Recuperation de l infection virale

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1 Recuperation de l infection virale Lors des infections la quantité de virus décroit après être passée par un maximum dans certains cas le virus devient indétectable dans les nouveaux organes (feuilles) formés au cours de l infection -> la plante récupére (recovery) Ces nouveaux organes ne sont pas sensibles à la réinfection->mise en place d un mécanisme de défense Si l on introduit un fragment du génome d un virus donnant lieu a récupération (ex: népovirus, ARN+) dans un autre virus ARN + vecteur (potexvirus, Potato Virus X) -> la plante ne peut pas être infectée par le PVX recombinant. -> la résistance est liée a la détection de l ARN du virus qui a initié l infection X Génome viral (PVX) recombinant Népovirus Des plantes transgéniques exprimant un gène correspondant a un génome viral peuvent être résistantes au virus ou montrer un phénoméne de récupération Des plantes transgéniques exprimant un gène similaire a gène résident peuvent montrer une co-inactivation des deux gènes Des transgénes peuvent aussi être inactivés Dans tous les cas on montre que les gènes nucléaires sont transcrits L inactivation résulte d une dégradation post-transcriptionnelle des ARNs ARN viral ARNm ARNm transgène transgène gène Post transcriptional gene silencing (PTGS) 1

2 Le PTGS et la résistance au virus médiée par l ARN ont des mécanismes identiques (English et Baulcombe, 1996) -Plante porteuse d un (trans)gène GFP (marqueur visuel) inactivé: infection par un virus recombinant porteur d une séquence GFP -> Résistance au virus -La résistance dépend de la présence de GFP dans le génome viral -Tous les ARNs (viraux ou cellulaires) porteurs d une séquence homologue a GFP sont reconnus et supprimés.. GFP ARNm ARN viral Transgénique GFP (supprimé) transgène On détecte des petits ARN double brin (20-25 nucléotides) correspondant aux gènes inactivés et aux génomes viraux au cours de la récupération(hamilton et Baulcombe 1998) 2

3 RNA silencing: Inducteurs ARNs double brin (Trans)gènes en inversion répétée: Transgènes sous contrôle d un promoteur endogène ARN viraux (intermédiaire de réplication double brin) Virus a ADN (Geminivirus)?? Transcription bidirectionnelle?? (Trans)gènes produisant des ARNs aberrants??? Mécanisme du RNA silencing méthodes d analyse Génétique: recherche de mutants suppresseurs du silencing d un transgène -> clonage des gènes correspondants Biochimique: identification, purification des molécules impliquées, intermédiaires et produits de dégradation, enzymes. Systéme conservé chez de nombreux eucaryotes (plantes, drosophile, C. elegans, vertébrés, Neurospora, S. Pombe (Pas S. cerevisae!) ATP dep RNA helicase DNA helicase, RNAse de type III, Dicer Ds RNA binding, Argonaute, (domaines PAZ/PIWI) RNA polymérase RNA dépendante 3

4 Le cas de la ARN polymérase ARN dépendante chez plantes saines (non-virosées) (Astier-Manifacier et Cornuet, 1971) «dogme» de la BM: pas de nécessité de RNApRNAdep! Activée par l infection virale Synthése d ARN de petite taille, complémentaires de la matrice fournie Canulase? Purifiée en 1993, clonée en 1998 Correspond a une mutation suppresseur de RNA silencing (2000) fonction? Le silencing d un gène se transmet du porte-greffe vers le greffon =>Propagation d un signal diffusible et spécifique de séquence Explication du mécanisme de la récupération: Le RNA silencing est activé localement par l infection virale, l infection se propage dans la plante en même temps que le signal. Si le signal atteint les nouveaux organes avant le virus, les complexes de RNA silencing sont mis en place lorsque le virus arrive =>la plante récupére Nature du signal?? (probablement small RNA) Le signal doit être amplifié d ou nécessité de RNAdRNAp? (Palauqui et Vaucheret, 1997) 4

5 Amplification des sirna par RpRd (Lipardi, 2001) ARN cible sirna SB ARN inducteur DB RNApolRNAdep RNAse III, Dicer hélicase primer > 39 bp amplification RNAse III, Dicer ATP Short interfering RNA (sirna DB) Les mutants sgs d Arabidopsis sont plus sensibles aux virus Non-infecté Infecté par virus de la mosaïque de concombre (CMV) Non-infecté Sauvage Mutant SGS A B C D 5 fois plus d ARN viral dans mutant sgs que ds Wt Infecté par virus de la mosaïque de concombre (CMV) 5

6 Nicotiana Benthamiana une plante naturellement sensible a de très nombreux virus, posséde une mutation dans un gène codant une RdRp Des gènes de RdRp sont activés par l acide salicylique -> Relation RNA silencing/ résistance systémique acquise Suppression du PTGS par des infections virales Transgène GFP inactivé La plante fluoresce rouge en UV (chlorophylle) Inoculation avec le virus PVY (virus Y de la pomme de terre) Réversion du silencing, la plante fluoresce vert en UV (GFP) 6

7 Des protéines virales inhibent le PTGS X Plante transgénique GUS silencé Plante transgénique Protéine HC-pro des potyvirus Test GUS Contrôle croisé avec plante wt Contrôle croisé avec mutant HC-pro Protéines virales inhibant la mise en place ou la propagation du RNA silencing 7

8 RNA silencing et chromatine: mutations de Dicer, Argonaute et RdRP dérépriment la transcription de l hétérochromatine centromérique chez Schizosaccharomyces pombe L hétérochromatine doit être active pour être inactivée!!!!!!! RNA silencing et développement Expression constitutive de protéines virales inhibant la PTGS perturbe le développement P1/HC-Pro de Turnip mosaic virus (TuMV) Hypothèse anomalies developpementales dans les mutants Dicer Schauer, 2002, Trends Plant Science Des gènes intervenant dans le développement et dans la physiologie sont régulés par RNA silencing 8