Méthodes expérimentales en immunologie

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1 Méthodes expérimentales en immunologie 1 Techniques de phénotypage 2 Analyse fonctionnelle in vitro 3 Modèles de souris Marie Alix Poul Institut de recherche en cancérologie, Montpellier marie alix.poul pearson@univ montp2.fr FMBS215

2 Informations données par la cytométrie en flux sur une cellule taille relative (Forward Scatter FSC) granularité relative ou complexité interne (Side Scatter SSC) intensité relative de fluorescence (FL1, FL2, FL3 et FL4 voire FL5, FL6,.et plus encore): marquage anticorps (ou sonde biochimique)

3 Exemple d analyse: sang humain hémolysé: Diagramme en 2 dimensions ou dotblot: 1 cellule = 1 point Side Scatter (gran nularit té) Neutrophiles Monocytes Lymphocytes Right Angle Light Detector --> fonction de la complexité cellulaire Forward Light Scatter (taille) Lumière Incidente Forward Light Detector --> fonction de la taille de la cellule

4 Analyse cytométrie en flux DotBlot (graphe en 2 dimensions) Histogramme (1 seul marquage représenté, MFI: intensité moyenne de fluorescence) Multimarquages Marquage intracellulaire (perméabilisation/fixation des cellules) Technique des «tétramères»

5 Détection de T spécifiques: Principe des tétramères MHC peptide Production de molécule MHC classe I ou 2 biotinylée chez E. coli Dénaturation Renaturation en présence de peptide Tétramérisation par ajout de streptavidine (couplée à un fluorochrome) => forte affinité «fonctionnelle» Ex: Mise en éid évidence d une réponse T CD8 spécifique du cytomégalovirus chez un patient HLA A2 Préparation des PBMC (peripheral blood mononuclear cells) par gradient de Ficoll Co marquageanticorps anti CD8/tétramère de molécule HLA A2 peptide CMV)

6 tétramère de CD1d / α Galactosyl Ceramide Détection/purification des inkt tétramère de CD1d / α GalCer inkt souris autres T conventionnels

7 stratégies de tri Cytomètre associé à un système de tri Long mais indispensable pour des séparations sur de multiples li l paramètres, possibilité de tri sur un marqueur biochimique. Possibilité d analyse couplée au tri de cellules/s. Séparation par phase solide (fond en plastique des boîtes de Pétri ou de culture cellulaire, billes de taille et de nature diverse ) Les cellules sont retenues soit par adhérence spontanée, soit par affinité par l intermédiaire d anticorps monoclonaux ou de lectines. «sélection positive» : population d intérêt retenue par la phase solide «sélection négative» : population non retenue ( séparation plus «neutre» fonctionnellement) Plus simple, moins couteux, pureté inférieure au tri par cytométrie, pas toujours applicable

8 Technique MACS («Magnetic activated cell sorting») Billes d oxyde de fer et de polysaccharide, diamètre de 50 nm couplées à des anticorps Colonne de séparation magnétique placée dans un aimant de très forte puissance. Le tri est simple, rapide, pureté 50> > 95%, rendement > 90%, tri rapide de 10 9 cellules (1 étape; 10 min.). Présence des billes compatible avec un tri ultérieur en cytométrie de flux. Ex: Tri négatif: élimination des cellules T dans le cadre des allogreffes de moelle (sur colonne couplée à un anticorps monoclonal pan T.

9 Combinaison tri magnétique/cytométrie pour les populations rares Trier à partir de10 9 cellules totales, une sous population qui représente 0,5 % de la suspension cellulaire l (soit 5,10 6 cellules l à obtenir) : Enrichissement; moins de 10 minutes de tri avec l Automacs pour avoir 10 7 cellules, pures à 50 %, puis 30 minutes pour amener cette pureté à 98 % par cytométrie en flux sur un trieur à haute vitesse ( cellules). => Obtention en 40 min. de 5,10 6 cellules de la population cible pure à 98 % à partir d une population où elle est peu représentée (0,5 %). Un cytomètre très rapide ( cellules/seconde) demanderait tout de même environ... h de travail...

