Transgenèse animale. Intérêts du modèle murin. I- Transgenèse additionnelle - les souris transgéniques - les autres espèces animales transgéniques

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1 Préparation à l agrégation interne Cours de génétique moléculaire: Christine Laclef christine.laclef@snv.jussieu.fr Transgenèse animale I- Transgenèse additionnelle - les souris transgéniques - les autres espèces animales transgéniques II- Remaniements ciblés du génome - les souris KO - les KO conditionnels III- Dans quels buts génère-t-on des animaux transgéniques? - Recherche fondamentale - Applications médicales - Applications agronomiques 1 3 Rappel: Développement précoce des mammifères Intérêts du modèle murin ségrégation / cavitation Fécondation éclosion implantation période de clivage! Mammifère de petite taille! Femelle féconde: 1 portée toutes les 8 semaines pendant 1 an et demi compaction! Développement rapide: 20 jours (fécondation -> expulsion)! Maturité sexuelle précoce: 6 semaines Implantation! Supporte la captivité, conditions d élevage économiques (E4,5)! Génomes séquencés! Transgenèse additionnelle possible! Modification ciblée du génome possible " Développement interne 2 4

2 Manipulations génétiques réalisables chez l embryon précoce de mammifère # chez la souris : microinjection ovocyte non fécondé $ Micro-injection d ADN dans le zygote Clonage injection d un noyau somatique Micro-injection d ADN Transgenèse additionnelle Insertion aléatoire d un transgène dans le génome de la souris Greffe de cellules ES recombinantes Invalidation fonctionnelle d un gène par recombinaison homologue Délétion ciblée d une séquence génomique -> souris transgéniques -> souris KO (3 mois) (2 ans) 5 # chez la souris : microinjection pronucléus femelle pipette de contention pronucléus mâle 7 # chez la souris $ Réimplantation dans une femelle pseudo-gestante solution d ADN $ Etablissement de plusieurs lignées de souris transgéniques pipette de microinjection cassure dans l ADN chromosomique ADN cloné intégration transfert dans l oviducte de femelles pseudogestantes 6 souriceau transgénique (transgène présent dans toutes les cellules) 8

3 ! Historique du clonage: % 1997: Wilmut et al > clonage de la brebis Dolly (5 juillet février 2003) # Chez d autres espèces animales : transfert nucléaire de noyaux génétiquement modifiés! Transfert nucléaire: injection du noyau d une cellule différenciée dans un ovocyte énucléé 9! Historique du clonage: 11 % 1952, Briggs & King -----> noyaux de cellules embryonnaires (blastula) # Chez la vache : transfert nucléaire de noyaux génétiquement modifiés % 1975, Gurdon -----> noyaux de cellules différenciées (peau, intestin) = première expérience de clonage d un vertébré cellules transformables: 1- éléctroporation: entrée du transgène dans la cellule 2- sélection des clones transformés en culture «!électrofusion!» 10 12

4 # Chez d autres espèces animales : transfert nucléaire de noyaux génétiquement modifiés # Générer une lignée de souris Knock-Out 1- Culture de cellules souches embryonnaires 2- Construction du vecteur d invalidation: différentes stratégies 3- Transfection des cellules ES par électroporation 4- Sélection des cellules ES 5- Injection des cellules ES dans un blastocyste 6- Genèse de souris KO à partir de cellules ES recombinées A ce jour, technique mise au point chez: - la vache - le rat - le cochon - le lapin - le mouton -la chèvre par recombinaison homologue Prix Nobel de Médecine 2007 attribué à: recombinaison homologue: Au niveau de séquences d ADN homologues, coupure double brin des deux molécules d ADN dont les extrémités se ressoudent avec les brins opposés. $ Recombinaison générale: n importe quelle séquence homologue de nucléotides peut être recombinée $ Recombinaison site-spécifique: Seule une séquence particulière est reconnue et recombinée Ex: Sites LoxP (90 nucléotides) reconnus par la recombinase Cre (du phage lambda) 14 Mario R. Capecchi (USA) Sir Martin J. Evans (UK) Oliver Smithies (USA) "for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells" 16

