Physiologie bactérienne appliquée à l identification

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1 Microbiologie Biologie des µorganismes Physiologie bactérienne appliquée à l identification!bactéries procaryotes 2 groupes taxonomiques eubactéries archées!levures, moisissures, champignons (mycètes)!algues!protozoaires (amibes, parasites) eucaryotes inférieurs (protistes) Sophie Bleves bleves@imm.cnrs.fr Comment observer les bactéries? Microscopie optique c épithéliales (35!m) GR (8!m) Bactéries (1!m) Virus (10-100nm) b sur 1 mm Etat frais Fixation Coloration Bleu de méthylène - microscopie optique (G fois) - microscopie électronique (G > fois) bactéries d un frottis de yaourt Contraste de phase Encre de chine! E. coli Acinetobacter (cocci isolés ou en chaîne entourés d une capsule)

2 Formes différentes selon les espèces Coloration de Gram coques bacilles sprirales épaisse couche de PG fine couche relâchée de PG (7 à 8 nm) dans le périplasme membrane externe sphériques bâtonnets fuseau Peptidoglycane: réseau de longues chaînes polysaccharides pontées par peptides incurvées Coloration de Gram épaisse couche de PG fine couche dans le périplasme relâchée membrane externe Gram - Gram Mb externe (bicouche asymétrique phospholipides et LPS) Peptidoglycane Périplasme Membrane plasmique (bicouche symétrique de phospholipides) ou Mb interne

3 Autres colorations Microscopie électronique Coloration spores (vert de malachite, contre coloration fushine) Bacillus thuringiensis Coloration flagellaire (Leifson, fuschine basique) Vibrio Microscopie électronique à balayage E. coli x Microscopie électronique à transmission E. coli Identification de bactéries Identification de bactéries Echantillon > Identification? Echantillon - biologique (sang, urines...) - eaux - aliments - environnement - Enrichissement Isolement Identification (culture pure) Il existe de nombreuses espèces bactériennes, qu on peut classer d après quelques critères fondamentaux : - morphologie des colonies - forme & taille des cellules - coloration GRAM - quelques caractères biochimiques simples d orientation - mode respiratoire - mobilité

4 Les milieux de culture Croissance et maintien des µorganismes en laboratoire - aliments essentiels (acides aminés, peptides, bases nucléiques, sucres ), - éléments minéraux : fer, phosphore, soufre, magnésium,... -facteurs de croissance (sang, protéines, vitamines) Système tampon pour éviter les variations importantes du ph Milieu liquide ou semi-solide ou solide (agar) 1-milieux complexes (ou riches) : composition chimique inconnue (croissance de la plupart des µorganismes) peptones (hydrolysats de protéines à partir digestion viande, caséine, soja, gélatine...) = source C et énergie ex LB (Luria Broth), bouillon au soja 2-milieux synthétiques (ou minimums) composés chimiques purs (phosphate, azote, soufre...) en solution dans l eau ex milieu M9 Une espèce dans l échantillon 1- Enrichir Plusieurs espèces dans l échantillon 1- Isoler la bactérie d intérêt 2-Enrichir Morphologie des colonies Couleur Aspect (sec, gras, transparent ) --> Morphologie des colonies

5 Les types de milieux de culture La température peut être sélective Milieux solides pour l isolement liquides pour culture de bactéries pures ou lors d infection monoµbienne!: bactéries incultivables (Mycobacterium leprae: intracellulaire obligatoire) 4 C 37 C 60 C Serratia marcescens E. coli Bacillus stearothermophilus 1- milieux sélectifs empêchent la croissance de certaines bactéries et favorisent la croissance de celles d intérêt = SELECTION ex Antibiotique Drigalski (cristal violet) : croissance G- SS (sels biliaires) : croissance Salmonella, Shigella Chapman (75% NaCl) : croissance Staphylococcus Mésophiles Thermophiles Extrêmophiles Pshycrophiles E. coli et Proteus mirabilis (Drigalski) S. aureus (Chapman) Antibiogramme (inhibition croissance) Les types de milieux de culture 2- milieux différentiels: distinction de différents groupes de bactéries (caractéristiques biologiques) = IDENTIFICATION Mee propriétés biochimiques d'une bactérie pour commencer à l'identifier: étude du métabolisme respiratoire, des glucides, des protéines, des lipides... Utilisation du Lactose MacConkey utilisation --> "ph (indicateur coloré, rouge neutre) test catalase (addition H 2 O 2 ) : dégagement H 2 milieu jaune d oeuf!: hydrolyse des lipides E. coli - test uréase!: Production NH3 --> "ph (indicateur coloré, rouge de phénol) E. coli - Proteus vulgaris Caractère fermentaire (2 &3) ou oxydatif (1) Dégradation Glu -->déchets acides (indicateur de ph, rouge de phénol) Production soit de CO 2 soit de CO 2 et H 2 (insoluble) Bacillus gélose au sang!: bactéries hémolytiques ou non Lac (colonies rouges) Alcaligenes - mobilité (0,5% agar) E. coli - S. aureus Lac - (colonies incolores) Fermentation - - Production H

