ETUDE DE LA REGULATION GENIQUE POST- TRANSCRIPTIONNELLE IMPLIQUANT DCRl CHEZ SCHIZOSA CCHAROMYCES POMBE

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1 LISE-ANDRÉE GOBEIL ETUDE DE LA REGULATION GENIQUE POST- TRANSCRIPTIONNELLE IMPLIQUANT DCRl CHEZ SCHIZOSA CCHAROMYCES POMBE Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'université Laval dans le cadre du programme de maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire pour l'obtention du grade de maître es sciences (M.Se.) FACULTE DE MEDECINE UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC 2007 Lise-Andrée Gobeil, 2007

2 Il Résumé Une étude précédente visant à mieux comprendre le rôle et le contexte cellulaire dans lequel la ribonucléase Dicer (Dcrl) évolue nous a permis d'identifier des protéines pouvant être régulées par un mécanisme post-transcriptionnel impliquant Dcrl et la voie de l'interférence à l'arn (iarn) chez Schizosaccharomyces pombe. Parmi ces protéines se trouvaient trois enzymes impliquées dans la voie de la glycolyse. Nous avons tenté de caractériser le mécanisme et l'implication fonctionnelle de leur régulation en effectuant des expériences de FACS combinées à l'utilisation d'un système de gène rapporteur basé sur la «Green fluorescent protein» et en effectuant des tests de croissance, respectivement. La régulation de la voie de la glycolyse ne semble pas nécessaire à la croissance des levures, ce qui suggère la présence de mécanismes compensatoires. L'étude précédente nous avait également permis d'identifier la protéine ribosomalc L12 comme interacteur potentiel de Dcrl pouvant être impliqué dans sa régulation. Nous avons tenté de comprendre le rôle de L12 dans cette régulation en confirmant son interaction avec Dcrl et en caractérisant l'aspect fonctionnel de cette interaction en produisant des lignées délétionnclles de L12. La localisation intracellulaire de la protéine L12 nous permet de croire qu'elle pourrait amener Dcrl dans des structures spécifiques du cytosol, où elle pourrait jouer un rôle dans la régulation génique post-transcriptionnelle. Ce rôle demande toutefois à être confirmé.

3 iii Avant-Propos Je voudrais tout d'abord remercier mon directeur de recherche, le Dr Patrick Provost, qui m'a non seulement accueillie dans son laboratoire dans le cadre de ma Maîtrise, mais m'a également permis de faire mon entrée en recherche. Merci pour son encadrement et ses conseils, et pour son appui durant ces deux années qui ont passé si vite. Je tiens également à remercier les membres du laboratoire qui m'ont appuyée et également donné de bons conseils, autant personnels que professionnels. Merci à Isabelle pour son grand sens de l'organisation qui fait qu'on s'y retrouve si facilement dans le laboratoire, à Geneviève, Dominique, Marjoric, Patricia et à Mina, pour leur support. Merci également à Oscar et Annie, avec qui j'ai passé de bons moments et qui m'ont permis de garder ma motivation dans des moments difficiles. Un grand merci, également, à Pierre Plante et à Vincent Boissonneault, qui ne travaillent plus au laboratoire aujourd'hui, mais que je n'ai pas oublié. J'ai eu la chance d'avoir Pierre comme mentor au tout début de ma Maîtrise, puisque j'ai assuré la continuité de ses projets. C'est lui qui m'a appris toutes les techniques en rapport avec les levures et il m'a grandement conseillée. Pierre reste également pour moi un bon ami. Vincent, quant à lui, m'a été d'un grand secours dans bien des situations, autant personnelles que professionnelles. Nos nombreuses discussions dans la bien-aiméc salle de levure ont aidé à régler bien des problèmes. Merci pour ton amitié, Vincent. Je me dois de remercier les personnes qui ont fourni du matériel de recherche (anticorps), soit les Drs Keith Gull et Louis Flamand. Un merci spécial également à M. Maurice Dufour pour les analyses de FACS et au Dr Marc Pouliot pour l'accès à son microscope. Finalement, je voudrais remercier ma famille et Jimmy, qui m'ont beaucoup soutenue vers la fin, mais aussi tout au long de ma Maîtrise, et qui ont cru en moi.

