Structure des acides nucléiques (AN)

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1 Structure des acides nucléiques (A) 1- Structure des nucléotides 1.1- Constituants élémentaires 1.2- ucléosides 1.3- ucléotides 1.4- Liaison phosphodiester 2- Structure spatiale de l AD 2.1- Composition en bases 2.2- La double hélice 2.3- Structure tertiaire 2.4- Compaction de l AD rganisation de l AD des virus rganisation de l AD des bactéries AD mitochondrial rganisation de l AD des eucaryotes 3- Acides ribonucléiques 3.1- Structure 3.2- Différents types d AR 4- ropriétés des acides nucléiques 4.1- Solubilité 4.2- Absorption dans l U.V. : effet hypochrome et effet hyperchrome 4.3- ydrolyse des acides nucléiques 1

2 Structure des acides nucléiques (A) A = macromolécules présentes dans toutes les cellules vivantes soit libres, soit combinés à des protéines A = polymères constitués d unités appelées nucléotides une base hétérocycle azotée, un pentose, un groupement phosphate, Selon pentose deux types d A : AD ou DA contenant du désoxyribose double hélice = support de l information génétique (information nécessaire à la synthèse des protéines) AR ou RA contenant du ribose généralement un seul brin, copies de fragments d AD. Dogme central de la biologie moléculaire L équation «un gène = une protéine» a évolué car un gène peut être composé de plusieurs séquences, les exons qui codent et les introns qui ne codent pas. L AR produit peut alors subir un épissage alternatif conduisant à plusieurs protéines à partir d un même gène. ouvelle équation : «un gène + des régulations + l épissage = une ou plusieurs protéines». Découverte de régulations dues aux facteurs épigénétiques, protéines régulatrices, structure des histones... 2

3 1- Structure des nucléotides : constituants de base pentose groupement phosphate base hétérocycle azotée entoses C 2 C D-ribose -2-désoxy-D-ribose hosphate C 2 liaison ester -D-désoxyribose -phosphate Les bases azotées dérivent toutes de deux bases hétérocycliques : la purine et la pyrimidine urine yrimidine 1 C 2 6 C 5 7 C 8 C C C 5 C 2 6 C C 1 Adénine Guanine Uracile Thymine Cytosine 2 C A G 2 U 3 C T 2 C 3

4 Bases mineures ou bases modifiées dans l AD ou AR 5-methyl-cytosine 6-methyl-amino-adénine 5,6-dihydro-uracile 2 C 3 Signal de régulation de l expression des gènes 3 C ermet aux enzymes de restriction de la bactérie de reconnaître son AD Dérivés hydrogénés ou soufrés des dans les AR Bases mineures d intérêt biologique roduits à usage pharmacologique : caféine (stimulant du système nerveux), théobromine et théophylline (stimulants cardiaques, relaxant des muscles lisses) 3 C C 3 3 C 3 C C 3 C 3 caféine 1,3,7-tri-methyl-xanthine C 3 théophylline 1,3-di-methyl-xanthine théobromine 3,7-di-methyl-xanthine Analogues de synthèse Molécules de marquage en biologie moléculaire : 5-bromouracile Agents thérapeutiques entrent en compétition avec les bases naturelles : bloquent la multiplication des bactéries Antitumoraux ; Antiviraux (acyclovir = dérivé de la guanine) 4

5 ucléosides Condensation d un pentose avec une base nucléique par une. liaison -osidique. La liaison implique le carbone C1 du pentose et : pentose nucléoside base azotée L azote 1 des pyrimidines u l azote 9 des purines cytosine C adénine 9 C C desoxy- -D-ribose 2'-désoxy-cytidine -D-ribose adénosine ucléotides Les nucléotides = esters-phosphates de nucléosides. La phosphorylation se fait le plus souvent en position 5 du pentose (ribose 5-, désoxyribose 5-). (phosphate) n pentose nucléotide-n- nucléoside base azotée Liaison ester C 2 C 2 1' Adénosine triphosphate (AT) 2 C C 2 1' Les quatre désoxynucléotides triphosphates ou dt (dat, dgt, dct et dtt) servent de précurseurs dans la biosynthèse de l AD. Les 4 ribonucléotides triphosphates ou T (AT, GT, CT, UT) sont des précurseurs des AR. Ils jouent aussi un rôle important à l état libre dans les cellules (le plus connu est l AT). 5

