Electrophorèse sur support

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1 1 Manipulation N 5 Electrophorèse sur support 1. BUT DE LA MANIPULATION: Déterminer le point isoélectrique d un acide aminé par électrophorèse. Détermination de la mobilité des cations minéraux Ag et Cu PRINCIPE: On appelle électrophorèse, la migration d'une substance dissoute ou en suspension dans un solvant sous l'action d'un champ électrique. Elle peut avoir lieu en phase liquide ou sur un support imprégné d'un électrolyte support convenablement choisi. L'électrophorèse peut être utilisée à des fins de chimie préparatrice ou analytique, et dans ce dernier cas, à des buts, tant qualitatifs que quantitatifs. Un acide αaminé a la formule suivante: R CH COOH NH 2 Lorsqu'il ne possède qu'une seule fonction de chaque nature. En solution aqueuse, il se présente comme un mélange de différentes formes ionisées: R CH COOH NH 3 R CH COO R NH 2 CH NH 3 COO : cation : anion : zwitterion ou ion hybride, électriquement neutre La forme prédominante et, par conséquent, le sens de migration de l'acide aminé dépendent donc du ph de la solution.

2 2 Chaque acide aminé est caractérisé par son point isoélectrique PI qui correspond à la valeur du ph pour laquelle son transport dans un champ électrique est nul, c'estàdire, le ph pour lequel il est électriquement neutre. On peut donc considérer qu'au point isoélectrique, la molécule est presque totalement dissociée en ions mixtes, produits par migration d'un proton d'une extrêmité de la chaîne à l'autre: R CH COOH NH 2 R CH NH 3 COO Dans le cas étudié (acide glutamique), la molécule présente deux fonctions carboxyliques et un groupement aminé: O C CH 2 CH 2 CH C OH NH 2 O OH Selon le ph de la solution dans laquelle elle sera dissoute, on pourra admettre qu elle existera sous l une des formes prédominantes suivantes: AH 3, AH ±, 2 AH, A Il conviendra donc d envisager les équilibres suivants: AH 3 AH 2 K 3 pk 3 = 2,1 H AH 2 AH K 2 pk 2 = 4,1 H 2 AH A H K 1 pk 1 = 9,5 et de remarquer que si C 0 est la concentration en acide aminé, il vient: 3 C = (AH ) (AH ) (AH ) (A ) 0 2 2

3 3 soit encore: 0 2 K 1 K 2 2 (H ) (H ) C = [AH ] K 2 1 H K 3 ou bien: C 0 2 AH = K 1 K 2 K 2 2 (H ) (H ) 1 H K 3 Le point isoélectrique est le ph pour lequel (AH 2 ± ) prends sa valeur maximale. Dans ces conditions: d(ah 2) = 0 d(h ) et ph iso = 1/2 (pk 2 pk 3 ) L étude de la fonction (AH ± 2 ) = f (H ) permet de remarquer que le point isoélectrique est défini comme le ph pour lequel (AH ± 2 ) est maximum. Détermination de la mobilité ionique : On appelle mobilité d'un ion, la vitesse limite atteinte par cet ion dans un champ électrique unitaire. Si on établit une différence de potentiel entre les extrêmités d'une bande de papier imprégnée par un électrolyte convenable, une goutte de solution contenant l'espèce ionique à étudier étant déposée sur la bande, les constituants ioniques se déplacent sous l'action du champ électrique avec leurs vitesses propres. Les déplacements peuvent être suivis et mesurés après révélation par un procédé approprié.

4 4 Cependant, les vitesses expérimentales déterminées à partir de la mesure du déplacement des ions ne correspondent pas à un déplacement vrai dû uniquement au champ électrique. En effet, le passage du courant dans la bande d'électrophorèse provoque par effet Joule un échauffement du liquide qui se traduit par une évaporation de l'électrolyte d'imprégnation. Or, les deux extrêmités de la bande plongeant dans des bacs contenant cet électrolyte, l'eau qui s'évapore est donc continuellement remplacée par du liquide frais provenant des bacs à électrode. Ceci provoque un courant hydrodynamique dont les effets viennent se superposer à ceux du champ électrique. flux hydrodynamique évaporation sens de migration des cations axe On voit que la vitesse d'entraînement due au flux hydrodynamique peut être soit positive, soit négative, suivant la région de la feuille où la solution à étudier a été déposée. Ainsi, le déplacement des ions dépendra de leur position de départ. De plus, à ce phénomène d'évaporation, vient s'ajouter le phénomène d'électroosmose.toutefois, celuici est constant tout au long de la bande si le champ est bien uniforme et, pour des temps relativement courts, il est très peu important. Donc, en pratique, nous considérons les vitesses d'entraînement électroosmotique comme négligeables. Dans ces conditions, la vitesse expérimentale de déplacement V exp peut être décomposée en deux termes: la vitesse vraie: V vraie la vitesse due aux flux hydrodynamique: V hydro V exp = V vraie V hydro Pour obtenir la vitesse vraie, il sera nécessaire de faire la correction due au flux hydrodynamique. Dans certains cas, on arrive à avoir la vitesse vraie directement par expérience. Ceci est réalisé lorsque le point de départ et le point d'arrivée des ions étudiés sont symétriques par rapport au

