Workshop Ruwag AG 1 octobre Utilisation des immunodots dans le laboratoire de diagnostic

Transcription

1 Workshop Ruwag AG 1 octobre 2008 Lausanne Utilisation des immunodots dans le laboratoire de diagnostic Dr V. Aubert Service d immunologie et d allergie, CHUV, Lausanne

2 Nombre d aspects identifiés sur Hep-2 Figure 4. The cumulative number of autoantibody patterns that have been identified Bradwell & on Hughes, 2007 HEp-2 cells since 1957.

3 Ermann J and Fathman CG. Autoimmune diseases: genes, bugs and failed regulation. Nature Immunology 2001;2(9):759-61

4 Raisons pour effectuer un test? Dépistage d une maladie systémique Confirmation d un diagnostic Evaluation et suivi de l activité de la maladie

5 Nouveaux autoanticorps Intérêt clinique? 1.Certitudes démontrées (plusieurs études différentes) 2.Définition de la sens. / spéc. 3.Accès aux techniques

6 1. ANA /ENA «Full ANA Dot» 2. Hepatopathies autoimmunes «Liver Profile» 3. Polymyosites «Sclero-Poly-Synthetase SPS-MI2»

7 Pourquoi un dot «en plus»?

8 Immuno Fluorescence : interprétation délicate Anticorps anti-nucléaire Aspect différent selon fournisseur Aspect rare (anti-ku, anti-mi2) Anticorps anti-cytoplasmique Aspect des anti-synthétases Aspect filamenteux Sérums hypergammaglobulinémiques Marquage homogène du cytoplasme

9 Divers aspects cytoplasmiques sur cellules Hep-2 Anti-Jo 1 Anti-ribosomes Anti-SRP

10 Divers aspects cytoplasmiques sur cellules Hep-2 Anti-vimentine Anti-actine

11 Full ANA Dot

12 c. pos Sm Immunodot RNP (68KD/A/C) Sm/RNP SSA SSB Jo-1 Scl-70 PM/Scl Ku CENP-A/B PCNA Ribosomes C. nég E E Sérum patient Antigène purifié Conjugué anti-igg

13 Complexe RNP/Sm Anti-RNP réagit contre 3 protéines (68kd, A et C) Anti-Sm réagit contre 6 protéines (B, B,D,E,F,G) Figure 72. Diagram of Sm antigen on the U1-snRNP complex.

14 Complexe SSA/SSB Anti-SSA réagit contre 2 protéines (52 et 60 kd) Anti-SSB réagit contre 1 phosphoprotéine (48 kd) Figure 75. Diagram of SSA/SSB complex.

15 Jo-1 Anti-histidyl-tRNA synthetase (50kd) Polymyosite (20-40%) Dermatomyosite Maladie pulmonaire interstitielle Figure 80. Fine cytoplasmic speckling, autoantibodies to Jo-1.

16 Scl-70 Protéines nucléaires solubles associées à la chromatine Topo-isomerase-I (70kd) Sclérose systémique (20-50%) LED (25%) Figure 77. Scl-70 staining with no nucleolar staining. Figure 78. Scl-70 staining with nucleolar staining and nuclear dots.

17 PM/Scl Complexe multimoléculaire d environ 11 polypeptides (100kd; 75kd; 37kd) Fonction dans la biosynthèse des ribosomes? Association clinique polymyosite et sclérodermie Marquage homogène du nucléole

18 Ku Protéines nucléaires solubles associées à la chromatine Protéine dimérique (70/80 kd) Aspect finement moucheté dense Visible lors de l interphase cellulaire, mitose nég LED Figure 28. Fine speckled pattern.

19 Centromère Figure 38. Diagram showing the location of the centromere proteins. The location of CENP-D is not clearly defined. Syndrome de CREST (sclérodermie)

20 PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen Visible lors de la phase S du cycle cellulaire Peu sensible pour le LED (3-6%) Très spécifique du LED Figure 36. Fine speckled PCNA pattern showing variable staining Figure of interphase 37. Coarse speckled PCNA pattern showing variable staining of interphase nuclei. nuclei.

21 Ag sur le ribosome Figure 49. Diagram showing the locations of the major antigens on the ribosome. Associé à des symtomes neuropsychiatriques 10-20% de LED avec dsdna nég Figure 50. Ribosomal pattern.