10 Stratégies de tri des Tregs pour amplification ex vivo Tri magnétique des CD4 puis Tri par cytométrie 7 CD12 CD4 +, CD127, CD25 high CD127 CD4 CD4+, CD45RA +, CD25 high

11 Histochimie: Tissue micro array TAM Tissue micro array TMA: immunohistochimie à haut débit; fragments (carottage) de tissus d environ 0,6 mm de diamètre obtenus de tissus inclus en paraffine, disposition dans un bloc de paraffine en espacement réguliers Coupes/microtome, montage sur lame pour analyse

12 Détection de T mémoires CD45R0 dans des biopsies Biopsies de patients diagnostiqués avec un cancer colorectal de stade I et II (HEGP)

13 Analyse des répertoires BcR ou TcR Extraction ARN Amplification PCR - amorce V spécifique/amorce C spécifique - précurseurs nucléotidiques fluorescents Electrophorèse capillaire Profil gaussien; répertoire poyclonal Amplification d un p clone

14 Répertoire anti Flu1... we expand CD4+ T cells from the influenza specific memory pool of two HLA DR1+ donors (known responders to peptide HA ). Ten day cultures of 10 6 peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) with the peptides Flu1 gave CD4+ HLA DR1/HA tetramer positive cells. We investigated TCR usage by the amplified populations p (FLu1) to establish the repertoire deployed against Flu1 peptide... pp Numbers indicate the % of T cellswith ihtrbv usage

15 Fluorescent CllB CellBar coding Code barre fluorescent Multi marquage et analyse dans un seul tube de plusieurs populations: Comparaison normalisée des intensités de signaux Simplicité, ité rapidité Nature Methods 3, (2006)

16 Fluorescent CllB Cell Bar coding Analyse dans un même tube de plusieurs populations (marquées avec un code barre d intensité variable selon le traitement) Comparaison des intensités ité de signaux de signaux de phospho STAT1 h et phospho STAT6 h Nature Methods 3, (2006)

17 Production de cytokines Dosage de cytokines dans un surnageant de culture: ELISA Cytometric Beads Array (dosage de plusieurs cytokines possible: analyse multiple) Mesure du nombre de cellules produisant un type de cytokines ELISPOT Marquage intracellulaire de cytokines/facs (possibilité de détecter plusieurs cytokines à la fois)

18 Cytometric Beads Array Immunoassay Lecture possible de 100 analytes à la fois

19 Technique ELISPOT:«Enzyme linked immunospot» 1983, à l origine, utilisée pour l activation des cellules B (mesure de la sécrétion des Ig), en 1996, adaptée pour l analyse de l activation des lymphocytes T. Détecter et dénombrer les cellules T activés chez un patient, en détectant la sécrétion de cytokines (l INFγ notamment).

20 Caractérisation fonctionnelle d épitopes T: ELISPOT Recherche d une réponse T anti-ep-cam: nombre fixe de PBL d'un patient HLA*0201 atteint d un colocarcinome incubés avec des + peptides issus d Ep-CAM Ep-184 (ILYENNVIT) 4 Ep-184b (ILYENNVITI) 80 Milieu 0 PHA

21 Proliferation/division i i cellulaire/mort l cellulaire l (apoptose) Cytometrie de flux: iodure de propidium (cellules mortes, répartition dans les phases du cycle), 7 AAD BrdU, EdU: cellules en phase S CFSE; carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester: colorant fluorescent permettant de suivre la division des cellules (diminution des intensités de fluorescence selon les divisions), in vitro et in vivo (injection puis prélèvement). Annexin V: affinité pour la phosphatidyl serine, externalisée pendant l apoptose Microscopie: DAPI, Hoechsht Thymidine tritiée ou BrdU: quantification de l incorporation dans l ADN au cours de laphase S

22 Fonctions effectrices Cytotoxicité (NK, CTL, NKT): mesure de la radioactivité ité présente dans le surnageant de cellules cibles préalablement chargées en 51 Cr Méthodes cytométriques équivalentes Réponse anticorps: ELISA

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24 Modèles de souris humanisées

25 Souris immunodéficientes pour la reconstitution d un SI humain Souris nude; sans thymus: pas de LT thymodépendants Souris SCID (severe combined immunodeficiency, prkdc / ): pas de B et de T matures, mais des NK Souris NOD: diabète, anomalie IFN, anomalie activité NK Souris NOD SCID: absence de B, T et anomalie activité de NK. Souris beige (bg): anomalie des macrophages et neutrophiles, anomalie NK et CTL Souris RAG / : (recombinaisons activating genes) absence de T et B matures Souris NSG: NOD/SCID IL2R / (2004) IL2R / absence e de B, T et NK. Souris BRG: BALB/C, RAGR2 /,IL2R / (2005): absence de B, T et NK.