6 Liaison phosphodiester Les A sont des polymères de nucléotides reliés entre eux par des liaisons phosphodiester entre le carbone 3 d un nucléotide et le carbone 5 du nucléotide suivant. Ces liaisons donnent un sens à la molécule d acide nucléique avec une extrémité 5 libre et une extrémité 3 libre. ar convention : Le début est le nucléotide dont le phosphate en C5 est libre La fin correspond au nucléotide dont la fonction alcool en C3 n est pas estérifiée ATGCTC extrémité libre : nucléotide 1 C 2 liaison phosphodiester 1' C 2 extrémité libre : nucléotide n B1 B2 1' C 2 B3 1' Représentations simplifiées de polymères 5 Ribonucléotide Désoxyribonucléotide Exemple d une séquence d AD Base Base Base Base 1 1 ou ou A T C G G C A Structure spatiale de l AD Composition en bases (CARGAFF 1940 ) : le nombre de purines est toujours égal au nombre de pyrimidines : les fractions molaires des bases sont telles que : [ur] = [yr] ou [A] + [G] = [T] + [C] [A] = [T] et [G] = [C] Ainsi, il apparaît une complémentarité par des liaisons hydrogène entre (A et T) et (G et C) hybridation. 6

7 L hybridation entre guanine et cytosine (3 liaisons ) est plus stable que celle adénine-thymine (2 liaisons ). 3 C thymine (T-A) adénine cytosine (C-G) guanine La composition en bases de l AD est caractéristique d un organisme : Toutes les cellules d un même organisme ont un AD de même composition en bases. n caractérise les AD des différentes espèces par la valeur du rapport (A+T) / (G+C). Ce rapport est en général supérieur à un (> 1) chez les animaux et les végétaux. ( E. Coli : 1 ; omme : 1,50 ; Mouton : 1,36 ) A + T G + C avec A = T G = C La double hélice (WATS et Crick 1953) C 2 sens C A T C G C 2 2 C 2 C G C C 2 - T A C sens - 2 C les molécules d AD sont formées de deux chaînes dont les nucléotides complémentaires sont hybridés deux à deux sur toute la longueur ; les deux chaînes sont antiparallèles, c est à dire que l extrémité 5 de l une est du côté de l extrémité 3 de l autre ; les bases azotées liées par les liaisons hydrogènes sont tournées vers l intérieur, tandis que les riboses et les acides phosphoriques, hydrophiles sont tournés vers l extérieur. les charges négatives des groupements se repoussent et provoquent l enroulement en double hélice 7

8 Des protéines forment des liaisons avec l AD au fond des sillons. Structure tertiaire alindromes : mots qui se lisent de gauche à droite ou de droite à gauche : Radar ; Kayak ; été ;.. Séquence d AD pouvant se lire de la même façon dans les deux sens - soit sur le même brin ATTGC CGTTA - soit sur les deux brins AACGTT TTGCAA TTGCAA AACGTT Certains segments d AD palindromiques peuvent produire des structures cruciformes Structures cruciformes AD- (triplex) AD-G4 (quadriplex) brin riche en purines brin riche en pyrimidines rganisation de l AD des virus Conditionnement de l AD AD des virus généralement de taille modeste: double ou simple brin, circulaire ou linéaire ; souvent associée à des protéines qui forment une capside nucléocapside acide nucléique capside matrice protéine de surface enveloppe virale 8

