La transcription. BioGen DC Gillan UMons 1. transcription. traduction. La transcription

Transcription

1 La transcription transcription traduction La transcription Un gène ne code pas directement pour un polypeptide Un intermédiaire est d abord synthétisé : l ARN messager (mrna). L ADN est transcrit en mrna. Raisons probables : - Protection de l information de départ dans l ADN - Amplification du signal (1 gène bcp mrna, chaque mrna bcp de polypeptides) - Régulation du signal : le mrna se dégrade facilement, le signal peut donc s éteindre, ce qui arrête la production du polypeptide (la transcription peut être maintenue «on» ou «off»). BioGen DC Gillan UMons 1

2 La transcription est réalisée par l'arn polymérase à partir d un promoteur. Promoteur unité de transcription 1. Initiation ARN polymérase : fixation sur le promoteur Lorsque l ARN polymérase est liée au promoteur les brins d ADN commencent à se séparer. 2. Elongation 3 5 mrna brin codant brin matriciel Le mrna est synthétisé dans le sens 5-3. Seul un brin est transcrit : brin matriciel. 3 L hélice d ADN se reforme immédiatement 5 mrna 5 - mrna complémentaire du brin matriciel - même séqu. que brin codant - U à la place des T BioGen DC Gillan UMons 2

3 3. Terminaison signal «stop» = terminateur mrna Le mrna est libéré et l ARN polymérase se détache En résumé : - L ARN polymérase ne fonctionne que dans le sens Pas d'amorce - Besoin d un promoteur - Seul un brin est transcrit : le brin matriciel Unité de transcription = fragment d ADN transcrit en mrna Correspond généralement à un ou plusieurs gènes. Rem : ce n est pas toujours le même brin qui est codant (mais c est toujours le même pour un polypeptide donné) BioGen DC Gillan UMons 3

4 Bacteria et Archaea : Un seul type d ARN polymérase Eukarya Trois types d ARN polymérase ARN polymérase I ARN polymérase II ARN polymérase III synthèse rrna synthèse mrna synthèse trna et prna La transcription chez les bactéries Tous les gènes ne sont pas transcrits en même temps. Importance des facteurs sigma (svt : σ" 70 ) ARN polymérase + 1 facteur sigma : reconnaissance d un promoteur. Promoteur : Site -10 : boîte Pribnow (généralement TATAAT) Site -35 : généralement TTGACA BioGen DC Gillan UMons 4

5 ARN polymérase + facteurs de transcription = complexe d initiation de la transcription Bacteria ARN polymérase facteur sigma (σ) début mrna Promoteur 1 : 5 -CTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAG-3 Promoteur 2 : 5 -CTATTCCTGTGGTGGTACTAGCTAATTAGAGTTAGAAAACA-3 Promoteur 3 : 5 -TGGTTCCAAAATGTACCAATTTACGATATACTCACAGCATA-3 Promoteur 4 : 5 -TTTTTGAGTTGTATCACCACTGCGATTCTGATCCCATACGTA-3 consensus : TTGACA séquence -35 Promoteur TATAAT boîte de Pribnow = séquence -10 Site d amorçage (+1) = Début du mrna Facteurs - petites protéines (σ" 70 = 70 kda) - principal facteur sigma (σ) chez E. coli : σ" 70 Reconnaît les séquences consensus TTGACA et TATAAT. E. coli : au moins 7 facteurs σ", chacuns reconnaissant séquences consensus. Bacillus subtilis :14 facteurs σ. En fonction du facteur σ présent, les gènes exprimés sont BioGen DC Gillan UMons 5

6 Tout le mrna ne sert pas à synthétiser un polypeptide Un transcrit (mrna) possède : - une région 5' non traduite : 5 -UTR - une région 3 non traduite : 3 -UTR UTR = Untranslated region mrna 5 -UTR segment codant AUG 5 polypeptide codon start 3 -UTR 3 La terminaison chez les bactéries Un signal «stop» provoque le détachement de l ARN polymérase Deux types de signaux «stop» : - Mécanisme intrinsèque - Mécanisme rho-dépendant BioGen DC Gillan UMons 6