5 5 centre de la bande d'électrophorèse. Dans ce cas, les effets du flux hydrodynamique sont égaux et de signe contraire de part et d'autre de l'axe, par conséquent l'effet total est nul. Détermination de la vitersse vraie : Il est possible de déterminer la vitesse vraie par une série de mesures que nous allons décrire. (0) A1 A2 A3 A5 B1 B2 A4 B3 A6 B5 B6 A7 B7 A8 B8 B4 axe de la feuille Considérons une feuille de papier sur laquelle est faite l'électrophorèse. On appelle YY' l'axe de la feuille perpendiculaire du champ électrique. Soient A le point de départ de l'ion étudié, B le point d'arrivée de cet ion après passage du courant. On réalise une série de points A situés à des distances variables de YY', ce qui donne une série de points B. Pour chaque ensemble A et B, considérons la quantité algébrique y = OA OB. Si on appelle x la distance de A à YY', on a: OA = x, OB = OA AB = x D D étant le déplacement de l'ion, variable avec sa position de départ. On a donc: y = 2x D Nous avons vu plus haut que l'on obtenait la valeur du déplacement vrai pour un point de départ symétrique au point d'arrivée par rapport à YY',c'estàdire, en supposant l'axe des x orienté dans le sens du déplacement: x = D/2 Dans ces conditions, la quantité y est nulle. Ainsi, on voit qu'en représentant la variation de y = f(x), on obtient pour y = 0, une valeur de x qui est égale au demidéplacement vrai changé de signe.

6 6 Le résultat obtenu par électrophorèse sur support est généralement inférieur à la valeur obtenue en phase homogène, car le papier comporte des canaux qui ne sont pas parallèles à la normale à l'axe de la feuille. De sorte que le chemin mesuré l est inférieur au chemin parcouru l par l'espèce ionique étudiée. On peut caractériser chaque type de papier pour électrophorèse par un coefficient de tortuosité (l'/l > 1) ou un coefficient de sinuosité (l'/l < 1) que l'on peut déterminer expérimentalement par une technique appropriée. 3. EXPERIENCE: 3.1 Détermination du point isoélectrique d un acide aminé Par des mesures de mobilité, on peut atteindre la valeur du point isoélectrique. En effet, il suffit de déterminer la mobilité d un acide aminé à différents ph et de tracer la courbe mobilité en fonction du ph et de remarquer que la mobilité s annule pour ph: isoélectrique. La mobilité est ici mesurée par électrophorèse sur papier. On utilise une cuve à 5 compartiments constituée, en fait, par 5 cuves d électrophorèse montées en parallèle. On prépare 5 bandes de papier de 42 cm de long sur 5 cm de large. On trace au crayon la ligne yy (milieu de la bande) et les séries de lignes A de 3 mm de large et situées à 6, 4, 2, 0, 2, 4, 6 cm de la ligne yy.

7 7 Les feuilles de papier sont placées dans les différentes cuves en amenant la ligne yy au milieu de la cuve. Chaque bande est imprégnée d une solution tampon dont on mesure le ph. On ne remplit au début qu un seul compartiment de chaque cuve. Quand la bande est imprégnée sur toute sa longueur, on équilibre alors le niveau des compartiment anodique et cathodique.

8 8 On dépose ensuite 1 µl de la solution d acide glutamique (0,03 M dans l eau) sur chaque A.

9 9 On applique 300 V pendant 90 minutes aux bornes de la cuve d électrolyte. Avant la fin de l opération, relever la tension aux extrémités du papier sur lequel on repère les marques des sondes afin de déterminer par la suite la valeur du champ électrique moyen imposé (E = U/L). Après 90 minutes d électrophorèse, les bandes sont sorties de la cellule et sont mises à sécher à plat à l étuve (80 C pendant 20 minutes). Pulvériser en surface le réactif à la nihydrine et repporter à l étuve à 80 C pendant 5 minutes.

10 Résultats Tracer la courbe mobilité = f(ph). En déduire la valeur du point isoélectrique de l acide glutamique dans les conditions expérimentales. 3.2 Détermination de la mobilité des ions Ag et Cu 2 : Préparer une bande de papier de la largeur de la cuve d'électrophorèse et de 40 cm de long. Tracer au crayon la ligne YY' et les séries de lignes A de 1 cm de large. Mettre la bande à imprégner dans la cuve que l'on remplira d'un seul côté de solution support KNO M. Lorsque cette opération est terminée, on place la feuille de manière à ce que la ligne YY' soit exactement au milieu de la cuve.

11 11 On équilibre alors les niveaux des compartiments anodique et cathodique afin d'éviter les flux hydrodynamiques dus aux différences de niveau. On dépose alors 5 µl de solution à étudier (Ag et Cu 2 ) sur chaque tracé A et on applique la tension aux bornes de la cuve (150 V pendant 40 min). A la fin de l'expérience, on mesure le champ V/L dans la bande. On retire la bande d'électrophorèse et on révèle les nouveaux emplacements des ions étudiés. On révélera par des vapeurs de H 2 S audessus d'une solution aqueuse de sulfure d'ammonium Résultats : Après avoir donné la réaction de révélation, calculer le déplacement vrai et, à partir de ce résultat, calculer la mobilité des ions Ag et Cu 2 sur le papier considéré (unité: cm 2.V 1.S 1 ). Donner la précision des résultats. Comparer les mobilités avec les valeurs données dans les tables de constantes. Estil normal que Ag soit plus mobile que Cu 2? Pourquoi?

12 12 Données des tables: Conductivités équivalentes limites (en Ω 1.cm 2 ) Cu 2 Ag 18 C 25 C 43,5 56,6 53,5 61,9