9 rganisation de l AD mitochondrial 4 à 6 molécules d AD bicaténaire et circulaire, composition nucléotidique différente de celle du noyau avec un taux de GC faible. essentiel au bon fonctionnement de ces organite (code pour certaines protéines mitochondriales). dans la plupart des cas il est transmis par la mère. rganisation de l AD des bactéries un ou plusieurs chromosomes d AD double brin généralement circulaire, compacté par surenroulement pour former le nucléoïde attaché à la membrane éventuellement des plasmides : copies d AD double brin circulaire de petite taille. rganisation de l AD des eucaryotes dans le noyau AD associé à des protéines histones formant la chromatine Les histones protéines chargées positivement s associent étroitement à l AD.. Le nucléosome = premier niveau de compaction de l AD composé d AD et d histones (enroulement de l AD : 1,65 tour sur une longueur de 146 pb). Cette structure est ensuite régulièrement répétée pour former le nucléofilament qui lui-même, adopte des niveaux d organisation plus compacts. Le niveau de condensation le plus élevé est atteint au sein du chromosome métaphasique. Chromatine et hétérochroatine L hétérochromatine est une structure qui ne change pas d état de condensation au cours du cycle cellulaire tandis que l euchromatine apparaît décondensée pendant l interphase. Euchromatine - Déroulée - Acétylée - Transcrite étérochromatine - Compacte - ypo acétylée - on transcrite 9

10 3- Acides ribonucléiques AR issus de la transcription des gènes : polymères de ribonucléotides (bases A U G C) longueur variable (en fonction du gène) : de 20b à plusieurs dizaines de kb 2 - C 2 AM GM 2 2 CM UM AR : molécules simple-brin mais très structurées Appariements A-U et G-C formation de structures secondaires : segments «double brin» motifs structuraux définis et reproductibles : boucles internes ; boucles externes ; tiges ; etc. AR de transfert AR ribosomal 10

11 Différents types d AR Les gènes codants sont transcrits en ARm codant pour des protéines ARm : AR messagers de taille très variable (jusqu à plusieurs dizaines de kilobases) assurent le transfert de l information génétique des chromosomes vers le cytoplasme où ils sont traduits en protéines Les gènes non codants sont transcrits en différents types d AR AR ribosomiques ARr entrent dans la composition des ribosomes - ARr 28S, 18S, 5.8S et 5S chez eucaryotes (de 120 à 5000 bases) - ARr 23S, 16S et 5S chez procaryotes ARt : AR de transfert, petites molécules de 70 à 95 bases qui assurent le transport et le positionnement des acides aminés au cours de la synthèse des protéines. Malgré la diversité de leur séquence, tous les ARt ont une conformation en feuille de trèfle AR liés à des protéines formant des R (ribonucléoparticules) snar : «small nuclear» AR (petits AR nucléaires) ont des fonctions variées (épissage, maturation d autres AR, maintien des télomères ) miar : «micro» AR (régulation expression des gènes), et de nombreux autres... Solubilité 4- ropriétés des acides nucléiques Les groupements phosphate donnent un caractère acide à ses acides nucléiques. De ce fait, ils sont solubles dans l eau en formant des solutions visqueuses. Une forte concentration saline (acl 0,15M) empêche la séparation des deux brins de l AD (a + neutralise les charges négatives des groupements phosphate). n obtient la formation de sel d AD ou d AR qui peuvent être précipités par l éthanol, l isopropanol (diminution de l hydratation des molécules et précipitation). Ils sont récupérés sous forme d un long filament translucide (méduse). Absorption dans l U.V. : effet hypochrome et effet hyperchrome Les bases azotées absorbent dans l ultraviolet avec une absorption maximale entre 250 et 270 nm. Cette propriété permet de doser les A à 260nm. AD natif : 1 D = 50 ng/µl Absorbance AD dénaturé (simple brin) AD natif (double brin) 260 Spectre d'absorption d'ad nm 11