7 Mécanisme intrinsèque Apparition d une boucle riche en GC et de 6 A Détachement ARN polymérase et terminaison Mécanisme rho-dépendant - Pas de boucle - Séquence riche en C - Intervention du facteur «rho» : polypeptide hexamérique Détachement ARN polymérase et terminaison BioGen DC Gillan UMons 7

8 La transcription chez les eucaryotes Processus plus complexe que chez les bactéries car : - Génomes plus grands, plus d ADN non-codant «Difficile» de trouver les gènes E. coli : 10 6 bases = 900 gènes Homme : 10 6 bases = 9 gènes - Epissage des introns - ADN associé à des protéines : histones (chromatine) - ADN dans noyau. La traduction doit se faire après (peut se faire en même temps chez les bactéries) Les facteurs généraux de transcription (FGT) chez les eucaryotes Protéines sr fixant sur les promoteurs (boite TATA) avant l arrivée de l ARN polymérase. Formation d un gros complexe de pré-amorçage comportant 6 GTF (=FGT) Premettent de réguler l'expression BioGen DC Gillan UMons 8

9 Les facteurs généraux de transcription (FGT) TFIIA TFIIB TFIID TFIIE TFIIF TFIIHH Ordre d'assemblage précis Importance des protéines activatrices reconnaissant les amplificateurs (en amont ou en aval du promoteur) BioGen DC Gillan UMons 9

10 Epissage du pre-mrna chez les eucaryotes Bactéries : un gène est presque toujours colinéaire avec sa protéine Un gène de 3N nucléotides code pour N acides aminés. gène mrna N protéine C Chez les eucaryotes les gènes sont interrompus par des introns : séquences d ADN non codantes gène Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3 transcription épissage pre-mrna mrna traduction protéine Epissage = délétion précise des introns du pre-mrna Essentiellement via le spliceosome BioGen DC Gillan UMons 10

11 Taille des exons Tend à être petite : pb 6% Homo sapiens Taille exon en pb 80% des exons < 200 pb pb = paires de base Taille des introns Tend à être grande. Grande variabilité de leur taille 20% H. sapiens Taille intron en kb BioGen DC Gillan UMons 11

12 Importance de l'épissage Epissage alternatif exon1 exon2 exon3 exon4 exon1 exon2 exon3 exon4 exon1 exon2 exon4 mrna 1 protéine 1 mrna 2 protéine 2 Maturation du mrna : ajout 5'-CAP (eucaryotes) et queue polya Dans le noyau chez eucaryotes Fonctions 5 -CAP et queue poly(a) : - Export facilité vers cytoplasme - Protection de la dégradation - Fixation sur ribosome BioGen DC Gillan UMons 12

13 Remarques générales sur la transcription - L ARN polymérase n a pas d activité correctrice - Vitesse de propagation : 60 nucléotides / sec. (eucaryotes) - Un gène peut être transcrit par plusieurs ARN polymérases en même temps : amplification signal. En résumé : La transcription! mrna Procaryotes : mrna 5 -UTR Eucaryotes : mrna BioGen DC Gillan UMons 13

14 La traduction RIBOSOME mrna Polypeptide Le code génétique Le mrna va être traduit en un polypeptide par un ribosome. Séquence de nucléotides séquence d acides aminés. 4 nucléotides principaux 20 acides aminés principaux Lien? Si 1 nucléotide = 1 acide aminé Il n y aurait que 4 acides aminés... Si 2 nucléotides = 1 acide aminé Il n y aurait que 16 acides aminés... (2 4 ) BioGen DC Gillan UMons 14