4 iv Table des matières Résumé ii Avant-Propos iii Table des matières iv Liste des tableaux vii Liste des figures viii Liste des abréviations ix CHAPITRE 1 Introduction Le phénomène de l'iarn Historique Mécanisme Les petits ARN régulateurs Les rôles de l'iarn La levure Schizosaccharomyces pombe L'organisme La voie de l'iarn chez S. pombe Le mécanisme de répression transcriptionnelle des gènes Les protéines majeures de la voie de l'iarn La protéine Dcrl La protéine Agol La protéine Rdpl Résultats antérieurs Identification de protéines pouvant être régulées par Dcrl Identification de protéines pouvant interagir avec Dcrl Objectifs du projet 20 CHAPITRE 2 Matériel et méthodes Expériences chez la levure à fission Souches de levure et conditions de croissance Préparation des vecteurs d'expression Extraction de l'arn Transcription inverse de l'arn en ADNc Amplification des gènes à cloner par PCR Elcctrophorèse et purification de l'adn sur gel d'agarose Digestion de l'adn Ligation de l'adn Préparation de DH5a compétentes Transformation et sélection des bactéries Extraction de l'adn plasmidique Analyses de restriction et de séquençage Expériences de «Fluorescence activated cell sorter» (FACS) Stratégie Transformation et sélection des transformants Croissance des levures et préparation des échantillons Analyse Tests de croissance Expériences d'immunoprécipitation (IP) Transformation et sélection des transformants Préparation des extraits protéiques 31

5 IP de Myc-Ll Analyse par immunobuvardage Expériences de double-hybride chez la levure S. cerevisiae Stratégie Transformation et sélection des transformants Analyse des interactions protéiques Création des lignées stables UL109 à UL Stratégie de la recombinaison homologue Préparation de l'adn pour la recombinaison homologue Transformation et sélection des transformants Analyse par PCR sur colonie Essai glusulasc Analyse des lignées par immunobuvardage Croisement des lignées Expériences d'immunofluorescence Expériences chez les cellules humaines Cellules humaines et conditions de croissance Préparation des vecteurs d'expression Expériences d'ip Transfections Préparation des extraits protéiques Immunoprécipitation deflag-l12 et de Flag-Diccr C-terminal Analyse par immunobuvardage Expérience de double-hybride chez la levure S. cerevisiae 44 CHAPITRE 3 Résultats Étude de la voie de la glycolyse Expériences de FACS Tests de croissance Étude de la protéine ribosomale L Confirmation de l'interaction Co-IPentreMyc-L12etHA-Dcrl Expérience de double-hybride chez la levure Génération des lignées Génération des lignées déficientes en L12-1 ou L Expression persistante de la protéine L Incapacité à générer une lignée où les deux copies du gène ont été éliminées Génération des lignées L12-Myc Détection de la protéine de fusion L12-Myc dans des lignées modifiées par recombinaison homologue Génération des lignées L12-GFP Détection de la protéine de fusion L12-GFP dans des lignées modifiées par recombinaison homologue Localisation cytoplasmiquc de la protéine L12 chez S. pombe Étude de l'interaction possible entre la forme humaine des protéines L12 et Dicer IPdeFlag-L Expérience de double-hybride chez la levure S. cerevisiae IP de Flag-Dicer C-terminal 62 CHAPITRE 4 Discussion et perspectives 64 V

6 4.1 Étude de la voie de la glycolyse Étude de l'interaction entre Dcrl et L12 68 CHAPITRE 5 Conclusion 72 Références 74 Annexe 85 vi

7 vu Liste des tableaux Tableau 1. Génotype des lignées de S. pombe utilisées et créées lors de cette étude 22 Tableau 2. Liste des amorces utilisées pour la préparation des vecteurs d'expression pour les expériences chez la levure à fission 26 Tableau 3. Liste des amorces utilisées pour la préparation des produits PCR pour la recombinaison homologue 38 Tableau 4. Liste des amorces utilisées pour les PCR sur colonie 40 Tableau 5. Liste des amorces utilisées pour la préparation des vecteurs d'expression pour les expériences réalisées chez les cellules de mammifères 42 Tableau 6. Résultats des expériences de double-hybride chez la levure avec les protéines de S. pombe 52 Tableau 7. Résultats des expériences réalisées dans le système de double-hybride chez la levure avec les protéines humaines 62