22 Algorithme pour recherche d ANA (FAN) Recherche ANA (1/80) (IFI sur Hep-2) Titre 1/80 Négatif Titre 1/80 1/160 Titre 1/320 homogène : Ac anti-dsdna moucheté : Ac anti-nucléoprotéines Place du FullANAdot? Ac anti-dsdna Ac (ELISA) anti-dsdna (ELISA) Ac. anti-nucléoprotéines (ELISA) Négatif Positif Négatif Positif Ac anti-nucléosome Spécificités SSA, SSB, RNP, SM, Scl-70, Jo1 (ELISA)

23 Utilité? 1. Confirmer les aspects centromères? 2. Si doute d une fluorescence PCNA? 3. Si RNP et Sm positifs et non différentiables? 4. Recherche de spécificités rares?

24 RNP/Sm Ribos. CENP PCNA Pm-Scl Spécificités positives Fin avril 2006 introduction du test FullANAdot N = Scl-70 SSB RNP Ku SSA Jo-1 Sm

25 Comparaison EIA-Dot Concordance 50 / 95 : 52% 28 résultats pos 22 résultats nég Discordance 45 / 95 : 48%

26 Comparaison globale Spécificités Conf. pos Nouv. pos «Faux nég» Sm 14 (12 >100 U) 0 23 (3 >100 U) RNP RNP/Sm 21 (16 >100 U) 0 16 (1 >100 U)* SSA 20 (13 >100 U) 3 13 (5 >100U) SSB 6 (5>100 U) 0 2 (0 >100 U) Jo Scl (< 45 U) Pm-Scl Ku CENP-A/B PCNA Ribosomes * Tous compris dans les 23 Sm «fx nég»

27 Principales réactions divergentes avec Sm négatifs par dot Aspect IFI titre dsdna EIA Autres pos. Interpr. Mou / 35 RNP Fx pos EIA Mou / 30 0 Fx pos EIA Hom-mou / 52 SSA Fx pos EIA? Hom / 31 0 Fx pos EIA Mou / 31 SSA / RNP Fx pos EIA Hom / 31 SSA Fx pos EIA Hom-mou / 32 SSA Fx pos EIA? Hom-nucléo / 46 0 Fx pos EIA? Hom-mou / 33 0 Fx pos IFI et EIA? Hom-mou / 31 0 Fx pos IFI et EIA? Mou 80 nd 27 / 42 0 Fx pos IFI et EIA

28 Principales réactions divergentes avec Sm négatifs par dot Aspect IFI titre dsdna EIA Autres pos. Interpr. Mou / 156 SSA / SSB Fx nég dot Hom-mou / 131 RNP Fx nég dot Hom-mou / 64 SSA /SSB/RNP Fx nég dot? Hom / 99 0 Fx nég dot? Hom / 64 0 Fx nég dot? Hom / 50 0 Fx nég dot? Hom / 89 SSA / SSB Dot RNP/Sm pos /? Mou / 38 0 Dot RNP/Sm pos /? Hom-mou / 94 SSA Fx nég dot? Hom / Fx nég dot? Mou / 40 0? Mou / 84 0?

29 RNP? Sm? ou les deux? - 36 RNP/Sm et Sm positifs par EIA: - 3 confirmés RNP seul par dot - 8 confirmés Sm seul par dot - 6 confirmés RNP/Sm, RNP et Sm par dot - 3 confirmés RNP/Sm seuls par dot -16 non confirmés par dot - 1 RNP/Sm pos et Sm nég par EIA confirmé RNP par dot - 1 Sm pos par EIA non confirmé par dot

30 Principales autres réactions divergentes SSA / SSB 13 SSA positifs par EIA et négatifs sur FullANA dot probable SSA 52kd Centromères 1 aspect centromère par IFI et négatif sur FullANA dot 13 aspects centromères par IFI et confirmés positifs sur FullANA dot 7 aspects hom-mou par IFI, anti-centromères positifs sur FullANA dot PCNA 6 aspects pseudo-pcna par IFI et négatifs sur FullANA dot

31 Intérêt du FullANADot 1. Confirmer les aspects centromères? OUI 2. Si doute d une fluorescence PCNA? OUI 3. Si RNP et Sm positifs et non différentiables? OUI 4. Recherche de spécificités rares? OUI

32 Leçons à tirer FullANAdot relativement peu sensible pour Sm test de dépistage Utile dans la différenciation et précision des Ag = test complémentaire Pas en remplacement de l ELISA Volume trop élevé et interprétation subjective

33 Liver Profil

34 Antigènes à disposition c. pos M2-PDH LKM1 LC1 SLA F-Actine c.nég cirrhose biliaire primitive hépatite autoimmune type II hépatite autoimmune type II hépatite autoimmune type I hépatite autoimmune type I

