram-positif Les acides teichoïques (AT): polymères de polyols (chaîne de Glycero-P sur laquelle se fixent des monosaccharides et/ou des aa). Traversent le PG; Charges (-) en surface Acides lipoteichoïques: glycosides de diglycérides reliés aux AT. Parie AG est ancrée dans la mp. (AgD Streptocoques) Acides teïchuroniques : polysaccharides acides ou neutres liés au PG sans acide phosphorique; rencontré chez Bacillus, Micrococcus et Staphylococcus Par exemple, lorsque B. subtilis pousse dans un milieu pauvre en phosphate, ce dernier est remplacé par de l acide uronique 15

16 Composants spécifiques des bactéries Gram-négatif Le Lipopolysaccharide(LPS) : modèle Salmonella typhimurium 16

17 La membrane externe des bactéries G-est caractérisée par une distribution asymétrique des lipides dans la bicouche : -un feuillet interne classique (phospholipidique), -un feuillet externe formé presqu exclusivement de lipopolysaccharides (LPS) fortement chargé négativement (phosphates). Le LPS est composé de 3 parties associées par des liaisons covalentes Structure du lipopolysaccharide (LPS) Salmonella typhimurium La chaîne variable O (antigénique) n=4 à 30 Présente dans souches S (smooth), absentes ou incomplètes chez souches R (rough) Barrière pour les antibio hydrophobes Le polysaccharide central (core polysaccharidique) Hydrolyse Ac acétique 1% 1h 100 C Le lipidea (inséré dansle feuillet externe de la membrane) 17

18 Le Lipide A Fortement conservé chez les bactéries Gram-négatif Partie intégrante de la membrane externe; il permet d ancrer la région polysaccharidique dans la membrane externe, et il est responsable de la toxicité (endotoxine) C est un polymère glycophospholipidique formé d unités disaccharidiques de glucosamine (bêta1-6) reliées entre elles par des ponts pyrophosphates, et auxquelles sont rattachées de longues chaînes d acides gras (C12-C16) Le Polysaccharide central La région du CDO (ceto-2 desoxy-3 octonique=kdo) : le CDO est un acide-alcool en C8 (union de l acide pyruvique (C3) et de l arabinose (C5)) La région des diheptoses (sucre en C7 rencontré uniquement chez les bactéries Gram -) Et la zone externe du core polysaccharidique (5 sucres) 18

19 La Chaîne latérale O Elle est constituée d unités répétitives tétrasaccharidiques Elle est très variable (nature et arrangement des sucres) Elle est responsable de la grande diversité antigénique somatique (sérotypes) La perte partielle ou totale de la chaîne O se traduit par des colonies rugueuses (mutant R = rough = rugueux) ; tandis que les colonies sauvages sont lisses. S=smooth=lisse) Biosynthèse du LPS 19

20 Conclusion Le feuillet externe est fortement chargé négativement. Les ions Mg++ assurent la stabilité des chaînes de LPS. Des antibiotiques comme les polymyxines (polycations) agissent en perméabilisant la membrane externe. La Lipoprotéine de Braun Elle est d une part fixée par une liaison covalente au peptidoglycane (au niveau du DAP du tétrapeptide latéral), et elle s intègre d autre part dans le feuillet interne de la membrane externe. Elle joue notamment un rôle structural en contribuant à la stabilité de la membrane externe (en association avec la protéine OmpA Outer membrane ProteinA). 20

21 Les Porines (OmpF, OmpC, PhoE) Les protéines de la membrane externe représentent 50% de la masse de celle-ci ; 70% de ces protéines sont des porines. Les porines Les porines sont codées par les gènes OmpF, OmpCet PhoE. Elles traversent de nombreuses fois la membrane externe (feuillets bêta) et forment une structure trimérique dans laquelle chaque monomère présente un canal qui permet le passage (non spécifique) de petites molécules hydrophiles (sucres, amino-acides ). Une grande variété de protéines minoritaires (mineures) sont impliquées dans un transport spécifique à travers la membrane externe (LamB pour le transport du maltose, des sidérochromes pour celui du fer). La translocation s effectue au niveau des jonction de Bayer (permettant une interaction directe avec le LPS). En outre, le LPS présente in vitro une capacité d autoassemblage avec les porines et les lipoprotéines de Braun. 21

22 Les enzymes périplasmiques Ces enzymes agissent sur des substrats présents dans le périplasme (notamment après diffusion par les porines). Ce sont notamment des enzymes qui interviennent dans la dégradation ou qui préparent l entrée dans la cellule: DNases, RNases, nucléotidases, phosphatases, isomérases, épimérases (ces dernières permettent de réduire le nombre de perméases membranaires) Certaines enzymes sont associées à des composants structuraux qui maintiennent l enzyme dans une configuration correcte. D autres enzymes sont solubles dans le périplasme et peuvent être isolées par choc osmotique. Résumé: propriétés de la paroi des G+ et des G- 22

23 Propriétés et fonctions de la paroi Fonctions de protection. contre les gradients de force osmotique : la pression osmotique du cytoplasme est très élevée : le milieu extérieur est en général hypotonique. On peut mettre en évidence les propriétés de la paroi (notamment résistance et rigidité) en introduisant les bactéries dans un milieu de tonicité variable ou en éliminant leur paroi. -Plasmolyse, -sphéroplastes(expérience de Repaske), -protoplastes, -propriétés mécaniques de la paroi Production de Sphéroplastes (à partir de G-) 23

