Les systèmes endocannabinoïde et endovanilloïde

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1 Les systèmes endocannabinoïde et endovanilloïde Ces systèmes sont constitués par des messagers lipidiques dérivés de l acide arachidonique libérés par l activation neuronale et des récepteurs de ces messagers: les récepteurs cannabinoïdes CB1 et CB2 et les récepteurs-canaux TRPV1. Ils régulent la transmission synaptique glutamatergique et GABAergique. Fort impact sur la cognition, l humeur et les activités neurovégétatives notamment la prise de nourriture et la régulation du métabolisme énergétique. Utilisation de ces systèmes dans un but thérapeutique?

2 Historique de la découverte des endocannabinoïdes et de leur action neurophysiologique. Modulations comportementales et utilisation de bloqueurs métaboliques des ecb. Voies intracellulaires: mtor. Action neurodéveloppementale et neuroprotectrice. Développement d animaux transgéniques. Actions dans la prise de nourriture et le statut énergétique.

3 Historique de la découverte des endocannabinoïdes Le 9 THC (Cannabis Sativa) est utilisé depuis longtemps pour ses effets anxiolytiques, hypnotiques, analgésiques, euphorisants et orexigènes. Il peut induire l hypothermie, l hypolocomotion, l amnésie, la catalepsie. Identification du 9 THC comme l élément psychoactif de Cannabis Sativa (phytocb) en 1964-synthèse de cannabinomimétiques. Clonage du récepteur CB1 et identification du 9 THC comme ligand en Clonage du récepteur CB2 en Découverte d un ligand endogène des CB1: le N-arachidonyethanolamide anandamide (de ananda, bonheur suprême en sanskrit) en Découverte du 2-acyl-glycérol (2-AG) en Clonage des récepteurs TRPV1 en Mise en évidence du rôle présynaptique inhibiteur des récepteurs CB1 en Obtention d animaux transgéniques déficients en CB1 en Découverte de l activation physiologique des CB1 en 2001: phénomènes de DSE et DSI. Développement d agents thérapeutiques interagissant avec le système endocannabinoïde.

4 Le 9 THC et cannabinomimétiques : on notera le caractère très lipophiles de ces molécules.

5 Il s est écoulé un temps relativement long entre l identification du THC comme composé psychotrope et la caractérisation de ses récepteurs. Ceci tient à la nature très lipophile de cette molécule. On pensait que contrairement aux agents morphiniques, le THC exerçait ses effets par une action uniquement membranaire. Le récepteur CB1 est un RCPG essentiellement couplé à Gi et localisé au niveau présynaptique Possibilité d hétérodimérisation (avec D2). Toxine pertussique(ptx) Inhibition de l adénylate cyclase Gi Inhibition de canaux calciques dépendants du voltage Activation de canaux potassiques dépendants du voltage Gq Activation de PLCβ : IP3 / Ca 2+ Activation de la voie des MAPkinases (Gβγ?), mtor Le récepteur CB2 est couplé aux mêmes voies de transduction surtout exprimé par les cellules immunitaires en périphérie (effet anti-inflammatoire, antispasmodique). Il présente 44% d homologie avec CB1

6 Les récepteurs CB1 sont exprimés partout dans le SNC mais surtout dans l hippocampe le striatum et le cervelet. Ce sont les RCPG les plus exprimés dans le SNC. Il y a une forte corrélation entre la distribution des récepteurs CB1 et les effets psychotropes des cannabinoïdes (ex: effet amnésiant expression hippocampique). Les récepteurs CB1 sont aussi présents sur les organes périphériques ( CB1 périphériques ), même si beaucoup moins concentrés que les CB1 centraux.

7 A la recherche de ligands endogènes pour les récepteurs CB1, les endocannabonoïdes (ecb) Plusieurs travaux avaient montré que l augmentation de Ca 2+ dans les neurones par le ionophore calcique ou suite à une dépolarisation pouvait libérer un messager capable de déplacer la liaison du CP Par la suite, l anandamide fut isolé après solubilisation de membranes neuronales et chromatographie en supposant que comme le ligand de CB1 (THC) est particulièrement hydrophobe, son ligand endogène de ce récepteur devait avoir une propriété similaire. L anadamide (AEA) est un dérivé de l acide arachidonique qui se fixe sur les récepteurs CB1. Le 2-arachidonoyl-glycérol (2-AG) fut ensuite découvert: c est aussi un dérivé de l acide arachidonique. Il est en général plus concentré que l AEA. Le 2-AG et l AEA ont des propriétés pharmacologiques spécifiques: le 2-AG est un agoniste CB1 (agoniste total) et CB2, alors que l AEA est un agoniste partiel CB1 et agoniste TRPV1. D autres dérivés de l acide arachidonique ont un effet endocannabinoïde.