15 Trois nucléotides codent un acide aminé Il y a donc 4 3 = 64 combinaisons possibles Trop, mais le code est dégénéré (redondant) : plusieurs triplets peuvent correspondre à un acide aminé. Un triplet de nucléotides est appelé codon AUG UAC CGG UUA AGC GCG AGU AAA GCG... codon codon sérine Il faut donc 3N nucléotides pour coder une protéine de N acides aminés. Le décryptage du code Premier codon déchifré en 1961 par Nirenberg et Matthaei Synthèse d un mrna artificiel : UUUUUU (polyu) Ajout du polyu dans une éprouvette avec des ribosomes et des acides aminés (+ autres facteurs). Formation de polypeptides de phénylalanine : -Phe-Phe-Phe- Conclusion : UUU = Phe Même expérience avec polya, polyg et polyc : AAA = Lys GGG = Gly CCC = Pro BioGen DC Gillan UMons 15

16 Décodage de triplets mixtes : AUA, CGA, etc... Emploi de techniques plus élaborées 1965 : les 64 codons étaient déchiffrés gâce aux travaux de Khorana, Holley and Nirenberg. Prix Nobel en 1968 Holley Khorana Nirenberg Trp et Met : 1 seul codon Autres aa : 2-6 codons BioGen DC Gillan UMons 16

17 Codons «stop» : UAA, UAG et UGA : fin de la traduction Codon «start» : AUG. Double fonction : - code pour la méthionine (Met) - signal de départ (tous les mrna commencent par AUG) Tous les polypeptides commencent donc par Met ou fmet, mais celui-ci peut être clivé par la suite. Remarques Un acide aminé = plusieurs codons Mais aucun codon ne code pour plus de un acide aminé La redondance n est pas le fait du hasard : souvent, les codons synonymes ne diffèrent que par la 3e base du triplet. Le cadre de lecture est important! Le message est complètement changé si le cadre est décalé. Le code génétique est universel : Archaea, Bacteria, Eukarya. Il est apparu tôt dans l histoire de la vie. Preuve de l évolution et de l unicité du vivant. (il existe quelques exceptions, ou quelques codons ont un code de la majorité des organismes. Ex : paramécies et dans les organites de certaines espèces). BioGen DC Gillan UMons 17

18 Preuve de l universalité du code génétique : Insertion d un gène humain dans une bactérie production d un polypeptide, 100% identique au polypeptide correspondant chez l homme ADN humain (un gène) E. coli polypeptide humain Traduction : mrna polypeptide ARN de transfert (trna) : porteurs d aminoacides 3 site de liaison de l aa : 3, tjs triplet CCA 5 80 nucléotides Anticodon Forme de L inversé BioGen DC Gillan UMons 18

19 20 acides aminés 20 trna Phe Phénylalanine trna : «traducteur» AAA UUU codon UUU Anticodon AAA mrna Principe de la formation d un polypeptide : - Les trna se placent côte-à-côte sur le mrna (codon-anticodon) - Les acides aminés sont reliés les uns aux autres - Les trna «vides» se détachent et vont rechercher un aa libre dans le cytoplasme. Le processus se déroule dans le cytoplasme (Bacteria et Eukarya) au niveau des ribosomes. BioGen DC Gillan UMons 19

20 Chargement des trna : Les enzymes liant les acides aminés aux trna sont les aminoacyl-trna-synthétases : 20 types (car 20 aa) P P P aa libre ATP trna «vide» anticodon P P P P P P aa aa aa-amp 1. Liaison ATP et aa. 2. L ATP perd un P-P et se lie à l aa sous forme d AMP BioGen DC Gillan UMons 20

21 3. Formation d une liaison covalente entre le trna et l aa et largage de l AMP liaison covalente P aa AMP aa-trna aa trna aminoacyl-trna (trna «chargé») 4. L enzyme libère l aa activé BioGen DC Gillan UMons 21

22 Nombre de trnas Si un trna pour chaque codon il y aurait 61 trna (64 3 stop) Or, il n y en a que 45 Certains trna (portant un aa particulier) peuvent se lier à plusieurs codons. Phénomène d oscillation. Thr 5 Thr 5 UGI ACU Présence de nucléotides particuliers (I) dans le trna 3e base du codon UGI ACC mrna Trp et Met : 1 seul codon Autres aa : 2-6 codons BioGen DC Gillan UMons 22