6 Effet de l oxygène Tests d identification en microméthode Galerie API20-E (Biomérieux) - activité fermentaire est révélée avec un milieu type contenant un sucre, un indicateur coloré des changements de ph (fermentation sucre " ph) O 2 O 2 Effet de l O 2 Exemples Aérobie strict (1) Microaérophile (3) Aéro-anaérobie facultatif (2) Accepteur final d électrons lors respiration aérobie (réduit en eau) Nécessaire à < 0,2 atm (PP < celle air) Pas nécessaire, mais utilisé (switch) (oxydation des substrats et fermentation) Pseudomonas, Acinetobacter, Neisseria Campylobacter, Mycobacteriaceae Entérobactéries (Escherichia, Salmonella), streptocoques, staphylocoques - milieux de culture dont la composition permet de mee une activité enzymatique: ß- galactosidase (ONPG), lysine décarboxylase (LDC), ornithine décarboxylase (ODC), uréase (URE) Anaérobie aérotolérant Pas nécessaire, non utilisé (fermentation) Anaérobie strict (4) - Toxique (fermentation, respiration anaérobie, photosynthèse) Culture sous atmosphère réductrice Bactéries intestinales (Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium) et flore commensale Systèmes automatisés Identification de bactéries plus sensibles mesures photométriques en continu --> identification des principales bactéries isolées en pratique médicale en moins de 5 h Echantillon - biologique (sang, urines...) - eaux - aliments --environnement Enrichissement Isolement Identification sur culture pure caractères morphologiques caractères physiologiques et métaboliques caractéristiques moléculaires : - composition en bases des AN (GC%) - amplification-séquençage gène codant ARN16S (phylogénie moléculaire : appareils de traduction sont très conservés, non échangés par transferts horizontaux) - comparaison de protéines (séquençage, Ac)

7 Caractères biochimiques simples Thiobacillus Agrobacterium G- 12 groupes de bactéries Enterobacteria Pseudomonads Desulfovibrio Helicobacter G Catalase ( ou -) Oxydase ( ou -) Coagulase ( ou -) Indole ( ou -) Utilisation des sucres (fermentation on non) Activité enzymatique ou non (uréase, gélatinase, nitrate réductase ) Production d H 2 S.. Tous ces caractères permettent d obtenir une identification de plus en plus précise, et finalement exacte de la bactérie Gram Gram- Proteobacteria Gram Coques Gram Commensaux (peau, muqueuses, tube digestif) En amas : Staphylocoques (grappe de raisins) En chaînettes: Streptocoques, entérocoques Staphylococcus aureus (supuration, septicémie) En diplocoques: Pneumocoques Streptococcus pyogenes (angine, scarlatine) Streptococcus pneumoniae (otite, pneumonie, méningite)

8 Bacilles Gram Listeria monocytogenes (méningite, avortement) Gram - Clostridium difficile (diarrée post antibiotique) Bacillus anthracis (maladie du charbon, herbivores transmissible à l homme) Coques Gram - Gram - Neisseria meningitidis (méningocoque: méningite, septicémie) Entérobactéries Neisseria gonorrhoe (gonocoque, MST)

9 Bacilles Gram - 2 familles importantes en pathologie humaine : Les entérobactéries (Enterobacteriacae) Les Pseudomonas (Pseudomonacae) Autres genres importants en pathologie humaine Mycobactéries Bacilles acido-alcoolo résistants ou «BAAR» Gram impossible --> coloration : Ziehl Nielsen E. coli - commensal (infection urinaire) - ETEC, EHEC, EIEC (gastro, speticémie) Salmonella (infection digestive simple à fièvre thyphoïde) Shigella dysenteriae (infection digestive mineure à grave- Yersinia pestis Pseudomonas aeruginosa Burkholderia Pathogènes opportunistes (infections nosocomiales et mucoviscidose) Mycobacterium tuberculosis (bacille de Koch) Mycobacterium leprae Vibrio cholerae (eau, épidémie Choléra) Bordetella pertussis (coqueluche) Spirochètes Treponema pallidum (syphilis) Borrelia burgdorferi (maladie de Lyme, morsure tique) Germes intracellulaires : exemples Mycoplasma pneumoniae Chlamydia pneumoniae Chlamydia trachomatis (MST) Rickettsia conorii (fièvre boutonneuse-tiques-) Rickettsia typhi (typhus -puces et poux) Bartonella henselae: maladie des griffes du chat