12 Effet hyperchrome L AD dénaturé par la chaleur (100 C) ou par l urée ou encore à p très alcalin a une absorption à 260 nm plus élevée que l AD natif : effet hyperchrome ou hyperchromicité. La courbe de fusion (A en fonction de la température) est une sigmoïde dont le point d inflexion définit la température de fusion Tm (melting temperature = 50% de dénaturation) de la molécule. La température de fusion Tm dépend : - de la force ionique du milieu : plus la concentration en ions augmente plus la Tm diminue (en milieu acl>1m). Les ions affaiblissent les liaisons hydrogène, donc la dénaturation est plus facile - de la composition en bases : plus le pourcentage de bases GC est grand, plus la Tm est élevée (plus le nombre de liaisons hydrogène est grand est plus la molécule est stable (dénaturation plus difficile) E.coli G+C = 50% Tm = 65 C. aeruginosa G+C = 68% Tm = 76 C 160% 100% Absorbance chauffage double brin Tm Température simple brin refroidissement rapide refroidissement lent ( C) Après dénaturation de l AD par la chaleur : Quand on refroidit lentement la solution, l AD se «renature» par appariement AT et GC et retrouve sa conformation native Si le refroidissement est rapide, le réappariement est incomplet et l AD est partiellement renaturé chaleur refroidissement lent refroidissement rapide ydrolyse des acides nucléiques La dégradation d un polynucléotide peut se faire par voie chimique ou enzymatique et concerne : l enchainement phosphodiester et les unités nucléotidiques : composants et liaisons osidiques ydrolyse chimique L AD et l AR réagissent différemment au traitement alcalin Traitement chimique AR roduits d hydrolyse AD ydrolyse alcaline ucléosides monophsphate AD intact ydrolyse acide p 1 p 4 entoses + hosphate + Bases azotées Bases puriques + A apuriques Caractéristique utilisée pour éliminer les AR d un milieu sans dégrader l AD. 12

13 ydrolyse enzymatique Les nucléases sont des enzymes qui permettent l hydrolyse des liaisons phosphodiester entre nucléotides (phosphodiesterases spécifiques). n trouve chez les bactéries des endonucléases très spécificiques (recnnaissance de séquences très précises) appelées enzymes de restriction. Les nucléases présentent des niveaux de spécificité et sont classées par : Le mode d attaque de la chaîne : extrémité (exo) ou intérieur (endo) la spécificité vis-à-vis du substrat : AD, AR ou les deux et de la structure, simple ou double brin la spécificité de reconnaissance des sites : bases ou leur enchaînement le type de coupure de la liaison phosphodiester A exo - exo - G Les enzymes de restriction (ER) Les ER sont des endonucléases produites par des bactéries pour se défendre contre les infections par les bactériophages (virus spécifiques des bactéries). Lorsque le virus injecte son AD dans le micro-organisme, celui-ci est coupé par l enzyme de restriction au niveau de ses sites spécifiques, bloquant ainsi l infection. our éviter que l enzyme de restriction ne coupe l AD de son propre génome, la bactérie modifie le site de restriction par méthylation sur un ou plusieurs nucléotides. Les ER hydrolysent l AD à des sites spécifiques de 4 à 6 paires de bases (parfois plus). Deux types de coupure peuvent se produire en fonction des enzymes : - la coupure à extrémités franches dites aussi bouts francs, la coupure a lieu au milieu du palindrome ; - la coupure à extrémités sortantes dites aussi cohésives, on parle aussi de coupures décalées, la coupure a lieu de part et d autre du centre de symétrie. Selon les sites de reconnaissance, on distingue trois types d endonucléases. 1- Enzymes de type I : l enzyme reconnaît un site particulier sans symétrie, et coupe l AD à environ 1000 jusqu à 5000 nucléotides plus loin en libérant plusieurs dizaines de nucléotides. 2- Enzymes de type II : les plus nombreuses et les plus utilisées en génie génétique. Leurs sites de restrictions de 4 à 8 paires de bases sont des séquences palindromiques (se lisent de droite à gauche et inversement : radar). Elles coupent au niveau de leurs sites de restriction. 3- Enzymes de type III : L enzyme reconnaît une séquence mais coupe à une vingtaine de paires de bases plus loin. Exemples d enzymes de restriction ydrolyse par l enzyme de restriction EcoRI Site : GAATTC (coupure débordante) ydrolyse par l enzyme de restriction : aeiii Site : GGCC (coupure franche) 13

14 rincipales méthodes d étude 1- urification d AD 2- Dosage de l AD et contrôle de qualité 3- Enzymes : Couper - Copier Coller 4- Séparation des fragments 5- ybridation moléculaire 6- Southern Blot 7- RFL : Restriction Length Fragment olymorphism 8- Amplification de l AD par CR (olymerase Chain Reaction) 9- CR RFL 10- Séquençage 14