23 Ribosomes Permettent l appariement des anticodons et des codons Synthétisent les polypeptides à partir du mrna. Organites cytoplasmiques, visibles au microscope électronique 2 sous-unités : une grande, une petite Chaque sous-unité est composée de protéines et d ARN ribosomial (rrna). Le ribosome site E site P tunnel de sortie (de l aa) site A site de liaison du mrna E P A Grande sous-unité ribosomique (Bact. 23S, Euc. 28S) Petite sous-unité ribosomique (Bact. 16S, Euc. 18S) Site E : «exit», site de sortie du trna déchargé de son aa. Site P : site de liaison du «peptidyl-trna» : retient le trna qui porte la chaîne polypeptidique Site A : site de liaison de l «aminoacyl-trna» : entrée du trna qui porte le prochain aa. BioGen DC Gillan UMons 23

24 Trois étapes dans le traduction : (i) Initiation (ii) Elongation (iii) Terminaison En plus du mrna, trna et ribosome, nécessité de : - facteurs de traduction (protéiques) - énergie : GTP 1. Initiation (a) Traduction chez les Bacteria site de liaison du mrna Met trna d initiation (porte une Methionine modifiée fmet : formylméthionine) UTR UAC AUG 3 mrna petite ss-unité Le site de liaison du mrna reconnaît une séquence spécifique en amont du codon «start» (AUG) BioGen DC Gillan UMons 24

25 1. Initiation (b) : liaison de la grande sous-unité : formation du complexe d initiation Met 5 E UAC AUG A 3 - la formation du complexe consomme du GTP - fmet se place au site P - Nécessité de facteurs d initiation protéiques : eif Rem : - pas de fmet chez Eucaryotes et Archées - Bacteria : dans la 1/2 des cas fmet est clivé en fin de synthèse. transformylase H 3 C Formylméthionine fmet Méthionine Met La transformylase agit une fois que la Met est sur le trna BioGen DC Gillan UMons 25

26 2. Elongation (cycle d élongation) Arg Met UCU 5 E UAC AUGAGA P A 3 L anticodon d un aminoacyl-trna adéquat se lie au codon du site A. L hydrolyse de GTP augmente l exactitude et l efficacité de cette étape. Met Met Arg Arg E UACUCU AUGAGA E UACUCU AUGAGA P A P A Formation d une liaison peptidique entre le nouvel aa apporté au site A et l extrémité carboxyle du polypeptide en cours de synthèse au site P. Le polypeptide se lie au trna au site A. BioGen DC Gillan UMons 26

27 Met Met Arg Arg UAC E UACUCU AUGAGA E UCU AUGAGA P A P A Translocation. Le ribosome fait avancer le mrna. Le trna déchargé du site P se retrouve en au site E et se détache ; le peptidyl-trna du site A se retrouve au site P. Un nouveau cycle recommence avec un nouvel aminoacyl-trna. Le ribosome se déplace sur le mrna de 5 en 3 Met extrémité amine (N-terminale) Arg UAC 5 E UCUNNN AUGAGA P A 3 Start BioGen DC Gillan UMons 27

28 Remarques Le polypeptide sort du ribosome par son extréminé N-terminale Le ribosome «avance» sur le mrna de 5 en 3 A chaque instant, 10 codons se trouvent à l intérieur du ribosome ( 30 nucléotides) 1 cycle d élongation = 1/10e de seconde (Bacteria) 3. Terminaison Arrivée à un codon «Stop» 5 E A NNN NNNUAG P A 3 Stop (UAG, UAA, UGA) BioGen DC Gillan UMons 28

29 b. Hydrolyse de la liaison entre le polypeptide et le trna du site P 5 E NNN NNNUAG P A a. Le site A accepte un facteur de terminaison (protéique) 3 Libération du polypeptide 5 E NNN NNNUAG P A 3 BioGen DC Gillan UMons 29

