CYTOSQUELETTE et MOBILITE

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1 Master Physiopathologie Cellulaire et Moléculaire Option Cancérologie CYTOSQUELETTE et MOBILITE Eric GUERIN Laboratoire de Biochimie et de Biologie Moléculaire - Hôpital de Hautepierre EA 4438 Physiopathologie et Médecine Translationnelle - UdS Marqueurs Moléculaires de Progression Tumorale et de Sensibilisation aux Drogues Anticancéreuses

2 Le processus métastatique Dissociation cellulaire Modification phénotypique (EMT) Franchissement Membrane Basale Dégradation de la MEC Profondes modifications dans les mécanismes d adhérence et de migration cellulaire Sous-tendues par des remaniements importants du cytosquelette (mobilité)

3 Cytosquelette - Généralités Toutes les cellules eucaryotes possèdent un cytosquelette Formé de 3 réseaux protéiques - les microfilaments - les filaments intermédiaires - les microtubules

4 Cytosquelette - Généralités Microfilaments (actine) en rouge Microtubules (tubuline) en vert

5 Cytosquelette - Généralités Forme et polarité cellulaire Ancrage des organites et des structures cellulaires Mouvements des organites et des chromosomes Fonctions du cytosquelette Forces de tension Motilité cellulaire Déplacements cellulaires Endo et exocytose

6 1 ) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments Structure Ø 5 à 9 nm Microscopie électronique Molécule d actine Fins filaments de 5 à 9 nm de diamètre, composés de 2 chaînes enroulées en hélice Polymères d une protéine globulaire = actine Actine = une des protéines les plus abondantes de la cellule, très conservée durant l évolution généralement de 5 à 10% des protéines totales jusqu à 20% dans les cellules musculaires 3 classes d actine, présentant de très fortes homologies de séquence actine α = majoritaire dans les cellules musculaires (muscles striés et lisses) actine β et γ = majoritaires dans les autres types cellulaires

7 1 ) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments Assemblage L assemblage monomère actine G (globulaire) polymère actine F (filament) se fait en 3 phases Phase 1 = Nucléation Formation du noyau initial = trimère Nucléation Extrémité Croissance lente Phase 2 = Elongation Croissance du microfilament Ajout de monomères aux 2 extrémités Extrémité + croissance rapide Extrémité croissance lente Microfilament polarisé Extrémité + Croissance rapide Phase 3 = Equilibre dynamique Extrémité - Microfilament de taille constante avec équilibre entre les monomères qui s accrochent et se détachent du microfilament Extrémité + Equilibre dynamique des microfilaments

8 1 ) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments Equilibre dynamique L actine est une molécule qui lie l ATP Au sein du microfilament, l ATP est hydrolysé de façon spontanée actine-adp Conséquences : changement de conformation de l actine des forces de liaisons avec les sous-unités voisines dépolymérisation Extrémité Croissance lente Vitesse addition actine < Vitesse hydrolyse ATP Extrémité + Croissance rapide Vitesse addition actine > Vitesse hydrolyse ATP Actine-ADP prédomine A l équilibre Flux net = dépolymérisation des sous-unités Actine-ATP prédomine A l équilibre Flux net = polymérisation des sous-unités Phénomène du tapis roulant = treadmilling

9 1 ) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments Equilibre dynamique Mise en évidence du treadmilling Extr + Extr -

10 1 ) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments Plusieurs protéines de liaison à l actine régulent in vivo cette dynamique des microfilaments Rôle +++ dans le remodelage du cytosquelette lors de la migration Cofiline Profiline ARP2/3 Forte affinité pour l actine-adp Dépolymérise les filaments d actine à partir de l extrémité moins Induit des cassures dans les filaments d actine Stimule l échange ADP/ATP Régénération de monomères actine-atp pour la polymérisation Induit la nucléation in vivo à partir de monomères libres Se fixe sur des filaments déjà existants branchements (formation d un réseau de microfilaments)

11 1 ) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments Plusieurs toxines interfèrent avec la dynamique des microfilaments d actine Outils utilisés en Biologie Cellulaire Les cytochalasines D ou B se lient à l extrémité + des microfilaments d actine bloquent l addition de nouveau monomères dépolymérisation à l extrémité - disparition des microfilaments La latrunculine A se lie aux monomères d actine G (globulaire) inhibe la polymérisation des microfilaments La phalloïdine se lie latéralement aux filaments d actine F polymérisée stabilise les microfilaments couplée à un fluorophore visualisation des microfilaments

12 2 ) Organisation intracellulaire du cytosquelette d actine 3 types d arrangements selon la nature des protéines associées a. Les faisceaux parallèles serrés Dans les filopodes (fines projections cytoplasmiques) émis sur le bord des cellules en migration Marquage de l actine F (polymérisée) en rouge (Phalloïdine-TRICT)