24 Production de Protoplastes (à partir de G+) culture en présence de pénicilline ou action du lysozyme Propriétés mécaniques de la paroi : résumé - La plasmolyse montre que la paroi est rigide. - La paroi est très faiblement élastique, car la variation de tonicité ne modifie pas la taille des bactéries. - La forme toujours sphérique des protoplastes ou des sphéroplastes situés dans un milieu isotonique par rapport à leur cytoplasme montre que la paroi détermine la forme des bactéries. - L éclatement des sphéroplastes ou des protoplastes montre que la paroi est très résistante. 24

25 Autres fonctions protectrices de la paroi - Contre la pression externe. -Contre les agents chimiques et enzymatiques. Le PG est sensible au lysozyme (larmes, salive ) ou à la pénicilline, surtout chez les bactéries G+. La surface de la paroi des bactéries G+ et G- assure pourtant une défense efficace: elle est hydrophile (AT pour les G+, LPS pour les G-) et elle est chargée négativement (groupements phosphates). Cela lui permet de bloquer l internalisation des molécules hydrophobes (protection contre les sels biliaires). La situation est plus délicate en ce qui concerne les molécules hydrophiles: elle doit laisser passer les petites molécules nutritives tout en bloquant l internalisation des grosses molécules hydrophiles (agents toxiques, protéases) : cette protection est plus efficace chez les bactéries G- que chez les G+ (feuillet phospholipidique + diffusion simple ou facilitée). Fonction de la paroi dans la division : le septum Rôle du PG et des protéines. Chez les bactéries G+, c est la totalité de la paroi (PG) qui s invagine (vrai septum). Chez les G-, on observe plutôt une constriction. De nombreuses protéines sont impliquées (Fts). Parmi elles, FtsZ est un homologue de la tubuline: elle forme un anneau de constriction lors de la division. 25

26 Division chez les G+ Division chez les G- 26

27 La paroi et la régulation de la perméabilité Rôle de la membrane externe chez les bactéries G- : diffusion simple (porines) et diffusion facilitée (par l intermédiaire de récepteurs spécifiques, comme LamB pour l internalisation du maltose). Tri par les mailles du PG chez les bactéries G+. Les porines et la diffusion simple Les porines (canaux non spécifiques) sont codées par les gènes OmpF, OmpC et PhoE Elles forment une structure trimérique dans laquelle chaque monomère présente un canal qui permet le passage (non spécifique) de petites molécules hydrophiles (sucres, amino-acides ) La membrane externe des bactérie G-contrôle l internalisation des petites molécules hydrophiles dont la taille est <=700daltons par l intermédiaire des porines ( /bactérie, trimères formés de 3 sous-unités identiques transmembranaires) qui fonctionnent par diffusion passive (simple) = canaux non spécifiques. Cette diffusion présente 3 caractéristiques : - la taille des pores: 1,2 nm = PM daltons. - la charge des molécules hydrophiles: les cations diffusent plus rapidement que les anions. - l hydrophobicité: la vitesse de diffusion est inversement proportionnelle à l hydrophobicité. 27

28 La paroi et les relations hôte / bactéries Les bactéries (qu elles soient saprophytes ou pathogènes) doivent adhérer à la surface des muqueuses et résister aux mécanismes de défense, que ceux-ci soient spécifiques ou non. Il existe 3 mécanismes pathogéniques qui peuvent provoquer des dommages chez l hôte : - la prolifération - l interférence avec les défenses de l hôte - composants provoquant des dommages chez l hôte 1- La prolifération Le fer est indispensable à la croissance bactérienne, et les sidérophores (sécrétés à l extérieur ou adsorbés à la surface de la paroi) permettent aux bactéries pathogènes de concentrer le fer qui est très peu soluble, et d entrer en compétition avec la transferrine et la lactoferrine de l hôte (bloquant normalement la croissance de nombreuses bactéries pathogènes). La souche bactérienne devient virulente (prolifération) si le sodérochrome bactérien l emporte. 2- l interférence avec les défenses de l hôte Résistance aux agents antibactériens (lysozyme), et surtout aux cellules phagocytaires (macrophages) - inhibition de la réaction inflammatoire : activité antiinflammatoire du PG (certains Staphylocoques) - l inhibition de la phagocytose (ingestion) qui est le principal mécanisme de virulence : certains PG de bactéries G+ et certains LPS de bactéries G- peuvent présenter une activité anticomplémentaire et/ou anti-fc. certains LPS de bactéries G- peuvent modifier leur AG O et ne plus être reconnus par les Ac préalablement synthétisés contre la même espèce bactérienne. -prévention de la digestion intracellulaire certaines bactéries survivent dans les phagosomes(coagulase du Staphylocoque), peuvent se multiplier, puis tuer la cellule et être libérées (Mycobacterium tuberculosis, Staphylocoques, Neisseria) 28

29 3- composants provoquant des dommages chez l hôte cas des bactéries G- avec l endotoxine = LPS. Le LPS est très résistant à de nombreux agents physiques ou chimiques, et pour détruire l activité endotoxinique, il faut un chauffage de 7h/126 C. De petites quantité de LPS = ng/kg : activation, fièvre, augmentation de la synthèse d AC, inflammation. Des quantités importantes de LPS= microg/kg augmentent l IL-1, le TNF, les facteurs de la coagulation : Les effets = choc septique, coagulation intravasculaire. Les bactéries G- non pathogène peuvent relarguer du LPS et devenir pathogènes. Autres rôles de la paroi: récepteur de phages, dans la mobilité flagellaire Conclusions Il existe des eubactéries sans paroi: - les formes L: bactéries sans paroi similaires aux protoplastes ou sphéroplastes (à la suite d un traitement à la pénicilline). - les mycoplasmes: bactéries sans paroi, dont la membrane est consolidée par des stérols (Mycoplasma mycoïdes) 29