Nouveaux tests globaux de l hémostase: génération de thrombine, thromboélastogramme, microparticules ARL 16/03/06
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- Adeline Gobeil
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1 Nouveaux tests globaux de l hémostase: génération de thrombine, thromboélastogramme, microparticules ARL 16/03/06
2 Nouveaux tests globaux de l hémostase Mesure de la génération de thrombine dans le plasma pauvre en plaquettes (PPP) et le plasma riche en plaquettes (PRP) Thromboélastogramme: étudie le sang total Mesure des microparticules procoagulantes dans le sang
3 Pourquoi des nouveaux tests en hémostase? Les tests d exploration de l hémostase que nous utilisons ont une performance limitée et un caractère statique. La thrombomoduline et les autres partenaires du pool vasculaire sont absents de ces tests. Nous avons besoin de tests plus proches de la réalité physiologique.
4 La réalité physiologique K.G. Mann et al. BCMD 2006
5 Formation du caillot hémostase primaire (plaquettes) hémostase secondaire (coagulation) CAILLOT hémostase tertiaire (fibrinolyse)
6 Hémostase primaire 1. Adhésion plaquettaire 2. Activation plaquettaire 3. Agrégation plaquettaire Sous-endothélium Lésion de l endothélium
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8 Hémostase secondaire Thrombine Coagulation Fibrinogène Fibrine Sous-endothélium Lésion de l endothélium
9 Initiation de la coagulation Facteur tissulaire F VIIa F X F Xa TFPI/FXa Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) Prothrombine Thrombine Fibrinogène Fibrine Clou plaquettaire primaire Fibrine liée à la thrombine
10 Amplification de la coagulation F X Complexe tenase F IXa F VIIIa FIXa FVIIIa Membrane plaquettaire F Xa Complexe prothrombinase F Xa F Va Antithrombine Prothrombine F V et F VIII Activation de plus de plaquettes Génération de plus de fibrine Stabilisation du caillot F XIIIa Thrombine F XIII
11 Voie de la protéine C activation VIII inhibition IXa VIIIa V P S A P C PC X Xa Va prothrombine thrombine thrombomoduline
12 Les complexes procoagulants et anticoagulants vitamine K dépendants et leurs régulateurs K.G. Mann et al. BCMD 2006
13 Cascade de la coagulation
14 Mesure de la génération de thrombine initialement développé en 1953 renouveau important car: automatisation de sa technique et informatisation des résultats mime les mécanismes de coagulation physiologiques Thrombogram-Thrombinoscope
15 Comparaison avec les tests de coagulation classiques Les temps de coagulation: -temps ou taux de prothrombine, TP -temps de thromboplastine partielle activée, aptt sont utilisés en routine pour pour évaluer la coagulation de manière globale MAIS, ces tests ne mesurent pas la génération de thrombine, car au moment ou la caillot est formé, seulement 3% de la prothrombine est activée
16 La mesure de la génération de thrombine Méthode de base ancienne et établie dans le domaine de la recherche sur la coagulation, décrit toutes les phases du processus de génération de thrombine Thrombogram-Thrombinoscope (Hemker): méthode automatisée utilisant un substrat chromogène (usage d un Fluoroscan de Thermo ) CEPENDANT: une standardisation des conditions pré-analytiques et de la méthode est nécessaire avant son introduction en routine
17 La mesure de la génération de thrombine On peut utiliser du PPP et du PRP Intérêt dans l investigation d une diathèse hémorragique MAIS AUSSI dans les états hypercoagulables Utile aussi pour évaluer les troubles de la fonction plaquettaire
18 MAIS les conditions pré-analytiques doivent être standardisées
19 Le vide peut créer une activation des plaquettes et une diminution de la sensibilité àla protéine C activée Changements visibles immédiatement après la prise de sang, variabilité entre les donneurs V. Régnault et al. Thrombosis Research 2004, 114:
20 Génération de thrombine après activation de la voie du facteur tissulaire dans un plasma riche en plaquettes thrombine (nm) VIIa/ FT Xa libre Phase d initiation Activation du TAFI* en TAFIa Phase de propagation PREMIÈRES TRACES DE THROMBINE PROTHROMBINASE TENASE IXa+VIIIa+ PS Formation du caillot * Thrombine Activatable Fibrinolysis Inhibitor Phase Phase de de neutralisation neutralisation L activation du TAFI en TAFIa rend le caillot plus résistant à sa dissolution (fibrinolyse). [activation des plaquettes, du FVIII et du FV (D après C. Hemker et K. Mann) temps (min) Grigoris T. Gerotziafas, Meyer M. Samama 2004
