COFFRET D IDENTIFICATION DES MYCOPLASMES

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1 URBM/MON/Id.MYCO REDACTEURS VERIFICATEUR Amadou DIOP Abdoulaye DIOP Dr Fatou Bintou GUEYE GBAYA Amy SYLLA Version : Date : 26/08/2013 APPROBATEUR Pr Cheikh Saad-Bou BOYE

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3 Sommaire 1. OBJECTIF PRINICIPE MATERIELS Réactifs MODE OPERATOIRE Préparation des milieux Contrôle de qualité des milieux Préparation des plaques Conditionnement Contrôle de qualité du produit fini Stockage ANNEXES... 7 URBM/MON/Id.Myco / Date d application : Décembre 2013 / Version : 3

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5 URBM/MON/Id.Myco 1. OBJECTIF Ce document décrit la procédure de production du coffret d identification des mycoplasmes par la galerie Micro CSB. 2. PRINICIPE Il s agit d une méthode miniaturisée standardisée permettant à partir de substrats déshydratés de mettre en évidence des activités enzymatiques ou d assimilation de substrats carbonés. Il permet de faire un diagnostic de genre ou d espèce avec 16 tests biochimiques. 3. MATERIEL balance de précision agitateur magnétique ph-mètre flacons en verre avec bouchon à vis de 2, 50 et 100 ml seringues filtres de 0,2 μm de diamètre erlenmeyer embouts stériles micro pipettes autoclave boîte de pétri de 4 ou 6cm de diamètre hotte à flux laminaire papier emballage appareil de scellage micro plaques micro pipettes de 20 μl, 200 μl pipette Pasteur embouts stériles étuve films adhésifs bec bunsen microscope optique 4. RÉACTIFS Bouillon PPLO Extrait de levure Sérum de cheval Isovitalex ou PVS VCN Eau distillée Urée Rouge de phénol Arginine PPLO Agar base Mycoplasme Glucose Chlorhydrate de cystéine Pénicilline ( U/ml) 5. MODE OPERATOIRE 5.1 Préparation Milieux - Milieu de base - Bouillon A3 : milieu de conservation et de transport - Bouillon Arginine : milieu d isolement et d identification de Mycoplasma hominis - Bouillon Urée : milieu d isolement et d identification Ureaplama urealyticum - Gélose A7 : milieu d isolement des mycoplasmes 5.2. Contrôle de qualité des milieux Contrôles Urée : - Pendre des tubes secs - Mettre 1ou 2ml d urée - Préparer un inoculum de souche de contrôle positif (Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis) comme négatif (Escherichia coli) - Incuber à l étuve à 37 C pendant 24h LECTURE Souches de contrôle Contrôle positif Contrôle négatif Klebsiella pneumoniae, + Proteus mirabilis + Escherichia coli - URBM/MON/Id.Myco / Date d application : Décembre 2013 / Version : 5

6 URBM/MON/Id.Myco Contrôles Arginine - Pendre des tubes sec - Mettre 1ou 2ml d urée - Préparer un inoculum de souche de contrôle positif (Enterococcus feacalis Mycoplasma hominis) comme négatif (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae) LECTURE Souches de contrôle Contrôle positif Contrôle négatif Klebsiella pneumoniae, - Enterococcus feacalis + Escherichia coli - Mycoplasma hominis Préparation des plaques Si les plaques ne sont pas déjà stérile au départ, faire le lavage et la stérilisation des plaques de travail Lavage - Après les 24 heures, rincer avec de l'eau 2 fois de suite - Tremper les plaques dans de l'alcool à 70 pendant 24 heures - Sécher au four pendant 1 heure Stérilisation - Placer les plaques sèches sous UV pendant 24 h 5.4 Conditionnement Distribution dans les flacons Les milieux A3, Urée, Arginine ainsi constitué a été réparti dans des flacons étiquetés sous un volume de 2 ml et conservé à + 4 C pendant 3 semaines ou - 20 C pendant un an Emballage Les microplaques stériles sont ensuite emballées dans des sachets stériles puis sont scellé à l aide d un appareil de scellage. 5.5 Contrôle de qualité du produit fini Contrôle de stérilité Pour faire le contrôle de la stérilité des lots d urée, d arginine et du milieu de Transport A 3, on prend 2 à 3 lots de ces milieux. Technique - Inoculer les cupules renfermant les milieux Urée et Arginine avec de l eau physiologique stérile. - Recouvert la plaque d un parafilm et incubé à l étuve à 37 C pendant 24h sur plateau recouvert de papier buvard imbibé d eau. Le lot est considéré comme stérile en l absence de virage de l indicateur et en l absence de réaction positive pour les tests révélés Contrôle d efficacité Le test permet de voir si le milieu ne s est pas dégradé au cours de la déshydratation. De ce fait, pour chaque caractère biochimique (milieu), une souche de contrôle a été choisie comme témoin positif et une autre comme témoin négatif. Technique - Des souches de contrôle M. hominis et U urealyticum ont été testé sur les milieux A3, Urée, Arginine. Après mélange et homogénéisation de la souche correspondante dans le contenu du milieu de transport (A3) avec une densité comprise entre [0,8-1,3] Mc Farland. - 20μl sont inoculés dans chaque première cupule et pour chaque type de bouillon, puis, 20μl de chaque premier puits est introduit dans le second puits. - Les microplaques sont ensuite recouvertes d un film adhésif et incubées à 37 C sur un support 6 URBM/MON/Id.Myco / Date d application : Décembre 2013 / Version :