35 Anti-mitochondrie Dépistage sur cellules MSK Anti-M2 Figure 51. Diagram of a mitochondrion.

36 Ag des mitochondries M2 (2-oxo-acide dehydrogenase complex) Pyruvate déshydrogénase (PDH) - PDC-E2 Sous-unité E2 de la PDH - BCOADC-E2 branched chain oxo-acid dehydrogenase complex - OGDC-E2 oxo-glutarate dehydrogenase complex

37 Utilisation du Liver Profil dot Labo LIA : anti-m2 22 pos /455 anti-lkm1 7 pos /455 (3 patients) anti-lc1 6 pos /455 (1 patient) anti-sla 5 pos /455 anti-f-actine 27 pos /455

38 M2 du Liver Profil dot Répartition des 22 cas positifs par dot AMA EIA pos nég pos nég EIA pos / 22 (86%) 13 AMA pos / 22 3 EIA pos, MSK non réalisé 1 AMA nég, EIA non réalisé - femme 1947, urgence, ASMA + - homme 1969, susp. Hép. aiguë, anti-hbc et anti-hav positifs

39 F-Actine du Liver Profil dot Répartition des 27 cas positifs par dot EIA pos nég 23 EIA pos / 27 (85%) 11 ASMA pos / 27 ASMA pos nég EIA pos, MSK non réalisé 3 EIA nég, MSK non réalisé Cytolyse hépatique persistante post hép. B

40 Liver Profil dot Risque de résultats faux positifs : 4 faux pos F-Actine 2 faux pos M2 Nécessité de confirmer un Risque de résultats «faux négatifs» : F-Actine : 27 cas EIA pos / Dot nég dot négatif si forte suspicion EIA 25 U, (n=9) clinique - 4 /9 sont ASMA négatifs - 3 /9 sont ASMA pos à 1:80 (+2 MSK pas réalisé) EIA > 25 < 50 (n=16) (4 ASMA nég; 5 1:80; 3 1:160; 1 1:320; 3 pas réalisé) M2 : 3 cas EIA pos / Dot nég - 3 /3 sont AMA positifs et 2 sont des CBP

41 SLA antibodies in chronic HCV infection SLA pos dans 10,4% des patients HCV pos (n=48) 100 HCV pos 58 :HCV+/LKM1+ 42: HCV+/LKM1-126 HCV nég SLA présent c/o HCV pos Prévalence de 27,5% si LKM1 pos Vitozzi,P et al. Autoimmunity 2004, 37(3):

42 SLA and LC1 antibodies in patients with chronic viral hepatitis 138 HCV pos 18 : HCV+/LKM1+ 120: HCV+/LKM1-6 Pas de justification à rechercher les HCV nég /HBV pos anti-lc1 et anti-sla au laboratoire de 0 01 LC1 diagnostique pos: SLA chez pos: des patients avec 6/18 hépatites (33%) virales 0/18 et LKM1 négatif 1/120 (0.83%) 0/120 0/120 HBV pos 0/ Rigopoulo, E et al. J. Autoimmune Dis. 2007, 4:2

43 Cirrhose Biliaire Primitive Destruction des petites voies biliaires - cholestase progressive - fibrose - cirrhose Dépistage sur cellules Hep-2 - anti-mitochondrie - anti-membranes nucléaires (gp210) - dot nucléaire (sp100) - associés aux connectivites - centromère - SSA / SSB

44 Détection des AMA AMA par IFI + M2/MIT3 par ELISA Sensibilité élevée 5 10 % de CBP avec AMA négatifs

45 Profil sérologique de patients avec cholestase autoimmune chronique CAC (n=174) 99 AMA + 75 AMA - 49 AMA- / M2 - Anti-M2 + : 26 (34.6%) SP100 : 27/125(21.6%) 10/49(20.4%) GP210 : 9/125(7.2%) 6/49(12.2%) 13 patients avec anticorps (SLA, F-actine, p-anca) rencontrés dans les HAI IgM élevé IgG élevé Romero-Gomez, M. et al.am J Gastro 2004;99:

46 Cirrhose Biliaire Primitive Figure gp Diagram : protéine of nuclear membranes associée and au nuclear pore nucléaire complex.