21 Génération de thrombine après activation de la voie du facteur tissulaire dans un plasma riche en plaquettes thrombine (nm) Tmax Cmax ETP Temps de latence Cmax Tmax ETP* Valeurs normales 3,5± 1 min 200 ± 30 nm 9 ± 2 min 1500 ± 100 nmxmin Endogenous Thrombin Potential: «Man hours» of thrombin activity (Hemker 1993) 50 Temps de latence 0 + FT (5 pm) Temps correspondant aux TP ou aptt (D après C. Hemker et K. Mann) temps (min) Grigoris T. Gerotziafas, Meyer M. Samama 2004
22 Déficits en facteurs de la coagulation, déficits plaquettaires Pourquoi des hémorragies? 200 N thrombine (nm) FT (10-25pM) caillot N. initiation Phase de propagation Phase Phase de de stabilisation stabilisation hémophiles def. plaquettaires caillot lâche (déficits) 0 10 temps (min) 20
23 Effet des contraceptifs oraux sur la génération de thrombine K.G. Mann et al. BCMD 2006
24 Influence d un inhibiteur du facteur Xa sur la génération de thrombine K.G. Mann et al. BCMD 2006
25 Phénotype d un déficit constitutionnel en antithrombine CONTROL Déficit en antithrombine V. Régnault et al. Thrombosis Research 2004, 114:
26 Phénotype d un déficit constitutionnel en protéine C CONTROL Déficit en protéine C
27 Thromboéleastogramme (Haemoscope )
28 Thromboélastogramme (1) Développé en 1948 Utilisé comme outil de recherche depuis Plus récemment: guide pour décider de l administration des transfusions durant la transplantation hépatique et la chirurgie cardiaque
29 Thromboélastogramme (2) donne une impression globale de la coagulation, nous fournit des données sur le caillot après le début de la formation de fibrine, reflète l interaction entre les plaquettes, la cascade de la coagulation et la fibrinolyse, mesure aussi la fermeté du caillot, TEG standard et TEG modifié par une héparinase (inactive l héparine).
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32 Thromboéleastogramme
33 Mesure des microparticules procoagulantes dans le sang
34 Que sont les microparticules du sang? Observées pour la première fois dans le sang en 1967 par P. Wolf : «poussière de plaquettes» : génération des microparticules durant l activation plaquettaire (P.S. Sims et S.J. Shattil) Ces microparticules plaquettaires sont procoagulantes: lient le facteur Va et soutiennent l activité prothrombinase ainsi que la liaison du facteur VIII
35 Depuis, des centaines d études ont été publiées sur les microparticules du sang La plupart du temps, les microparticules sont mesurées par cytométrie de flux Même si la plupart des microparticules sont issues des plaquettes sanguines, certaines dérivent des cellules endothéliales, des leucocytes, des cellules musculaires lisses ou des érythrocytes, par exemple Leur distribution et leur nombre peut varier dans le sang en fonction des conditions physiologiques et pathologiques
36 Les microparticules procoagulantes Dérivées des plaquettes, des cellules endothéliales et des leucocytes Les microparticules plaquettaires riches en phosphatidylsérine fournissent une surface procoagulante pour la génération de thrombine Les microparticules endothéliales pourraient être associées à certains états hypercoagulables Peuvent aussi être issues des cellules tumorales
37 Facteur tissulaire circulant (contenu dans les microparticules) N. Mackman, BCMD 2006
38 Définition d une microparticule du sang et limite des méthodes de mesure habituelles diamètre < 1 µm ( nm) vu sa taille, elle se confond avec le bruit de fond électronique lorsqu elle est comptée par cytométrie de flux La cytométrie de flux par la méthode du «light scattering»ne peut pas déterminer la taille d une particule quand la taille de cette particule est du même ordre de grandeur que la longueur d onde du laser utilisé (488 nm)
39 Mesure des microparticules sanguines dans le cancer avancé: cytométrie de flux avec impédance Cytomètre de flux: NPE Systems Quanta Utilise l impédance pour mesurer la taille de la microparticule Marquage des particules avec un anticorps antifacteur tissulaire, de façon à quantifier les microparticules procoagulantes Échantillons de plasma de sujets normaux et de patients avec un cancer de stade avancé.
40 Etude préliminaire Microparticules positives pour le facteur tissulaire: présentes dans 1/3 patients avec un cancer avancé Nombre: particules par microlitre Taille: nm Rôle probable de ces microparticules dans les complications thromboemboliques du cancer B. Furie et al., BCMD 2006
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