26 Protocole pour l étude de pathologies infectieuses chez la souris humanisée

27 Différences SI homme/souris Mestas J. et al. 2005

28 Différences SI homme/souris Mestas J. et al. 2005

29 Différences SI homme/souris La souris est un modèle pour étudier les réponses immunitaires et l immunopathologie immunopathologie, de tester des médicaments mais pas forcément transposable à l homme Les souris à lignée hématopoïétique humaine permettent d étudier le SI humain et ses interactions avec des virus infectant les cellules immunitaires à tropime strictement humain vis à vis de tumeurs humaines

30 Démarche expérimentale et analyse d article Marie Alix Poul Institut de recherche en cancérologie, Montpellier marie alix.poul pearson@univ montp2.fr FMBS215

31 Démarche expérimentale canonique Question dans un contexte: Est ce que l interaction de la protéine A avec B est impliquée dans le processus P? Synthèse des conclusions Questions ciblées: Est ce que A interagit avec B? Est ce que A est impliquée dans le processus P? Est ce que B est impliquée dans le processus P? Est ce que le processus P est affecté si on abolit l interaction entre A et B? Pour chaque question ciblée: Choix d une stratégie expérimentale permettant de répondre: Ex: Est ce que A interagit avec B? Interaction de 2 protéines recombinantes in vitro? Interaction in vivo (co immunoprécipitation, double hybride...)? Est ce que des mutations dans le gène A peuvent compenser des mutations dans le gène B? Conclusions pour chaque question ciblée Pour chaque expérience: 1) réalisation, 2) description 3) interprétation

32 Le choix de l article Site PubMEd: nlm nih Titre Auteurs et nom du(des) laboratoire(s) Mots clés (keywords) Résumé (abstract) Introduction Résultats Tableaux (tables) et figures Discussion Matériel et Méthodes Autres items variables Données supplémentaires disponibles enligne (supplementary information ousupplemental data)

33 Le facteur d impact dun d un article Il rend compte de l impact dans la communauté scientifique d un revue (et (t attention, en aucun cas d un article). Calcul : Soit IFn(R) le coefficient d impact d une revue «R» (ou «impact factor») de l année n. IF année n d une revue: Nombre de citations année n 2+ année n 1 Nombre d articles publiés année n 2 + année n 1 d d b d l él é l l correspond donc un nombre moyen de citations court terme. Plus est élevé, plus les articles publiés par la revue considérée sont cités (à court terme).

34 50% des journaux d immunologie ont un facteur d impact supérieur à 3

35 Etape de l analyse d article 1) Compréhension nécessité d informations complémentaires 2) Analyse critique 3) Restitution

36 1 Phase de compréhension de l article Comprendre la démarche et le point de vue des auteurs Comprendre la problématique Comprendre la démarche expérimentale Comprendre les résultats de chaque expérience Comprendre les interprétations ti des auteurs Faire une synthèse

37 1 Phase de compréhension de l article 1 1 Comprendre la problématique : Les objectifs : identifier la (les) question(s) posée(s) connaîtrele contexte : qu est ce qui est connu sur le sujet au moment de la publication? identifier les principales conclusions Les sources d information : dans l article : Titre, résumé, introduction, parfois le début de la discussion Chercher h un article de revue Chercher un autre article de recherche Choisir un autre article si la question q posée ne vous paraît pas intéressante ou pertinente

38 1 Phase de compréhension de l article 1 2 Comprendre la démarche expérimentale : Les objectifs : pour chaque méthode employée, connaître le principe (c.a.d. les grandes étapes du protocole), comprendre sa finalité, si possible, s interroger sur ses limites Les sources d information : dans l article : Matériel et méthodes, résultats vos cours certains ouvrages articles de recherche cités articles de la série des Methods in

39 1 Phase de compréhension de l article 1 3 Comprendre les résultats de chaque expérience : Les objectifs : pour chaque figure ou tableau de résultat présenté identifier les «témoins» et analyser les résultats leur correspondant, identifier les «essais» et analyser les résultats leur correspondant, comprendre les conclusions tirées de l expérience par les auteurs. Les sources d information : dans l article uniquement : Matériel Méthodes, Résultats Distinguer témoins positif et négatif Distinguer g témoin positif (négatif) biologique gq ou témoin positif (négatif) d analyse. Repérer la significativité des résultats

40 1 Phase de compréhension de l article 1 4 Comprendre les interprétations formulées par les auteurs : L objectif: expérience par expérience, comprendre les interprétations proposées par les auteurs. Les sources d information : Dans l article uniquement : partie Résultats. 1 5 Effectuer une synthèse : L objectif : Recenser les différentes conclusions, et s efforcer de les rassembler Hiérarchiser les conclusions. Les sources d information : dans l article uniquement : Résultats, Discussion, Titre, Résumé

41 2 Phase d analyse critique «procéder à une analyse critique» signifie «s interroger» 1 Questionnement méthodologique Pour chaque expérience décrite dans l article : La stratégie expérimentale utilisée permet elle de bien répondre à la question posée? Les témoins sont ils selon vous suffisants? Les témoins donnent ils bien les résultats attendus? 2 Questionnement sur l analyse des résultats par les auteurs Pour chaque expérience décrite dans l article : Les résultats obtenus vous paraissent ils convaincants? Êtes vous convaincu par les interprétations proposées?