13 2 ) Organisation intracellulaire du cytosquelette d actine 3 types d arrangements selon la nature des protéines associées a. Les faisceaux parallèles serrés Dans les filopodes (fines projections membranaires) émis sur le bord des cellules en migration Dans les microvillosités intestinales Filaments orientés avec la même polarité Faisceaux serrés car reliés par des protéines intercalaires de petite taille (villine, fimbrine) Faisceau de filaments d actine

14 2 ) Organisation intracellulaire du cytosquelette d actine b. Les faisceaux contractiles Dans les sarcomères = unités contractiles du muscle strié

15 2 ) Organisation intracellulaire du cytosquelette d actine b. Les faisceaux contractiles (suite) Dans les ceintures d adhérence reliant les jonctions adhérentes présentes au pôle apical des cellules épithéliales Contraction Cohésion tissulaire Dans l anneau contractile des cellules en division Contraction Cytodiérèse (séparation cellulaire)

16 2 ) Organisation intracellulaire du cytosquelette d actine b. Les faisceaux contractiles (suite) Dans les «fibres de stress» au niveau des plaques d adhésion focales à la matrice extracllulaire Contraction force de tension (adhérence et migration) Marquage de l actine F (polymérisée) en vert (Phalloïdine-FITC)

17 2 ) Organisation intracellulaire du cytosquelette d actine b. Les faisceaux contractiles (suite) Disposition lâche car reliés par un dimère d α-actinine de grande taille Insertion possible d un complexe bipolaire de plusieurs molécules de myosine II activation de la myosine II force de contraction entre filaments d actine

18 2 ) Organisation intracellulaire du cytosquelette d actine b. Les faisceaux contractiles (suite) L activation de la myosine II dépend de la phosphorylation de ses chaînes légères Activation de la Myosine Light Chain Kinase (MLCK) (voie Ca 2+ - calmoduline) Inhibition de la MLC Phosphatase (voie impliquée dans la régulation du cytosquelette lors de la migration) DEPHOSPHORYLATION BY MLC Phosphatase

19 2 ) Organisation intracellulaire du cytosquelette d actine c. Les réseaux formant des mailles Dans les lamellipodes (larges extensions membranaires) émis sur le bord des cellules en migration

20 2 ) Organisation intracellulaire du cytosquelette d actine c. Les réseaux formant des mailles Dans les lamellipodes (larges extensions membranaires) émis sur le bord des cellules en migration Dans le réseau d actine corticale sous-membranaire Filaments en disposition +/- orthogonale stabilisés par la filamine

21 3 ) Principales fonctions des microfilaments d actine Rôle architectural Contraction du muscle squelettique strié Séparation des cellules après la mitose (anneau contractile) Repliement des feuillets embryonnaires en tubes (tube neural) Maintien de la cohésion tissulaire (ceinture d adhérence) Transport de vésicules, via la myosine de type I Transport intracellulaire de virus et bactéries (Listeria, ) Phagocytose Migration cellulaire

22 4 ) Remodelage du cytosquelette d actine au cours de la migration a. Le modèle de migration cellulaire sur un support 2D Au bord avant : Formation de filopodes et de lamellipodes liés à une polymérisation dirigée de l actine qui pousse la membrane sur le bord avant Adhésion : Formation de nouveaux contacts focaux Translocation du corps cellulaire Mise en jeu des forces contractiles actine-myosine Rétractation avec dissolution des mécanismes d adhésion à l arrière de la cellule

23 4 ) Remodelage du cytosquelette d actine au cours de la migration b. Mise en évidence du rôle des petites protéines G monomériques (Rho GTPases) Cdc42 Formation de filopodes Rac Formation de lamellipodes Rho Formation de fibres de stress et contacts focaux

24 4 ) Remodelage du cytosquelette d actine au cours de la migration c. Que sont les petites protéines G monomériques de la famille des Rho GTPases? Activation = Fixation GTP Stimulée par protéines de type GEF Guanine nucleotide Exchange Factor Forme inactive liée au GDP Forme active liée au GTP Inactivation = Hydrolyse du GTP Stimulée par protéines de type GAP GTPase Activating Protein

25 4 ) Remodelage du cytosquelette d actine au cours de la migration d. Quels sont les signaux activateurs des RhoGTPases? Chemoattractants Activation de la voie Pi3K Production de PiP3 Activation des GEF (parmi d autres ) RhoGTPases sous forme active liée au GTP