5 Ex: Inactivation du gène BMP-7 par recombinaison homologue Wild-type BMP7-/- Wild-type BMP7-/- (Dudley et al., 1995) # Agénésie oculaire # Hypoplasie reinale # Le gène BMP7 est nécessaire à l organogenèse de l œil et du rein # Injection des cellules ES dans un blastocyste 18 20

6 # Construction du vecteur d invalidation: différentes stratégies $ Knock-Out simple (KO): invalider un gène # Le KO conditionnel: invalider un gène dans un tissu particulier, à un moment donné promoteur du gène exon 1 exon 2 exon 3 promoteur du gène exon 1 exon 2 exon 3 LoxP LoxP KO: Délétion de tout ou partie d un gène Recombinaison par la recombinase Cre Expression de la Cre ciblée dans le temps et dans l espace grâce à des séquences régulatrices spécifiques 21 5 Cre 3 séquence régulatrice ciblant l expression du gène Cre dans un tissus donné à un stade donné 23 # Construction du vecteur d invalidation: différentes stratégies # Croisements nécessaires pour générer un KO conditionnel $ Knock-In (KI): remplacer un gène par un autre promoteur du gène exon 1 exon 2 exon 3 KI: remplacement de tout ou partie d un gène par une autre séquence 22 24

7 III. Pourquoi générer des animaux transgéniques? # Applications médicales % Production de molécules thérapeutiques 1- Recherche fondamentale 1.1. Étude de la fonction d un gène > Gain de fonction: transgenèse additionnelle le gène est-il suffisant pour assurer une fonction donnée? > Perte de fonction: délétion ciblée d un gène le gène est-il nécessaire pour assurer une fonction donnée? - par des organismes procaryotes (E. coli) - par des organismes eucaryotes (levure, plantes) - Projets: par des animaux transgéniques 1.2. Étude des régions régulatrices des gènes $ Production de protéines humaines par Escherichia coli: 2- Applications médicales 2.1. Productions de molécules thérapeutiques 2.2. Médecine préventive 2.3. Mise au point des outils de thérapie génique et thérapie cellulaire Possible: grâce à l universalité du code génétique Problème: organisme procaryote donc pas de maturation posttraductionnelle possible Exemples: - Insuline (-> traitement du diabète) - hormone de croissance (-> traitement du nanisme) 3- Applications agroalimentaires - facteurs VIII et IX de coagulation sanguine (-> traitement d hémophilies) 5- Faut-il avoir peur des OGM? - interférons antiviraux (-> traitement de maladies infectieuses) 25 # Recherche fondamentale 27 # Applications médicales % Projets de productions de molécules thérapeutiques % Étude des régions régulatrices des gènes région régulatrice d intérêt gène rapporteur LacZ E11.5 Lac Z MEF3 TATA mutation du site MEF3 Lac Z MEF3 TATA promoteur minimum de myogénine (-184 pb) 26 28

8 # Applications médicales # Applications médicales % Projets de productions de molécules thérapeutiques % Médecine préventive $ Diagnostique et dépistage génétique - Questions d actualité - Enjeux éthiques et juridiques # Prévenir le vieillissement en empêchant le dérèglement des fonctions vitales # Chacun peut connaître son génome: 23andMe (999$), decode Genetics (985$), Navigenics (2500$) # Chirurgie, greffes, implants, régénération cellulaire et tissulaire # Applications agroalimentaires % Stratégie de production de nouveaux vaccins - développement de nouvelles stratégies de vaccination $ Amélioration de la productivité - augmentation des rendements laitiers - augmentation de la masse musculaire - accélération de la croissance --- Dolly (1996) $ Amélioration de la qualité sanitaire du bétail: - résistance aux maladies infectieuses à quand? --- # Faut-il avoir peur des OGM? $ Risques pour l homme? $ Risques pour l environnement? 30 32