15 rincipales méthodes d étude 1- urification d AD ( Les principales étapes de l extraction d AD peuvent se résumer comme suit Etapes Lyse des cellules nucléées Déprotéinisation Extraction des A récipitation des A Traitement mécanique Lyse par détergent Lyse hypotonique... Traitement par protéinase K Solvants : phénol-chlorophorme Chromatographie par échange ions Alcool Sels 2- Dosage de l AD et contrôle de qualité La quantité et la qualité de l AD extrait sont évalués par spectrophotométrie Dosage à 260 nm : 1D = 50 ng/ml Contrôle qualité par le rapport : = D 260 /D 280 Si 1,8 < < 2 Si < 1,8 Si > 2 AD de bonne qualité trop de protéines trop d AR 3- Enzymes : Couper - Copier Coller Couper Les nucléases permettent l hydrolyse des liaisons phosphodiester entre nucléotides sont des phosphodiesterases spécifiques. Exonucléases (- ou -) ucléases ARases Endonucléases ADases Enzymes de restriction Exonucléases 5 3 ou 3 5 ADase I ; ucléase S1; Endonucléases ARase A (AR) ou (hybride AR/AD) Enzymes de restrictions (Endonucléases bactériennes) EcoRI Escherichia coli de type 1 Site de reconnaissance séquence de 4 à 10 nucléotides (palindrome) 15

16 Coller Les ligases catalysent la formation d une liaison phosphodiester entre un 5 et le 3 de deux brins voisins -AGGTC- -TCCAG- -CTGCAA- -GACGTT- Ligase + AT -AGGTCCTGCAA- -TCCAGGACGTT- Copier Les polymérases sont les enzymes capables de copier les A dans le sens 5 3 AD polymérases AR polymérases AD polymérases AR dépendante (RT) roduit : AD Matrice : AD simple brin + amorces AR ou AD AD polymérases modifiées : (Taq ol thermostable) roduit : AR Matrice : AD simple brin roduit : AD Matrice : AR + amorce (RT réverse transcriptase) 4- Séparation des fragments Les fragments d AD de différentes tailles doivent être séparés pour être étudiés Electrophorèse Séparation des molécules chargées par migration le long d un support poreux sous l action d un champ électrique. A charge égale, les petites molécules migrent plus vite (plus loin). A polyanions migrent vers l anode (+) Supports : gel d agarose (fragments >100 pb), gel de polyacrylamide (fragments [ ] pb) ombreuses variantes de l électrophorèse pour l étude des A E. sur gel de polyacrylamide des produits d amplification par CR ; E. en champ pulsé (fragments > 50000pb) ; E. capillaire ; E. sur gel dénaturant etc. Chromatographie : Chromatographie échangeuse d ions ; hromatographie d affinité ; LC 16

17 5- ybridation moléculaire ybridation moléculaire : Association qui peut se faire entre deux acides nucléiques simples brins de séquences complémentaires et qui conduit à la formation d un duplex. Sonde : Séquence d A simple brin complémentaire et antiparallèle d une séquence cible (séquence recherchée) à laquelle elle s hybride de façon spécifique par réassociation entre bases complémentaires. * -GATTC- sonde monobrin -TAACGGCTAAGAGCTACGGA- * -GATTC- -TAACGGCTAAGAGCTACGGA- rincipaux types de sondes : oligonucléotides de synthèse (oligosondes) ; sondes AR (ribosondes) ; ADc Taille très variable: nucléotides ou plusieurs centaines de nucléotides. Intérêt : repérer spécifiquement une ou quelques séquences d acide nucléique dans un mélange complexe d acides nucléiques Marquage : pour visualiser l hybridation il faut «marquer» la sonde ou la séquence cible. n distingue : le marquage «chaud» utilisant des isotopes radioactifs (Isotopes : 32 ; 33, 35 S) les marquages «froids» de plus en plus employés, utilisent des molécules fluorescentes, luminescentes (biotinylation ; fluorophores, etc.) 6- Southern Blot Le Southern blot est une technique mise au point par Edward M. Southern en 1975 pour rechercher des fragments de DA ( 1 ère étape : Séparation des fragments d AD par électrophorèse sur gel de polyacrylamide Electrophorèse sur gel d'agarose Fragments d'ad 2 ème étape : Dénaturation (ouverture de la double hélice par a + acl) 3 ème étape : Transfert des fragments séparés sur une membrane de nitrocellulose. La position relative des fragments d AD est préservée durant le transfert Fragments d'ad transférés Gel d'agarose membrane de nitrocellulose tampon 4ème étape : ybridation avec une sonde complémentaire marquée (par un dt radioactif ou fluorescent) 17