26 4 ) Remodelage du cytosquelette d actine au cours de la migration e. Quels sont les effecteurs des RhoGTPases au cours de la migration cellulaire? Au front de migration cellulaire Emission de filopodes et lamellipodes Cdc42 Se lie DIRECTEMENT et active des protéines de la famille WASP (N-WASP) Activation du complexe ARP2/3 Nucléation et polymérisation de l actine dans les filopodes Active une kinase intermédiaire PAK Active la kinase LIMK Phosphoryle et INACTIVE la cofiline Stabilise la polymérisation de l actine Rac Se lie INDIRECTEMENT et active d autres protéines de la famille WASP (WAVE) Activation du complexe ARP2/3 Nucléation et polymérisation de l actine dans les lamellipodes A l arrière de la cellule Forces contractiles myosine-dépendantes pour la traction cellulaire Rho Active une kinase intermédiaire ROCK Phosphoryle et INACTIVE Phosphatase de la MLC Chaîne légère de la myosine PHOSPHORYLEE Activation de la myosine II et force de contractile

27 II - LES MICROTUBULES 1 ) Structure, assemblage et dynamique des microtubules Structure Ø 25 nm Microscopie électronique Longs cylindres creux de 25 nm de diamètre Polymérisation de sous-unités = dimères de tubulines α et β, (protéines globulaires) Chaque tubuline peut s associer au GTP, mais seule la tubuline β peut hydrolyser/échanger son GTP

28 II - LES MICROTUBULES 1 ) Structure, assemblage et dynamique des microtubules Assemblage Extrémité + Croissance rapide Microtubule polarisé Extrémité Croissance lente (classiquement 13) (10 à 15)

29 II - LES MICROTUBULES 1 ) Structure, assemblage et dynamique des microtubules Instabilité dynamique Les MT sont caractérisés par une très grande instabilité dynamique Alternance de cycle de croissance décroissance positionnement dynamique des organites cellulaires transportés par les MT

30 II - LES MICROTUBULES 2 ) Organisation intracellulaire des microtubules In vivo, le centrosome est le centre organisateur des MT L extrémité de tous les MT est enchassée dans le centrosome Extrémité + : s étend à la périphérie de la cellule Centrosome = 2 centrioles perpendiculaires (9 triplets de MT STABLES)

31 II - LES MICROTUBULES 2 ) Organisation intracellulaire des microtubules Duplication du centrosome dans les cellules en division Formation des MT du fuseau mitotique La protéine APC participe à la fixation des MT du fuseau mitotique sur les chromosomes Si APC muté : Anomalie de ségrégation des chromosomes

32 II - LES MICROTUBULES 3 ) Les protéines associées aux microtubules Rôle structural d organisation et de stabilisation du réseau des MT

33 II - LES MICROTUBULES 3 ) Les protéines associées aux microtubules Transport antérograde - + Transport rétrograde + -

34 II - LES MICROTUBULES 4 ) Cibles d agents anticancéreux 2 classes de composés 1. Agents DÉSTABILISATEURS des microtubules Vinblastine (Velban ), Vincristine (Onvovin ), Vinorelbine (Navelbine ) vinca-alcaloïdes dérivés de Pervenche se fixent sur les sous-unités de β-tubuline à l extrémité + bloquent la polymérisation des microtubules (interphase/mitose : poisons du fuseau) Cellules contrôles Cellules traitées avec vinblastine

35 II - LES MICROTUBULES 4 ) Cibles d agents anticancéreux 2 classes de composés 1. Agents DÉSTABILISATEURS des microtubules Combretastatines : CA-4-Phosphate (Zybrestat ) = AGENT ANTI-VASCULAIRE se fixent préférentiellement sur les dimères α/β-tubuline le long des microtubules inhibent l association latérale des protofilaments formant les microtubules Cellules endothéliales contrôles Cellules traitées avec CA-4-P

36 II - LES MICROTUBULES 4 ) Cibles d agents anticancéreux 2 classes de composés 2. Agents STABILISATEURS des microtubules Taxanes : Paclitaxel (Taxol ) et Docetaxel (Taxotere ) se lient aux microtubules polymérisés sur la face interne du MT stabilisent les MT en «redressant» la conformation de la β-tubuline liée au GDP inhibition de la dépolymérisation des MT (interphase/mitose avec blocage division cellulaire) Cellules contrôles Cellules traitées avec Taxol Paquets de MT stabilisés

37 II - LES MICROTUBULES 4 ) Cibles d agents anticancéreux 2 classes de composés 2. Agents STABILISATEURS des microtubules Epothilones : ixabepilone (Ixempra ) se lient aux microtubules sur un site proche de celui des taxanes stimulent la polymérisation de la tubuline en microtubule

38 III - LES FILAMENTS INTERMEDIAIRES Assemblage de plusieurs tétramères bout à bout Protofilament 8 protofilaments superenroulés

39 III - LES FILAMENTS INTERMEDIAIRES Desmosmes et hémidesmosomes La spécificité tissulaire d expression des FI est en anatomie-pathologie pour déterminer l histogenèse des tumeurs (nature du tissu d origine des cellules tumorales)

40 III - LES FILAMENTS INTERMEDIAIRES Les filaments intermédiaires confèrent aux cellules leur stabilité mécanique