30 Dissociation du complexe 5 3 Remarques : - 1 seul ribosome met 1 minute pour synthétiser un polypeptide de taille moyenne. - Plusieurs ribosomes traduisent le mrna en même temps : formation d une file de ribosomes = polyribosome ou polysome Trouvés chez procaryotes et eucaryotes (plus longs chez les procaryotes) 1 mrna synthèse de multiples polypeptides à la fois BioGen DC Gillan UMons 30

31 Repliement des polypeptides et modifications post-traductionnelles : Pendant la synthèse la chaîne polypeptidique peut se replier spontanément : elle adopte une conformation 3D spécifique. Gène structure primaire conformation 3D Souvent, une chaperonine contribue à plier correctement le polypeptide. Modifications post-traductionnelles : - ajout de glucides, lipides, phosphates, etc., à certains aa. - clivage de certains aa de l extrémité N-terminale (Met) - clivage du polypeptide en plusieurs morceaux. Ex : insuline. - union de plusieurs polypeptides. Ex : Hb. BioGen DC Gillan UMons 31

32 Mutation et recombinaison L information génétique peut être modifiée : Mutation : changement stable et héréditaire qui intervient au niveau d une paire de base. Effets souvent limités. Production de mutants. Recombinaison génétique : combinaison de deux brins d ADN pour former un brin d ADN hybride. Recombinaison homologue Recombinaison spécialisée Classification des mutations 1. Selon type cellulaire : mutations somatiques et germinales Organismes pluricellulaires : Milliards de cellules forte probabilité d avoir quelques cellules mutées. Leur qté avec âge. Effets variables : - cellules reproductrices : mutations germinales. Transmises aux descendants. - cellules non reproductrices : mutations somatiques. Non transmises chez organismes ou la reproduction est uniquement sexuée (mammifères) Transmises chez organismes à repro. non sexuée (plantes, cnidaires,... ) Organismes unicellulaires : pas de distinctions entre les 2 types. BioGen DC Gillan UMons 32

33 2. Selon leur cause Spontanées (erreurs de réplication, dépurination : perte A ou G) ou induites (agents physiques : rayons X, γ, UV; chimiques : hydroxylamine, bromure éthidium, acétaldéhyde; biologiques). 3. Selon leur effet sur codon. Mut. Ponctuelles : 1 paire de bases affectée (sont réversibles) Silencieuses : ne modifiant ni l acide aminé ni la protéine (code génétique dégénéré : 3e base du codon) Faux-sens : modifie 1 acide aminé (surtout 1ere ou 2e base codon). Impact variable. Les plus fréquentes. Non-sens : apparition d un codon stop. Par décalage du cadre de lecture : insertion ou délétion d une paire de bases. Effet très néfaste; changements majeurs. Trp et Met : 1 seul codon Autres aa : 2-6 codons BioGen DC Gillan UMons 33

34 4. Selon le type de changement nucléotidique Mutations de transition et de transversion De transition : purine "purine pyrimidine pyrimidine fréquentes De transversion : purine pyrimidine. Mutations par insertion ou délétion de séquences Inactivation d un gène. Ex : insertion d un transposon. Mutations par translocation Simple déplacement d un gène dans le génome. Perte possible des éléments régulateurs. Mutations par inversion Effets variables BioGen DC Gillan UMons 34

35 5. Selon leur effet sur le polypeptide ou l organisme Mutations silencieuses : pas d effet visible Mutation perte de fonction : un polypeptide est produit mais son activité est différente. Perte totale ou partielle de fonction. Résultent par exemple d une mutation faux-sens. Mutation nulle : plus de polypeptide produit (ex : mutation fauxsens : apparition d un codon stop). Mutation gain de fonction : apparition d une nouvelle fonction. Dominant ou codominant chez les diploïdes. Rem : Mutations nulles Pour caractériser l effet d un gène sur le phénotype il est essentiel d examiner un mutant nul. Si le gène est essentiel la mutation nulle est létale. Si le phénotype n est pas affecté le gène n est «pas essentiel» à la survie de l espèce. nulle - non sens - décalage Mutant «knockout» BioGen DC Gillan UMons 35