18 Dispositif du transfert par buvardage Résultat après autoradiographie Applications du Southern blot 7- RFL : Restriction Length Fragment olymorphism En utilisant une enzyme de restriction, le génome d un individu est découpé en plusieurs fragments selon le nombre de sites de restriction présents dans l AD. Le nombre de ces sites et leurs positions diffèrent en fonction des individus : polymorphisme de longueur des fragments de restriction. Ainsi on pourra différencier deux individus. Technique utilisée pour étudier le devenir d un gène au cours des générations, diagnostiquer des maladies génétiques, cartographier le génome humain, prendre l empreinte génétique d un individu et dans les tests de paternité... Etapes d une étude RFL 1- Extraction de l AD des différents individus à analyser 2- Digestion de l AD par ER obtention de fragments d AD de longueurs différentes selon les individus. 3- Visualisation des différents fragments d AD obtenus par une électrophorèse sur gel d agarose. 4- Southern blot : Dénaturation des fragments (a) et transfert (sous forme monobrin) sur une membrane de nylon. 6- Incubation de la membrane en présence d une sonde marquée. La sonde s hybride avec le ou les fragments d AD contenant la séquence complémentaire. L endroit, ou les endroits, ayant fixé la sonde sont révélés en plaçant la membrane au contact d un film sensible à la radioactivité (autoradiographie), 18

19 Elongation 73 C ybridation 60 C Dénaturation 95 C Amplification de l AD par CR (olymérase Chain Reaction) La CR, ou Réaction en Chaine par olymérase, est une technique de réplication ciblée in vitro. Elle permet d obtenird importantes quantités d un fragment d AD spécifique et de longueur définie. La CR consiste en l amplification exponentielle d une séquence d AD double brin effectuée in vitro par extension de deux amorces situées de part et d autre du fragment cible à l aide d une polymérase thermostable (Taq polymérase : Thermus aquaticus). n distingue trois étapes qui définissent un cycle qui sera répété n fois : 1 ème étape : Dénaturation (généralement 0 à 1 minute à 95 C) Déshybridation de l AD et homogénéisation du milieu réactionnel. 2 ème étape : ybridation (généralement 2 à 60 secondes à C) ybridation des amorces sens et anti-sens aux AD matrice. 3 ème étape : Elongation (généralement 4 à 120 secondes à 72 C) La polymérase synthétise (sens 5 3 ) le brin complémentaire d AD matrice à 72 C Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3 Contrôle des produits de CR Après cette amplification, on contrôle les produits CR par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (AGE) en présence de marqueurs de taille pour vérifier si on a obtenu l amplification du fragment cible. 19

20 CR RFL La technique CR-RFL est l association entre les techniques d amplification et d observation de polymorphismes sur des fragments digérés par des enzymes de restriction. L amplification permet de ne pas analyser l AD total, mais juste un segment d AD. L utilisation d une enzyme de restriction donnera ainsi un nombre réduits de fragments. La visualisation des fragments de restriction ne nécessite donc pas l utilisation de sonde radioactive. Séquençage Deux méthodes de séquençage de l AD ont été développées indépendamment dans la deuxième moitié des années 1970 : l une par l équipe de Gilbert (États-Unis) et l autre par celle de Sanger (Royaume-Uni). Ces deux méthodes sont fondées sur des principes diamétralement opposés : l approche de Sanger est une méthode par synthèse enzymatique sélective, tandis que celle de Maxam et Gilbert est une méthode par dégradation chimique sélective (prix obel chimie 1980). Méthode de Sanger Le principe de cette méthode consiste à initier la polymérisation de l AD à l aide d un petit oligonucléotide (amorce) complémentaire à une partie du fragment d AD à séquencer. L élongation de l amorce est réalisée par une AD polymérase thermostable. La méthode est basée sur l utilisation de didésoxyribonucléotides (ddt : ddat, ddct, ddgt ou ddtt). dat 2 ddat 2 2 Les didésoxyribonucléotides agissent comme des «poisons» terminateurs de chaîne : une fois incorporés dans le nouveau brin synthétisé, ils empêchent la poursuite de l élongation. Cette terminaison se fait spécifiquement au niveau des nucléotides correspondant au didésoxyribonucléotide incorporé dans la réaction. Lorsqu une AD polymérase utilise un ddt au lieu d un dt, elle n est plus capable de rajouter le moindre nucléotide à sa suite : la synthèse du brin d AD s arrète A 2 C G 2 Les quatre désoxyribonucléotides (dat, dct, dgt, dtt) sont ajoutés, ainsi qu une faible concentration de l un des quatre ddt our le séquençage complet d un même fragment d AD, on répète cette réaction quatre fois en parallèle, avec les quatre didésoxyribonucléotides différents. 20