7 URBM/MON/Id.Myco humide (papier buvard imbibé d eau) afin d éviter la déshydratation du contenu des puits. - La lecture est effectuée au bout des temps d incubation respectifs t=24h, t=36h pour M. hominis t=12h et t=16h U. urealyticum ; en cas de réaction négative une ré incubation est effectuée pendant 24h supplémentaires pour une deuxième lecture. Souche Urée Arginine M. hominis - + U. urealyticum Stockage Après validation du contrôle de stérilité et d efficacité des plaques d identification des Mycoplasmes, le reste du lot de la production déjà scellé est stocké au réfrigérateur à 4 C. MILIEU DE BASE PPLO USAGE C est un milieu de base pour la préparation du bouillon PPLO Urée, du bouillon PPLO arginine, du bouillon PPLO A 3 et de la gélose A 7. COMPOSITION - Pour un flacon de ml - Bouillon PPLO g - Eau distillée ml BOUILLON A3 USAGE C est un milieu de transport et de conservation des prélèvements génitaux. COMPOSITION ET PRÉPARATION Pour un flacon de 100 ml : BOUILLON URÉE USAGE C est un milieu pour l identification de U. urealyticum COMPOSITION ET PRÉPARATION - Pour un flacon de ml - Milieu de base PPLO... 80ml - Sérum de cheval... 10ml ANNEXE 1 ANNEXE 2 ANNEXE 3 PRÉPARATION - Chauffer le mélange sous agitation fréquente et laisser bouillir pendant une minute de manière à dissoudre parfaitement la poudre. - Ajuster le ph entre Mettre à l autoclave à 121 C pendant 15 minutes. A la fin du cycle, laisser refroidir jusqu à 60 C. - Milieu de base PPLO ml - Sérum de cheval... 20ml - Extrait de levure 10% ml - Polyvitex ou PVS... 1ml - VCN ml Homogénéiser le mélange puis le filtrer dans un flacon de 100 ml stérile. - Extrait de levure 10% ml - VCN ml - Polyvitex ou PVS... 1ml - Urée 10%... 1ml - Rouge de Phénol 1% ml Homogénéiser le mélange puis le filtrer dans un flacon de 100 ml stérile. URBM/MON/Id.Myco / Date d application : Décembre 2013 / Version : 7

8 BOUILLON ARGININE USAGE C est un milieu pour l identification de Mycoplasma hominis. COMPOSITION ET PRÉPARATION - Pour un flacon de ml - Milieu de base PPLO ml - Sérum de cheval ml GELOSE MYCOPLASMA A7 USAGE Ce milieu permet l isolement de Mycoplasma hominis et U. urealyticum. COMPOSITION ET PRÉPARATION - Milieu PPLO Agar Base - PPLO Agar Base... 34g - Eau distillée m l Chauffer le mélange sous agitation fréquente et laisser bouillir pendant une minute de manière à dissoudre parfaitement la poudre. Répartir ensuite le mélange dans des flacons de 150 ml sous un volume de 80 ml. Mettre à l autoclave à 121 C pendant 15 minutes. A la fin du cycle, laisser refroidir jusqu à 60 C. COFFRET D IDENTIFICATION URBM/MON/Id.Myco ANNEXE 4 ANNEXE 5 - Extrait de levure 10% ml - VCN... 1ml - Polyvitex ou PVS... 1ml - Arginine à 20%... 1ml - Rouge de Phénol 1% ml Homogénéiser le mélange puis le filtrer dans un flacon de 100 ml stérile. MILIEU COMPLET Milieu de base PPLO Agar... 80ml Sérum de cheval... 20ml Extrait de levure à 10%... 1ml Urée à 5%... 2ml Arginine à 10%... 1ml Glucose à 5% ml Chlorhydrate de cystéine à 4% ml Pénicilline U/ml ml Isovilatex ou PVS... 1ml Mélanger doucement pour éviter l incorporation des bulles d air. Répartir dans des boîtes de pétri de 4 cm de diamètre à raison de 4 ml par boîte ou dans des boîtes de 6 cm de diamètre à raison de 10 ml par boîte. Laisser sécher, puis conserver à +4 C dans des sacs en plastique scellés 8 URBM/MON/Id.Myco / Date d application : Décembre 2013 / Version :

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