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1 CYTOMETRIE EN FLUX BD FACSVerse BD FACSAria III Journée de Forma-on et Informa-on 6/11/2013

2 CYTOMETRIE EN FLUX Principe Applica4ons Tri

3 Qu est que ce la cytométrie en flux? Individuelle Quan4ta4ve Qualita4ve Par4cules en suspension Flux liquide Source lumineuse

4 CYTOMETRIE EN FLUX: Principe Fluidique Electronique Optique

5 Paramètres CYTOMETRIE EN FLUX: Analyses MulLparamétrique SSC Fluorescence LASER FSC FSC: Forward ScaDer lumière diffractée Dépend de la taille et de la surface cellulaire SSC: Side ScaDer lumière réfléchie et réfractée Dépend de la granularité et de la complexité cellulaire Fluorescence

6 ImageUP formation 2013 Paramètres Fluorescence FITC CYTOMETRIE EN FLUX: Analyses Multiparamétrique FITC FITC FITC FITC FITC Nombre d évènements FITC FITC FITC Intensité de fluorescence

7 CYTOMETRIE EN FLUX: Fluidique Low Flow Rate High Flow Rate

8 ImageUP formation 2013 Fluidique Vacuum pump Sheath filter Laser intercept Flow cell Loader (plates or tube racks) Waste tank Sheath tank Sample injection tube (SIT)

9 ImageUP formation 2013 Optique Collection Optics Detector arrays Fiber optics Laser Laser Laser Collection lens Lens Flow cell FSC diode Excitation optics Sample core

10 ImageUP formation 2013 Signaux d émission du laser bleu Structure de collecte du signal: Heptagones 507 LP 527/32 FITC Blank 665 LP 700/54 PerCP-Cy LP 783/56 PE-Cy7 560 LP 586/42 PE 488/15 Side scatter

11 ImageUP formation 2013 Fluorochromes Configuration Lasers Position PMT Fluorochromes Autres sondes (nm) et filtres (nm) 488 (bleu) A (750 à 810 nm) PE-Cy7 B (>670 nm) PerCP, PerCPCy5.5 IP, PE-Cy5.5, 7-AAD D (564 à 606 nm) PE (IP) E (515 à 545 nm) FITC GFP, Alexa 488, CFSE F (483 à 493 nm) Side Scatter (SSC) 633 (rouge) A (750 à 810 nm) APC-Cy7 APC-H7 C (650 à 670 nm) APC Alexa 633, Alexa (violet) A (502 à 535 nm) AmCyan, V500 Pacific orange B (425 à 475 nm) Pacific blue, V450 DAPI, Cascade Blue Alexa 405

12 ImageUP formation

13 ImageUP formation 2013 Système Electronique Conversion signaux optiques en signaux digitaux proportionnels Photon In Signal Out Analog to Digital Conversion Digital data to memory Voltage In PMT Power Supply Levels Volts Digitize the pulse Sample the pulse

14 ImageUP formation 2013 Système Electronique Analyse digitale Digital data in memory Field Programmable Gate Arrays Digital Signal Processor Computer Height Area PE FITC

15 CELLULE : Unités arbitraires Nombre de cellules etc

16 Applica4ons de la CMF Analyse morphologique Immunophénotypage anlgènes membranaires anlgènes intracellulaires Analyse du contenu en ADN Cycle cellulaire Viabilité ProliféraLon cellulaire Suivi de l ac4vité géné4que par l expression d un gène rapporteur (GFP) Mesure de l apoptose Phagocytose Stress Oxyda4ve Flux calcique Signalisa4on cellulaire

17 Analyse morphologique Forward ScaDer: taille Granulocytes Monocytes Lymphocytes Side ScaDer: granularité

18 Immunophénotypage ACM anti-cd3 ACM anti-cd4 ACM anti-cd19 ACM anti-cd14 PE FITC APC PE-Cy5 PE FITC CD3? CD19? Leucocyte FITC + PE + APC - PECy5 - CD4 + CD3 + CD19 - CD14 - CD # : Cluster de différenciation

19 Immunophénotypage CD19+ CD3 CD19+CD3+ CD19 CD3 CD19 CD3+ Lymphocytes

20 Marquage intracellulaire Perméabilisa4on des cellules FITC Leucocyte Sécré4on Signalisa4on

21 ImageUP formation 2013 Viabilité Cellules THP1 + Thalidomide ( # conc.) Incuba4on 48 HS + Iodure de Propidium Intercalant Imperméant 2.4 % 3.8 % 9.5 % 99.7 %

22 Apoptose: Mise en évidence des différentes étapes Induc4on: T0 Condensa4on T2h Fragmenta4on T6h Chute du poten-el membranaire mitochondrial (DiOC6) Altéra-ons de la membrane plasmique (Annexine V) Expression des caspases, famille Bcl 2 Fragmenta-on DNA (TUNEL)

23 Apoptose: DiOC6 Détec4on des altéra4ons de poten4el de membrane DiOC6: carbocyanines La fluorescence est modifiée selon l environnement électrique Cellules JURKAT + Camptothecin (18 HS)