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9 Biosynthèse des endocannabinoïdes Les ecb sont le résultat d une biosynthèse non oxydative, spécifique à chacun d eux et qui met en jeu plusieurs enzymes. Les substrats de ces biosynthèses sont des phopholipides membranaires. 1-La biosynthèse du 2-AG débute à partir du PIP2 par l action de la PLCβ qui produit du diacyl-glycérol (DAG). Le DAG est ensuite transformé en 2-AG par action de la diglycérol-lipase a (DGLa). Le 2-AG est ensuite dégradé par la mono-acyl glycérol lipase (MGL). Il peut, comme l acide arachidonique, subir un métabolisme oxydatif (cyclooxygénase 2 (COX-2), lipooxygénase (LOX)) pour donner des prostaglandines. Certaines prostaglandines (PG) ont une action sur les récepteurs CB1. ABDH6 = α/β hydrolase domain containing protein 6

10 2-La biosynthèse de l AEA peut se faire par plusieurs voies. Elle débute à partir du N-arachidonoyl-phosphatidyl-éthanolamine (NAPE). Le NAPE peut être hydrolysé par l action de la phospholipase D pour donner l anandamide (AEA). D autres voies faisant intervenir une hydrolase (ABHD-4) et une PLC peuvent aussi conduire à la production d anandamide. L anandamide est ensuite hydrolysé par la FAAH (Fatty Acid Amide Hydrolase).

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12 Spécificités de la dégradation des ecb Chaque ecb possède son propre système de dégradation avec une localisation spécifique: -la FAAH pour l anandamide au niveau postsynaptique; -la MAGL (ou MGL) pour le 2-AG au niveau présynaptique. Neurone présynaptique Les ecb sont synthétisés au niveau postsynaptique et sortent du neurone de manière passive. Ils agissent au niveau des récepteurs CB1 présynaptiques. Ils sont ensuite recapturés dans les neurones par des transporteurs avant d être dégradés (voir diapo suivante). La biosynthèse d un ecb peut inhiber la biosynthèse de l autre. Neurone postsynaptique Les ecb ne sont pas tous impliqués de la manière dans les phénomènes physiologiques.

13 L anandamide (et le 2-AG) est transporté dans le neurone avant sa dégradation par la FAAH. Des bloqueurs sélectifs du transporteur (AM404) et de la FAAH (URB597) ont pu être synthétisés. Ces molécules vont permettre d augmenter la demi-vie des ecb et donc leur action synaptique. Inhibiteur de transport d anandamide Inhibiteur de la FAAH

14 Les molécules WIN et AM251 sont utilisées pour la recherche sur l activité des récepteurs CB1, ainsi que le CP55940 (agoniste).

15 Mise en évidence du rôle modulateur de la transmission synaptique par des récepteurs CB1 présynaptiques (1996): Cultures de neurones exposées à un milieu sans magnésium externe et mesure de calcium intracellulaire: hyperactivation des récepteurs NMDA et augmentation de la libération de glutamate. Il apparaît des signaux calciques dus l activation des récepteurs AMPA et NMDA par le glutamate libéré synaptiquement. Le WIN bloque complètement cette activité de manière dépendante de la PTX.

16 Les effets du WIN sont mimés par l anandamide et d autres cannabinomimétiques. Le WIN est un énantiomère inactif du WIN

17 GLU KA CB1 GLU Effet sur la transmission synaptique évoquée: effet présynaptique des récepteurs CB1.

18 Les récepteurs CB1 désensibilisent très vite: ici une application de 24h d un agoniste total bloque les effets de cet agoniste. Les CB1 peuvent induire des phénomènes de désensibilisation croisée avec d autres récepteurs présynaptiques (A1 de l adénosine).

19 La désensibilisation met en jeu la protéine GRK2 et l arrestine GLU GLU Injection de GRK2 mutée L injection de GRK2 mutée empêche la désensibilisation des récepteurs CB1

20 Le THC exerce des effets agonistes partiels sur les récepteurs CB1 par rapport au WIN : effet antagoniste du THC.

21 L effet inhibiteur des agonistes CB1 est aussi détectable sur la transmission synaptique spontanée: ici l action du 2-AG et son blocage par le AM251. GLU

22 L activation des récepteurs CB1 inhibe la transmission synaptique GABAergique (SR pour SR141716, le Rimonabant). Cet effet semble passer par une action présynaptique mise en évidence par la modification du phénomène de paire-pulse depression qui s observe au niveau des synapses GABAergiques.

23 Chez les souris CB1-/- l effet du WIN persiste sur la transmission synaptique excitatrice. Présence d un récepteur CB3?

24 Mécanisme d action physiologique des endocannabinoïdes: phénomènes de suppression de transmission-excitatrice ou inhibitrice-par dépolarisation (DSE, DSI). GLU GLU La DSE (ou DSI) un phénomène de dépression synaptique transitoire obtenu après dépolarisation du neurone postsynaptique. On l observe au niveau des synapses excitatrices (DSE) et inhibitrices (DSI). Ce phénomène met en jeu une libération d endocannabinoïdes (voir diapo suivante).