8 Vlll Liste des figures Figure 1. Régulation des ARN messagers (ARNm) médiéc par les microarn (miarn) et les petits ARN interférents (siarn) 7 Figure 2. Modèle de la formation de l'hétérochromatine médiée par l'iarn (Elgin and Grewal, 2003) 14 Figure 3. Schéma de la glycolysc 18 Figure 4. Stratégie de la recombinaison homologue 36 Figure 5. Analyse comparative de l'expression de la EGFP dans la souche dcrl A et la souche sauvage transformées avec les vecteurs d'expression spécifiés 47 Figure 6. Analyse comparative de la croissance des souches dcrl A et sauvage selon la concentration de glucose 49 Figure 7. Confirmation de l'interaction entre Dcrl et la protéine ribosomale L12 par co-ip.50 Figure 8. Analyse de la lignée Ll2-2A::kanMX6 (UU09) 53 Figure 9. Analyse de la lignée L12-lA::kanMX6 (UL108) 55 Figure 10. Analyse de la lignée L12-l-13Myc::kanMX6 (UL111) 57 Figure 11. Analyse de la lignée L12-2-GFP(S65T)::kanMX6 (UL112) 59 Figure 12. Observation de la protéine L12-2-GFP(S65T) par microseopie à fluorescence Figure 13. Analyse par immunobuvardage des immunoprécipitats de Flag-L12 humaine Figure 14. Analyse par immunobuvardage des immunoprécipitats de Flag-Diccr C-tcrminal.

9 Liste des abréviations A. thaliana : Arabidopsis thaliana ADAR : «Adenosine deaminase acting on RNA» ou adénosine déaminase agissant l'arn ADN : Acide désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire ADP : Adénosine diphosphate Ago : Argonaute Arb : «Argonaute binding protein» ou protéines liant Argonaute ARC : Argonaute-siARN-chaperone ARN : Acide ribonucléique ARNdb : ARN double-brin ARNm : ARN messager ATP : Adénosine triphosphatc BSA : «Bovine sérum albumin» ou albumine sérique bovine C. elegans : Caenorhabditis elegans Co-IP : Co-immunoprécipitation CRCHUL : Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'université Laval DA : Domaine d'activation DL : Domaine de liaison D. melanogaster : Drosophila melanogaster D.O. : Densité optique DTT : 1,4-Dithiothréitol EDTA : «Ethylene diamine tetraacetic acid» EGFP : «Enhanced green fluorescent protein» ou protéine fluorescente verte plus performante EMMG : «Edinburgh minimal médium glutamate» E. coli : Escherichia coli FACS : «Fluorescence activatcd cell sorter» FBS : «Fetal bovine sérum» ou sérum foetal de bovin FMRP : «Fragile-X mental retardation protein» GFP : «Green fluorescent protein» ou protéine fluorescente verte GTP : Guanosine triphosphate GW-bodies : «GW182-containing bodies» h : Heure HA : Hémaglutinine HK2 : Hexokinase 2 HP1 : «Heterochromatin protein 1» Hsp : «Heat shock protein» ou protéine du choc thermique iarn : Interférence à l'arn IB : Immunobuvardage IP : Immunoprécipitation IPG : «Immobilized ph gradient» kda : KiloDalton LB : Luria-Bertani LC-MS-MS : «Liquid chromatography-mass spectrometry-mass spectrometry» ou chromatographie liquide-chromatographie liquide-spectrométrie de masse

10 LiAc : Acétate de lithium M : Molaire M. musuculus : Mus musculus ma : Milliampère ME : «Malt extract» ou extrait de malt mg : Milligramme mi ARN : micro ARN min : Minute mirnp : «mirna-containing ribonuclcoprotein» ou ribonucléoprotéine contenant des miarn ml : Millilitre mm : Millimolaire N. Crassa : Neurospora crassa nm : Nanomètre nt : Nucléotide NTR : «Non-translated région» ou région non-traduite pb : Paire de bases P-bodics : «Proccssing-bodies» PBS : «Phosphate buffered saline» PCR : «Polymcrase chain réaction» ou réaction de polymérisation en chaîne PEG : Polyéthylènc glycol PGK : Phosphoglycératc kinasc pmol : Picomole PMSF : «Phenylmethyl sulfonyl fluoride» PollI : ARN polymérase II PPD : «PAZ/PIWI domain» Pré-miARN : Précurseur de microarn Pri-miARN : microarn primaire PTGS : «Post-translational gcnc silcncing» ou répression génique post-transcriptionnclle PVDF : «Polyvinilidène fluoride» RDRC : «RNA-directed RNA polymérase complex» RdRP : «RNA-dependant RNA polymcrase» ou ARN polymérasc dépendante de l'arn RIIID : Domaine RNase III RISC : «RNA-induced silcncing complex» RITS : «RNA-induced initiation of transcriptional gène silcncing» RNase : Ribonucléase RPM : Rotation par minute RT-PCR : «Reverse transcriptase - PCR» S. cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae S. pombe : Schizosaccharomyces pombe SD : «Sélective dropout» SD/-Leu/-Trp : SD déficient en leucinc et tryptophanc SD/-Lcu/-Trp/-Ade : SD déficient en leucinc, tryptophane et adénine SD/-Leu/-Trp + X-Gal : SD déficient en leucine et tryptophane avec X-Gal SD/-Leu/-Trp + 3-AT : SD déficient en leucinc et tryptophanc avec 3-AT SDS : Sodium dodécyl sulfate s : Seconde siarn : «small interfering RNA» ou petit ARN interfèrent SLN : Signal de localisation nucléaire TAE : Tris-acide acétiquc-edta X