24 Apoptose: Annexine V Détec4on des altéra4ons de la membrane plasmique Extériorisa4on des phospha4dyl sérines (PS) Annexine V: forte affinité pour résidues PS Annexine V APC Cellules JURKAT Cellules JURKAT + camptothecin (4 HS)

25 Proliféra4on cellulaire: marquage au CFSE CFSE: CarboxyFluorescein diacetate Succinimidyl Ester Charge des cellules au CFSE Suivi de la proliféra4on lymphocytaire dans le sang périphérique Distribu4on équivalente de la fluorescence entre les cellules filles J0: cellules arrêtes en généra4on parentale (mitomycin) S-mula-on de la proliféra-on (PHA) J7: généra4ons successives

26 Phagocytose FITC-Labeled Bacteries FITC Neutrophile

27 Avantages de la CMF Analyse quan4ta4ve Sensibilité de détec4on Rapidité Analyse mul4paramétrique Tri

28 TRI Principe Introduc4on au système BDFACSAria III Quelques exemples.

29 TRI : Principe

30

31 TRI: Principe Déflec4on électrosta4que de goudes chargées Les cellules sont aspirées de l'échan4llon injectées une à une par une buse dans un courant con4nu (forma4on du jet) Le jet se rompre pour donner des goudes à un point précis appelé «break of point» Chargement de goutes Les goutes sont déviées du côté de la plaque de polarité opposée et collectée En appliquant différent niveau de charge à gauche et à droite, il est possible de trier quatre populalons simultanément sur le BD FACSAria III.

32 TRI: PRINCIPE 3 Charge du jet 4 «break of point» 1 les signaux sont analysées au point d intercep4on 2 Décision de tri selon les critères définis par l'u4lisateur 5 plaques de déflec4on électrosta4que: déflec4on de goudes chargées 6 Les goutes non chargées passent à la poubelle 7 Les goutes chargées (par4cules d intérêt) sont collectées

33 TRI: Principe Stabilité du jet Pression Liquide de gaine Fréquence Taille de la buse Amplitude

34 TRI: Principe Op4misa4on de paramètres Taille de la buse Pression Liquide de gaine Fréquence Viabilité cellulaire Taille de la buse (µm) Pression Liquide de gaine (psi) Fréquence (KHZ) Type cellulaire Lymphocytes T non ac4vés, Lymphocytes B, Bactéries, Levures Lymphocytes T ac4vés, cellules plasma4ques, NK, NK T, Monocytes, mdc, pdc, cellules souches Cellules 4ssulaires, Neurones, Macrophages,

35 TRI: Principe Précisions Pureté Rendement «Single Cell»

36 BD FACSAria III

37 BD FACSAria III Système Op4que Lasers 375 nm 405 nm 488 nm 561 nm 633 nm

38 BD FACSAria III Système de collec4on Le module ACDU (automated cell deposi4on unit)

39 Le BD FACSAria III permet: Trier sur des microplaques de 24, 96 puits ou 384 puits, des lames ou des tubes. Trier dans des condilons de température contrôlée (4, 20, 37 et 42 C) et dans des condilons aseplques. Trier à différentes pressions (5 à 75 psi) et avec quatre tailles de buses (70, 85, 100 et 130 µm) pour trier divers types des parlcules. l analyse simultanée de 18 paramètres (FSC, SSC et 16 fluorescences). l acquisilon à une vitesse maximale de évènements/sec. Trier avec un maximum de pureté ou un maximum de rendement (pour une pelte et précieuse populalon) ou un maximum de précision pour un clonage. Récupérer des cellules viables

40 Quelques exemples Tri des lymphocytes T (CD3 +) et monocytes (CD14 +) à par4r de CMN de sang périphérique Avant Tri 8.6 % 99.7 % Après Tri 54.1 % 98.0 % Après Tri

41 Quelques exemples Tri des cellules GFP + à par4r de lignée transfectée Avant Tri 97 % Après Tri 31.7 % 67.9 % Après Tri 99.3 %

42 Quelques exemples Am J Physiol Cell Physiol June; 298(6): C1326 C1342.

43 Stratégie de «ga4ng»: Cellules souches de sang de cordon SSC A 7 AAD Lineage viable BV 421 CD38 PBMC CD34+ CD38 FSC A FITC lineage cocktail 4 APC CD34 All events BV 605 CD 90 CD45 RA CD90 + BV 605 CD 90 CD 49f+ CD90 + PBMC Lineage viable CD34+ CD38 CD45 RA CD90 + CD 49f+ CD90 + APC H7 CD45 RA PE CD 49f

44 CYTOMETRIE EN FLUX Informa4ons pra4ques.. Responsables et contacts Localisa4on Matériel Adriana Delwail Tél: Mail: Adriana. poi4ers.fr Jean François Jégou Tél: Mail: jean poi4ers.fr PBS secteur α Niveau 1 Salle MS Q24 Cytomètre analyseur BD FACSVerse Cytomètre trieur BD FACSAria III

45 Maintenant, c est à vous.. Histogram Dot plot Contour plot 3D plots/isometric Dot plot with projection

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