42 2 Phase d analyse critique 3 Questionnement sur les conclusions formulées par les auteurs Les différentes expériences vous paraissent elles cohérentes ou voyez vous vous des contradictions Les conclusions tirées sont elles cohérentes avec les données de la littérature t dont vous avez connaissance? 4 Questionnement sur les perspectives ouvertes par l article Quelle stratégie expérimentale pourriez vous proposer pour confirmer ou infirmer les conclusions importantes de l article? Quelle «nouvelle» question suscitent les conclusions de l article?

43 3 Restitution (présentation orale) 1 Situer la problématique (5 min max) Donner les connaissances (contemporaines de la publication) essentielles la compréhension (il faut être concis) ; Formuler de manière explicite la(les) question(s) posée(s) par l article. 2 Présenter et interpréter des résultats choisis Faut il présenter tous les résultats? Ce n estpasobligatoire nest obligatoire, et cest c estrarement possible dans le temps qui vous est imparti. Cela implique : de choisir judicieusement les expériences que vous allez présenter ; d être néanmoins capable de répondre à des questions concernant les expériences que vous n avez pas présentées. Faut il présenter les résultats dans l ordre de l article? Ce n est pas obligatoire, il est parfois plus facile de présenter les données dans un ordre différent de celui de la publication.

44 Comment présenter une expérience (et donc d une figure) 1 Indiquer précisément la question posée. 2 Présenter la méthode expérimentale utilisée pour répondre à la question. Si nécessaire, élaborer un schéma présentant son principe. 3 Projeter le résultat de l expérience (tableau ou figure) ; il doit être accompagné : d un titre (qui ne doit pas donner la conclusion de l expérience) mais faire référence à la stratégie té expérimentale éi tl utilisée ; d une légende. Si la légende de l article est trop sommaire ou difficile à comprendre sur la publication, ne pas hésiter à refaire une légende didactique. 4 Décrire les résultats obtenus sans les interpréter. 5 Commenter les résultats obtenus pour les témoins. 6 Présenter les interprétations des auteurs. 7 Effectuer une analyse critique des résultats et de leurs interprétations.

45 Exemple 1:

46 Exemple 2: Impression des 4 premières pages

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48 2015 FMBS215 Immunopathologie première série d'articles article 1 A germinal center independent pathway generates unswitched Justin J. J. Exp. Med. Vol. 209 memory B cells early in the primary Taylor, et al. No , 2012 response article 2 Selective depletion of Foxp3+ J exp MedVol. 204, No. regulatory T cells induces a scurfy-like Lahl K et al. 1, January 22, 2007 disease article 3 Sodium Chloride Drives Autoimmune Markus Nature April 25; Disease by the Induction Kleinewietfeld 496(7446): of Pathogenic Th17 Cells article 4 article 5 Down-Regulation of Interferon Signature in Systemic Lupus Erythematosus Patients by Active Immunization With Interferon Kinoid Bernard R. Lauwerys, ARTHRITIS & RHEUMATISM, Vol. 65, No. 2, February 2013, pp Expression Profiles of MYC Protein and MYC Gene Rearrangement in Lymphomas article ce 6 Exhaustion of bacteria-specific CD4 T cells and microbial translocation in common variable immunodeficiency disorders article 7 article 8 article 9 article 10 T helper 17 cells play a critical pathogenic role in lung cancer Gut Microbiota Elicits a Protective Immune Response against Malaria Transmission Karen M. Chisholm, Perreau, M Seon Hee Chang Am J Surg Pathol Volume 00, Number 00, 2015 J. Exp. Med Vol. 211 No date présentation 12-févr 19-févr 19-févr 26-févr 05-mars 19-mars intervenant superviseur Etudiants LG/MAP LG/MAP TV TV CR PC PNAS April 15, 2014 vol mars MAP no. 15 Bahtiyar Cell 159, , Yilmaz, December 4, 2014 Cell Death and Disease( Functional expression cloning identifies COX-2 as a suppressor of antigen-specific cancer immunity Göbel-C 2014) 5, e1568; doi: /cddis Changes in antigen-specific T-cell number and function during oral desensitization in cow s milk allergy MucosalImmunology VOLUME 5 NUMBER 3 26-mars 02-avr 09-avr PC MAP FC