21 Mode opératoire : Soit l AD à séquencer 4 mélanges sont préparés: le fragment qui doit être séquencé une amorce : petit morceau d AD dont la séquence est complémentaire à l extrémité 3 du fragment à séquencer les 4 dt s (dct, dat, dgt, dtt) un didésoxynucléotide en faible quantité (ddct, ou ddat, ou ddgt, ou ddtt) une AD polymérase I (dépourvue d activité exonucléase 5 3 ) ddct ddgt ddtt ddat AD à séquencer + amorce + AD polymérase +(dct, dgt, dat, dtt) Après une étape de dissociation de l AD (formaldéhyde, chauffage) et hybridation avec l amorce, une AD polymérase I (Taq) va incorporer un à un les désoxynucléotides complémentaires de la séquence modèle dans le sesns 5-3 Quand un didésoxynucléotide est incorporé, la synthèse est interrompue. L utilisation d un ddt permet ainsi d obtenir un ensemble de fragments d AD de différentes tailles, correspondant aux emplacements d un nucléotide donné. C G T A Exemple ci-dessous : Synthèse du brin complémentaire, et arrêt aléatoire par un ddgt quand il y a une Cytosine sur la séquence : A T G G T A C G T C A A C T A T A C C A T G C A G T T G* T A C C A T G C A G* T A C C A T G* brin d'ad à séquencer incorporation d'un ddgt arrêt de synthèse synthèse du brin AD complémentaire dtt dgt dat dct ddgt G incorporation d'un dgt la synthèse continue Conclusion : on obtient un mélange de fragments d AD de tailles croissantes, qui se terminent tous au niveau d un des G dans la séquence (complémentaire de C du brin codant). Ces fragments sont ensuite séparés par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide, ce qui permet de repérer la position des G dans la séquence. 21

22 Lecture des résultats Le contenu de chaque tube est soumis à électrophorèse sur gel de polyacrylamide. La détection des fragments ainsi synthétisés se fait en incorporant un traceur dans l AD synthétisé. Initialement ce traceur était radioactif et les fragments apparaissent sur l autoradiographie du gel. Aujourd hui, on utilise des traceurs fluorescents différents, attachés aux didésoxyribonucléotides. La séquence lue est limitée à nucléotides environ : au-delà, les bandes sont trop tassées... Leur ordre n est plus déterminable. D après le sens de polymérisation, la séquence est lue horizontalement de bas en haut : A T C G A Le plus petit fragment correspond au fragment obtenu par le premier didesoxynucléotide incorporé en 5 A T C G La très grande majorité des séquences réalisées et publiées aujourd hui sont réalisées sur des séquenceurs automatiques. Ceux-ci sont capables de réaliser les réactions de séquence, puis de les lire. Dans ce cas chaque didésoxyribonucléotide est marqué par un fluorochrome différent (de couleur différente) et la réaction peut se faire dans un seul tube réactionnel. Un détecteur relié à un ordinateur fournit un résultat direct. Les séquenceurs permettent de lire plusieurs centaines de nucléotides avec une très bonne qualité, jusqu à 1000 pour les appareils les plus performants. Animations Enzymes : Couper - Copier Coller Electrophorèse Southern CR RFL Séquençage