11 TBS : «Tris buffered saline» TRBP : «Transactivating rcsponsc RNA-binding protein» T. thermophila : Tetrahymena thermophila Tudor-SN : «Tudor staphylococcal nuclease» TY : «Tryptonc-ycast extract» V : Volts ug : Microgramme (0,1 : Microlitre u.m : Micromètre X-Gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-D-galactopyranosidc YES : «Supplemented yeast extract mcdium» YPAD : «Yeast cxtract-peptone-dcxtrosc mcdium + adcninc» 3-AT : 3-aminol,2,4-triazol xi

12 CHAPITRE 1 Introduction

13 2 1.1 Le phénomène de l'iarn L'iARN est le processus par lequel des molécules d'arn double-brin (ARNdb) entraînent la dégradation séquence spécifique d'arn messager (ARNm) et inhibent l'expression d'un gène ou d'une famille de gènes cibles. L'iARN a été observée chez les plantes, les champignons filamenteux, le ver nématode, la mouche drosophile et les mammifères. Depuis, nos connaissances de ce phénomène nous ont permis d'entrevoir son utilisation comme outil thérapeutique et diagnostique, ce qui en a fait un centre d'intérêt sans cesse croissant. En 2006, le prix Nobel de physiologie/médecine a d'ailleurs été décerné à deux chercheurs oeuvrant dans ce domaine et auxquels nous devons la première description du phénomène : Andrew Fire et Craig Mcllo Historique Le phénomène fut d'abord observé en 1990 par un groupe de biologistes qui tenta de créer des pétunias transgéniques afin d'accentuer la couleur violette de leur pétales. Ils furent surpris lorsque, en surexprimant l'enzyme chalcone synthase, les pétales des fleurs, au lieu de développer une couleur plus intense, devinrent blanches. Ce phénomène était associé à un blocage de la synthèse du pigment et à une diminution d'environ 50 % du niveau de l'arnm du transgène. Impliquant l'élimination simultanée de l'action du gène et du transgène, ils nommèrent ce phénomène co-suppression (Napoli et al., 1990). Ce phénomène fut par la suite associé à la dégradation des ARN viraux observée chez les plantes (Dougherty et al., 1994; Ruiz et al., 1998), puisque, dans les deux cas, il y avait production d'arndb, un inducteur potentiel de la répression génique (Fire et al., 1998). En 1995, Guo et Kemphues rapportèrent que l'injection d'arn sens ou antisens chez le nématode pouvait interférer avec l'expression génique (Guo and Kemphues, 1995). Trois ans plus tard, Fire et ses collègues démontrèrent que l'utilisation d'arndb était beaucoup plus efficace pour induire l'iarn, ne nécessitait que l'injection d'une petite quantité de molécules et que les effets étaient transmissibles sur plusieurs générations. Ils émirent l'hypothèse qu'il existait une composante permettant la catalyse ou l'amplification du phénomène (Fire et al., 1998).

14 3 Dès 1999, Hamilton et Baulcombe identifièrent des petits ARN antisens viraux impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle («posttranscriptional gène silencing», PTGS) chez les plantes et suggérèrent que ceux-ci pouvaient être déterminants dans la spécificité du phénomène (Hamilton and Baulcombe, 1999). Par la suite, plusieurs études ont permis de révéler l'implication de petits ARNdb de nucléotides (nt) dans la dégradation d'arnm (Elbashir et al., 2001b; Zamore et al., 2000). Ceci amena les groupes de recherche à identifier la source endogène de ces petits ARN et des composantes impliquées dans leur biogénèse et action. En 2001, les microarn (miarn) étaient définis comme formant une nouvelle classe d'arn endogènes (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee and Ambros, 2001) Mécanisme Les gènes des miarn sont codés par le génome et sont d'abord transcrits par l'arn polymérase II (polll), l'unité majeure de transcription des gènes de miarn, en miarn primaires (pri-miarn) (Lee et al., 2004). Cet ARN forme une structure en tige-boucle, ce qui produit un transcrit coiffé et polyadénylé (Cai et al., 2004). