Réplication de l ADN, Mutations et Mutagénèse

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1 UNIVERSITE D ALGER Faculté de Médecine et de Médecine Dentaire ZIANIA (Château Neuf) Réplication de l ADN, Mutations et Mutagénèse COURS DE GENETIQUE

2 La replication d ADN Plusieurs expériences ont permis de démontrer que la réplication s effectue par un mécanisme semi-conservatif. la réplication s effectuait de manière bidirectionnelle à partir d une (procaryotes) ou de plusieurs origines de réplication (eucaryotes) ;

3 La replication d ADN le nombre d origines de réplications dépend de la taille du génome à répliquer la phase S dure environ 2h et peut atteindre plusieurs milliers). Chaque origine de réplication est donc constituée de deux fourches de réplication. La réplication est une réaction rapide : 1000 nucl./sec/fourche de réplication chez les bactéries et 50 nucl./sec chez les mammifères. Chez ces derniers, la réplication s accompagne de la synthèse protéique des histones qui s assemblent pour former la structure chromatinienne. Cette étape supplémentaire ralentit la vitesse de polymérisation.

4 La replication d ADN

5 La replication d ADN chez les procaryotes On distingue ainsi au niveau de chaque fourche de réplication, un brin précoce qui subit une synthèse continue et un brin tardif dont la synthèse s effectue de manière discontinue dans un sens opposé à celui de la progression de la fourche de réplication.

6 La replication d ADN chez les procaryotes Synthèse de la nouvelle chaîne dans le sens 5'-3 ; La synthèse est réalisée par une ADN polymérase, qui ajoute les nucléotides présents dans le milieu à l'extrémité 3'OH d'un nucléotide correctement apparié. La synthèse se fait donc dans le sens 5'-3 du nouveau brin et l activité correctrice dans le sens 3-5.

7 La replication d ADN chez les procaryotes L'activité correctrice consiste à exciser un nucléotide mal apparié qui vient d'être ajouté en bout de chaîne et à reprendre l'élongation. Or, pour ajouter un nucléotide, il faut que le phosphate venant réaliser la fonction diester soit activé, et l'excision d'un nucléotide laisse un phosphate inactivé. Si la synthèse se faisait dans le sens 3'-5', le phosphate participant à la liaison diester serait celui de la chaîne en croissance, qui verrait donc son élongation s'arrêter. Tandis que si la synthèse se fait dans le sens 5'-3', le phosphate désactivé est celui du nucléotide, et l'extrémité 3' OH de la chaîne en croissance peut continuer à recevoir de nouveaux nucléotides.

8 I-1 Initiation de la réplication : La fourche de réplication est initiée par des protéines d initiation (gyrase) qui se fixent sur une séquence particulière riche en AT : l'origine de réplication pour dérouler l ADN par un mécanisme de cassure et réunion. (Fig.1) déroulement de la double hélice par la gyrase a : La double hélice avant l action de la gyrase b : La gyrase coupe le brin (en rouge sur le schéma) et le rabat en dessous du brin (noir) et le recolle. c : ainsi sur deux sillons successifs le brin noir et au- dessus du brin rouge.

9 I-1 Initiation de la réplication : L L' hélicase se lie ensuite à ce complexe et sépare les deux brins d'adn en cassant les liaisons hydrogènes. Une fois la double hélice ouverte par l hélicase, des protéines de de liaison à l'adn à l'adn simple brin brin (SSB) maintiennent l'hélice déroulée à l état simple brin, en empêchant l appariement des bases complémentaires.

10 I-1 Initiation de la réplication :

11 I-2 élongation des nouvelles chaînes d ADN La réplication commence au milieu de l œil de réplication,qui est divisé en deux fourches de réplications.

12 Pour que la synthèse de la nouvelle chaîne puisse commencer, il faut une amorce ( (qui est une courte séquence d ARN qui se termine par un OH libre, car l'adn polymérase III ne peut pas commencer une réplication "dans le vide" c'est-à-dire sans extrémité OH sur le brin à allonger. 1-La réplication commence donc par l action d une ARN polymérase appelée Primase qui synthétise l amorce. (Fig.6)

13 2- l ADN polymérase III prolonge l amorce par de l ADN grâce à son activité polymérasique 5-3 Sur le brin matrice qui commence par 3 et se termine par 5 le brin nouvellement synthétisé est un brin continu ou précoce, orienté dans le sens 5-3.

14 Sur le brin matrice qui commence par 5 et se termine par 3 le brin nouvellement synthétisé ne peut pas démarrer à partir de l extrémité 3 car il n existe pas d activité polymérasique 3-5, le point de départ de la réplication doit être décalé de façon à trouver une extrémité 3 sur la matrice pour faire une réplication dans le sens 5-3 du nouveau brin, ce décalage est réalisé par la formation d une boucle au niveau du brin orienté dans le sens contraire du déplacement de l ADN polymérase III. (Fig. 7) Au niveau de chaque boucle est synthétisé un fragment d ADN de 100 nucléotides appelé fragment d Okazaki. Les fragments d Okazaki forment le brin tardif ou discontinu (succession de courtes séquences d ADN séparées par des amorces (ARN). 3- L ADN polymérase I remplace les amorces par de l ADN grâce à ses activités exonucléasique 5-3 et polymérasique La ligase lie les fragments d Okazaki grâce aux liaisons phosphodiester.

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16 II -Réplication chez les eucaryotes : : chez l homme il existe environ une origine de réplication tout les 150 nucléotides. La vitesse de réplication est de 50 nucléotides/seconde pour chaque brin et il faut 6 à 7 heures pour répliquer les nucléotides pendant la phase S. Les contraintes topologiques sont les mêmes que pour les procaryotes lors de l initiation où il y a intervention de topoïsomérases qui éliminent ces contraintes grâce à l activité endonucléasique qui provoque une coupure d une liaison phospho-diester et rotation des deux extrémités libres. Les brins séparés sont ensuite stabilisés par des protéines RP-A (réplication protéine A) qui forment un manchon autour des monobrins.

17 II -Réplication chez les eucaryotes : : Il existe chez les eucaryotes 5 ADN polymérases : 1. Alpha : elle a une activité polymérasique 5-3 et une activité Primase. Elle intervient en premier lors de la réplication pour synthétiser une amorce(arn) qu elle prolonge grâce à son activité ADN polymérasique par 30 desoxyribonucléotides. 2. Delta : elle a une activité polymérasique 5-3 et une activité exonucléasique 3-5, elle a une forte processivité (nombre de nucléotides polymérisés par moment de fixation).cette processivité est augmentée par un cofacteur appelé PCNA ou Proliferation cell nuclear antigen. Le complexe Delta/PCNA synthétise la majeure partie de l ADN. 3. Bêta : elle comble les vides causés après l élimination des amorces par la RNAse H. 4. Gamma : elle intervient dans la réplication de l ADN mitochondrial. 5. Epsilon : son rôle n est pas bien défini.

18 Réplication des télomères Dans la plupart des cellules somatiques différenciées les télomères, (séquence répétée GGTTAG GGTTAG associée à une protéine) situés aux extrémités des chromosomes se raccourcissent à chaque réplication d environ 100 nucléotides. Ce raccourcissement est dû à l incapacité de l ADN polymérase de remplacer l amorce éliminée par la RNAse H. il subsiste un monobrin à l extrémité 3 qui est alors dégradé. Les télomères passent de nucléotides chez un nouveau né à 4000 nucléotides chez une personne de 80 ans. Le raccourcissement conduit la cellule vers la sénescence. Au bout d une certaine limite, la cellule cesse de se diviser, elle est orientée vers l Apoptose et meure. Dans les cellules embryonnaires, les cellules souches, les cellules germinales et cancéreuses, les télomères sont rallongés grâce à une enzyme de type transcriptase réverse. Cette enzyme TERT (télomérase retrotranscriptase) n a pas besoin d une matrice de l ADN chromosomique, car elle possède elle-même une matrice ARN appelée TERC (télomérase RNA component) (fig.8)

19 Réplication des télomères

20 La replication d ADN chez les procaryotes

21 La replication d ADN chez les procaryotes

22 La replication d ADN chez les procaryotes

23 Mutations et Mutagénèse-I-Définition Le terme mutation désigne une modification irréversible de l information génétique et héréditaire dans la séquence d un génome, donc des altérations des séquences habituelles de l ADN d un organisme. Elles sont soit naturelle suite à des erreurs dans la réplication (mutations naturelles). soit induites par des agents mutagènes physiques, chimiques (mutations induites).

24 Mutations et Mutagénèse-I-Définition Une très grande partie des erreurs commises au cours de la réplication du génome sont corrigées immédiatement par des mécanismes complexes et efficaces de réparation de l ADN. Les mutations qui touchent les cellules germinales sont transmises à la descendance. Les conséquences sont variables selon que le produit du gène est affecté ou non. Les mutations survenant sur les séquences non codantes n ont en générale aucune répercussion sur l organisme. Celles qui touchent les séquences codantes sont à l origine de maladies génétiques héréditaires et du cancer.

25 II-Types de mutations II-1) les mutations ponctuelles II-1- A : Effet sur l ADN : 1. Délétion 2. Addition 3. Substitution Transition Transversion II- 1-B : Effet sur la protéine 1- Mutation faux sens 2- Mutation non sens 3- Mutation Frame shift 4- Mutation silencieuse 5- Mutation conservatrice

26 II-1) les mutations ponctuelles II-1- A : Effet sur l ADN 1. Délétion : perte d une paire de base. Exp : TTAGGCAAGACT (12)=> TTAGCAAGACT(11) 2. Addition : ajout d une paire de base. EXp : TTAGGCAAGACT=>TTAGGACAAGACT 3. Substitution : échange de paire de base. Transition : substitution par base analogue : purine / purine (A/G)ou pyrimidine/ pyrimidine(t/c). Transversion : remplacement d une purine par pyrimidine. A/T ; T/A ; C/A ; A/C ; G/T ; T/G ; G/C ; C/G.

27 II-1) les mutations ponctuelles II- 1-B :Effet sur la protéine La mutation ponctuelle entraine le changement du codon cependant en raison de la dégénérescence du code génétique il n y aura aucune conséquence sur l AA. Ces mutations n ont pas d effet sur la protéine, et ne donne pas de phénotype mutant, elle se traduise par un polymorphisme de l ADN

28 II-1) les mutations ponctuelles II- 1-B :Effet sur la protéine 1. Mutation faux sens : peut être conservatrice ou non : c est le changement de la base donnant un acide aminé différent, elles concernant la 1 ère et la 2eme base, son effet est variable, exp : UCC(Arg) UGC (Cys) si elle touche une protéine mutée entrant dans une chaine métabolique de fonction, elle s exprime par une pathologie. Si elle touche une protéine de structure, elle s exprime par une pathologie ou un polymorphisme génétique. 2. Mutation non sens : le codon touché par la mutation et changé en codon stop, elle aboutit à l arrête prématuré de la traduction donc à la synthèse d une protéine plus courte tronqué, non fonctionnelle, elle conduit toujours à l interruption des processus métabolique ou structurel et produit une pathologie.

29 II-1) les mutations ponctuelles II- 1-B :Effet sur la protéine 3. Mutation Frame shift : décalage du cadre de lecture, c est une insertion de base surnuméraire (addition) ou la délétion d une base, le déphasage altère toute les séquences d A.A en aval et aboutit à une pathologie. 4. Mutation silencieuse : mutation est due à un changement du troisième nucléotide, substitution d une seule base qui ne change pas la nature de l acide aminé (remplacement d un codon par un codon synonyme, les deux codent pour le même A. Aminé). Ce changement n a pas d effet sur la protéine. Les mutations silencieuses contribuent à enrichir le polymorphisme de l ADN. 5. Mutation conservatrice : le codon spécifie un acide aminé différent mais similaire chimiquement. Exp : AAA(Lys) > AGA(Arg) Basique Basique

30 II-Types de mutations - II-2) Mutations modulant l expression du gène Ces mutations touchent les régions Régulatrices du gène (promoteur). Le codon d initiation, le site de polyadénylation ou bien les gènes codant pour les facteurs de transcription. Le gène peut devenir incapable de synthétiser la protéine ou la synthèse devient insuffisante.