36 Fréquence des mutations Les mutations de transition sont plus communes Car c est toujours une purine (G, A) face à une pyrimidine (C, T) Exemple : G C A T Mutagenèse Induction de mutations (svt ponctuelles) par des agents chimiques, physiques ou biologiques : agents mutagènes. Agents mutagènes chimiques Trois modes d action : analogues de bases : ressemblent aux bases puriques et pyrimidiques et les remplacent. Nécessité de réplication du DNA. Ex : 5-BrU. agents alkylants : modifient la structure d une base et ses propriétés d appariement. Pas besoin de réplication du DNA (plus puissants mutagènes que analogues). Ex : MNNG. agents intercalants : plans, s insèrent entre les bases. Conformation anormale lors réplication. Ex : acridine orange, proflavine, bromure éthidium. BioGen DC Gillan UMons 36

37 Analogue de base : 5-BrU = 5BU = 5-Bromo-uracile Est incorporé dans l ADN à la place de T Forme lactame : appariement avec A une autre forme tautomérique : forme lactime Syllabus : remplacer - «céto» par lactame - «énol» par lactime Appariement avec guanine (G) Mutations si réplication Il faut une réplication A T réplication incorporation A 5BU réplication (5BU lactime) A T G 5BU réplication G C G 5BU mutation ponctuelle (de transition) fixée BioGen DC Gillan UMons 37

38 Agents alkylants Ajoutent des groupements alkyles Modification covalente de bases guanidine R-N=O nitroso N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine = MNNG Si arrêt de la transcription, arrêt de la division cellulaire Agents alkylants monofonctionnels Ne forment qu un seul lien avec l ADN Provoquent des mutations, pas d arrêt de division Agents alkylants bifonctionnels Formation de liens intra- ou inter-brin. Arrêt de division. Utilisé pour combattre le cancer. Ex : cyclophosphamide S attache à l N n 7 des guanines BioGen DC Gillan UMons 38

39 Agents intercalants Proflavine Agent intercalant causant des délétions ou des insertions de paires de bases (pas de substitutions). Utilisé aussi comme désinfectant bactériostatique actif contre les Gram+ Agents mutagènes physiques Radiations non ionisantes : UV à 260 nm : formation de dimères de pyrimidine (T-T, ou C-C) entre deux bases adjacentes sur un brin. TT AA Bcp utilisés en bactériologie : utilisation d une dose létale tuant 50-90% des cellules d une culture. Isolation des mutants. BioGen DC Gillan UMons 39

40 Importance de l ozone UV-A : nm UV-B : nm UV-C : nm Les plus mutagènes Radiations ionisantes (X,, cosmiques) Pouvoir mutagène plus puissant que les UV Arrachages d e- (formation d ions) Cassent des liaisons hydrogène Oxydation de doubles liaisons Génération de radicaux libres (OH-, etc.) Chaleur Le taux de mutation augmente significativement avec la t C. Même pour des de l ordre de 0.1 C. BioGen DC Gillan UMons 40

41 Agents mutagènes biologiques Erreurs de l'adn polymérase Erreurs des systèmes de réparation de l'adn : ADN polymérases à faible fidélité : ADN polymérase IV et V. Certains transposons (éléments génétiques mobiles) Certains virus Obtention (sélection) de mutants chez les bactéries Le criblage (= screening) : identification de mutants par l observation d un grand nombre de souches. Technique des répliques (des empreintes) de Lederberg Exemple : isolation de mutants nutritionnels (mutants auxotrophes) p/r souche parentale (prototrophe). boite de Petri tampon de velours (réplicateur) BioGen DC Gillan UMons 41

42 Milieu complet Réplique sur milieu sans histidine Colonie His absente Colonie His sélection Les mutations sont : négative - rares (peu de His ) - aléatoires - sélectionnées par le milieu (environnement) BioGen DC Gillan UMons 42