47 Cellule Hep-2 sp100 gp210 Figure 30. Multiple nuclear dots pattern. Figure 25. Nuclear pores and nucleolar pattern. ponctuations nucléaires Aspect granulaire de la membrane nucléaire

48 PBC Screen ELISA Sensibilité: AMA 61% PBCScr. 76.5% Spécificité: AMA 98.2% PBCScr. 98.2% Bizzaro N. et al. 2008

49 PBC Screen ELISA Sérums testés: - aspect «homogène» et cytoplasme positif sur Hep-2 (n=24) - AMA (IFI) positif (n=36) - Aspect dot nucléaire (n=19) - Patients connus avec CBP (n=10)

50 PBC Screen ELISA Résultats: Hom/Cyto + AMA + Dot nucl. + CBP +

51 PBC Screen ELISA Résultats: - Hom/Cyto + : 24 - / 24 (9 dot LP actine +) - AMA + : AMA IFI + 36 PBCscreen + 30 (83%) PBCscreen - 6 (17%) Dot Liver + 29 Dot Liver - 1 Dot Liver +/- 1 Dot Liver - 5

52 PBC Screen ELISA AMA + : PBCscreen AMA M2 Dot LP(M2) 4 1:80 nég nég 7 1:80 +/- nég 12 1:80 nég +/- 2 1:160 nég nég 4 1:40 nég nég 10* 1:640 nég nég 29 1:320 nég nég * anti-vimentine

53 PBC Screen ELISA - Dot nucl. +: 11 + / 19 5, AMA nég, DotLP nég 8 /19 («fx pos» dot nucl.) Sp100? gp210? PBCscreen AMA M2 ASMA Dot LP 19 nég nég +/- nég 3 nég nég nég nég 5 nég nég nég Anti-M2 4 nég nég nég nég 3 nég nég nég nég 3 nég nég nég nég 2 nég nég nég nég 2 pos nég nég nég

54 PBC Screen ELISA Patients connus avec CBP No PBCscreen ANA aspect cyto AMA M2 Dot LP 1 96 nég pos pos 62 Anti-M2 2 2* nég pos nég nég nég :5120 Mou/Dot nucl. pos 1:160 nég nég 4 94 Pos centromère pos 1: Anti-M nég pos 1: M2 / act nég pos 1: Anti-M nég pos 1: Anti-M2 8 3** nég nég nég nég nég nég pos 1: Anti-M nég pos 1: Anti-M2 * Probable CBP séronégative (AMA et M2 nég) ** Faux diagnostic

55 Quand utiliser l ELISA PBCScreen? Dépistage des CBP à la demande du méd. traitant Confirmation si aspect ANA avec aspect pore-nucléaire avec aspect dot nucléaire Remplacement AMA? M2?

56 Sclero-Poly-Synthetase SPS-MI2

57 Antigènes à disposition c. pos JO-1 PL7 PL12 Histidyl-ARNt-synthétase Thréonyl-ARNt-synthétase Alanyl-ARNt-synthétase SRP Mi-2 anti- «hélicases» Ku PMScl Scl70 c.nég Sordet, C. et al. (2006) Revue du rhumatisme 73:

58 Rôle des ARS Figure 79. Diagram showing amino acids linked to trna with the assistance of trna synthetase.

59 SRP Signal Recognition Particle Figure 53. Signal recognition particle pattern. Complexe ribonucléoprotéine de 6 polypeptides Myopathie inflammatoire idiopathique

60 Mi-2 Dermatomyosite

61 Divers aspects cytoplasmiques sur cellules Hep-2 des anti-synth. Anti-Jo 1 Anti-SRP Anti-PL12

62 Divers aspects nucléaires sur cellules Hep-2 Anti-Ku Anti-Mi2

63 Evaluation dot SPS Scl-70 positif par ELISA (n=12) 12 dot pos / 12 scl-70 5 PmScl dot pos Aspect Hom-nucléol., ELISA nég (n=21) 3 PmScl dot pos Moucheté (non confirmé) (n=22) 0 dot pos /22 Cytoplasme (non confirmé) (n=23) 1 SRP dot pos 1 Jo-1 dot pos

64 Utilisation du dot SPS Pas à réaliser systématiquement en dépistage Dot pas nécessaire si pas de suspicion clinique A proposer si : - IFI >1:640 et ELISA nég - Cytoplasme pos

65 Rappel La présence d auto-anticorps n a pas de signification en dehors d un contexte clinique Un contexte clinique évocateur doit faire suspecter une maladie auto-immune même en l absence d auto-anticorps ou de la totalité des critères généralement admis Une constellation auto-immune peut «changer de présélection» ou se «compléter» au cours de son évolution

66 Take Home Message Les techniques évoluent : - multiplications des tests - améliorations des tests Test complémentaire test de confirmation Niveau de complexité augmente: - choix - interprétation

67 Présence d un anticorps qui n a pas de spécificité trouvée

68 Adresses internet utiles Site des laboratoires du DPML : Site du Service d immunologie et allergie : Vincent.Aubert@chuv.ch