25 Phénomène de suppression de l inhibition (ou de l excitation) par dépolarisation (DSI ou DSE) : ce phénomène met en jeu la synthèse d endocannabinoïdes et leur action sur les récepteurs CB1. Il s observe au niveau des synapses excitatrices (DSE) et inhibitrices (DSI). Pour le mettre en évidence il suffit de dépolariser un neurone postsynaptique : cela conduit à une inhibition transitoire de la transmission synaptique.

26 La DSI et DSE s observent aussi sur l activité spontanée après dépolarisation post-synaptique.

27 - - ecb Glutamate GABA ecb Glutamate mglu1/5 ecb + Ca 2+ ecb + Ca 2+ Dépolarisation Dépolarisation

28 Modulations centrales Diminution de l apprentissage-tests de mémoire Effet anxiolytique Effet anti-dépresseur Action neurodéveloppementale Action neuroprotectrice? Action orexigène

29 Effet sur un apprentissage: la reconnaissance visuelle En absence des récepteurs cannabinoïdes, l apprentissage reste en mémoire plus longtemps (discrimination visuelle). Globalement, la stimulation des CB1 empêche les processus de mémorisation.

30 Cas de l anxiété Bras ouverts Bras fermés Anxiété augmentée chez les souris CB1-/- (test elevated plus maze pour mesurer l anxiété de trait ou basale). L activation des récepteurs CB1 produit un effet anxiolytique facilement identifiable dans l elevated plus maze.

31 Anxiété diminuée chez les souris FAAH-/- (test elevated plus maze )

32 Anxiété diminuée par blocage de la FAAH par le URB597 (test elevated plus maze ).

33 Cas de la dépression Effet anti-dépresseur du AM404 et URB597 mesuré par le test de nage forcée ou du désespoir.

34 Mesure de l effet anti dépresseur du URB597. Le modèle utilisé est celui d un stress chronique léger (Chronic Mild Stress) sur plusieurs semaines (5). On mesure le poids corporel (Body Weight) et la consommation de sucrose (Absolute Sucrose Intake & Relative Sucrose Intake) [test d anhédonie].? La consommation de sucrose (ASI) est mesurée après 2 semaines (graphe de gauche) et de 3 semaines de CMS (graphe de droite) en présence de doses croissantes de URB597 (mg.kg-1) ou d imipramine (20mg.kg-1) un anti-dépresseur de référence. On observe une reprise de la consommation de sucrose dépendante de la dose de URB 597 injectée.

35 Utilisation des enzymes de dégradation des ecb comme cibles thérapeutiques pour lutter contre l anxiété et la dépression: développement d inhibiteurs bloquant la FAAH et la MAGL: cas du JZL 195. JZL184 bloqueur MAGL Mesure de l inhibition de l hydrolyse du 2-AG et AEA

36 Action in vivo du JZL 195: mesure de l accumulation de 2-AG et AEA

37 Principe de screening d inhibiteurs d enzymes par utilisation de substrats marqués par un fluorophore et la révélation par électrophorèse.

38 Cinétique de l effet du JZL195

39 PF3845 inhibiteur FAAH JZL 184 inhibiteur MAGL

40 Action négative du JZL 195 et du THC sur la rétention dans la piscine de Morris

41 Accumulations de 2-AG et AEA dans différentes régions cérébrales en présence de JZL195 chez des animaux témoins et FAAH-/-.

42 Cannabinoïdes et neurodéveloppement

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46 Cannabinoïdes et neuroprotection?

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48 Utilisation des animaux transgéniques pour étudier l action des récepteurs CB1 Mutants déficients en rcb1 (1999) Mutants en rcb1 sur interneurones et cellules principales (depuis 2003)

49 Mutants déficients en rcb1 : interférence avec l action du THC

50 Rôle des récepteurs CB1 sur les cellules pyramidales et les interneurones? Génération d animaux déficients en rcb1 sur les interneurones ou les cellules pyramidales rcb1 GLU rcb1 GABA

51 Génération de souris transgéniques utilisation du système CRE-LOX: la recombinase CRE permet d éliminer la séquence située entre les éléments LOX. On peut orienter l ablation du gène en introduisant la recombinase CRE sous contrôle d un promoteur spécifique: CaMKII ou v-glut (cellules pyramidales), GAD (interneurones GABAergiques).

52 Distribution anatomique des rcb1 chez les différents mutants

53 Ici on produit le KO dans les cellules pyramidales la recombinase CRE est sous contrôle du promoteur de la CaMKII. En D marquage des rcb1 sur les celllules pyramidales et les interneurones. En E seuls les rcb1 sur les interneurones sont marqués.

54 Vérification que la DSI implique les rcb1 sur les interneurones GABAergiques!.