31 II-Types de mutations II-3) Les mutations de grande ampleur ou macro lésions de l ADN Les mutations de grande ampleur touchent de longs segments d ADN (mutations chromosomiques), leurs conséquences sont généralement importantes. (Chapitre : cytogénétique) A. Les délétions B. Les insertions : Les nucléotides insérés viennent en général d un autre chromosome. Leur étendu est variable. A. Les duplications :Un segment d ADN de longueur variable est représenté deux fois dans le chromosome. D. Les amplifications : Des séquences plus au moins longues, qui se répètent en plusieurs exemplaires sur le chromosome. Ces séquences s attachent l une à l autre en tandem dont l étendue est variable. Exp : Syndrome de X fragile (Retard mental lié à X), le triplet de bases impliqué : CGG (10-50).Sujet Sain, CGG(52-500) Sujet malade------donc mutation par amplification de triplet de bases.

32 II-Types de mutations II-4) Les mutations dynamiques instables C est une expansion de répétition de codon. Elle engendre l allongement de la séquence d ADN par augmentation du nombre de codon répété de génération an génération, on l appel instable à cause de l instabilité méiotique et/ ou mitotique de triplet répétés associé a des séquences pathologiques ( ne pas confondre avec les microsatellites : qui sont stables et extra génique) Ce type de mutation s observe dans une douzaine de maladies humaines ( syndrome du X fragile : CGGn fois).

33 II-Types de mutations II-5) Les mutations de l ADN mitochondrial l hérédité mitochondriale est complexe et n obéit pas aux lois de Mendel. Comme exemple maladie respiratoire,causée par diverses mutations des gènes de la chaine respiratoire présents sur l ADN mit. Pour un caractère répondant à une hérédité mitochondriale. Il faut retenir : Transmission maternelle. Transmis uniquement par les femmes aux garçons et aux filles. L homme ne transmis pas. Remarque : code génétique de l ADN mit. En plus des exceptions citées déjà ; UGA n est pas un codon stop mais code le tryptophane chez l espèce humaine.

34 Les mutagènes Chimiques et physiques I-Les agents mutagènes chimiques Des analogues de bases comme le 5-Bromouracile et le 2- Aminopurine sont incorporés dans l ADN durant la réplication normale, subissent des modifications tautomériques similaires aux bases normales mais à des fréquences plus élevées ce qui aboutit à une mutation. Des agents intercalant sont des composés plats, à trois anneaux similaires en structure à une paire de bases. Ils peuvent s intercaler dans l ADN, provoquant une distorsion de l hélice et donc un glissement durant la réplication et insertion et la délétion de bases. Des exemples : Le bromure d éthidium et l orange acridine. Des agents alkylants sont des composés qui modifient la structure d une base et donc ses propriétés d appariement lors de la réplication suivante. Par exp l hypoxanthine qui transforme la cytosine en hydroxylaminocytosine qui s apparie avec l adénine. Provoquant la transition de G-C en A-T.

35 Les mutagènes Chimiques et physiques II-Les mutagènes physiques 1-Les radiation ionisantes :X et Gamma Elles sont hautement énergétiques, elles provoquent des coupures des brins d ADN et la destruction de sucres et de bases. 2. Les radiations non-ionisantes : UV Elles sont absorbées par les bases et peuvent induire des changements structuraux (des lésions d ADN). Utilisées au niveau des laboratoires pour induire des mutation, La lésion principale provoquée par la lumière UV est la formation de dimère de pyrimidine. Les plus fréquents étant les dimères de thymine. Entre des bases adjacentes ; ceci provoque une distorsion de l hélice de l ADN. Ces mutations surviennent lorsque la cellule essaie de réparer la lésion en utilisant le système de réparation SOS.

36 La mutagénèse in vitro est fréquemment utilisée pour modifier des séquences précises de L ADN, lorsque la séquence d ADN est connue. Une copie de la séquence mutée est synthétisée chimiquement et utilisée pour remplacer le type sauvage dans le génome.

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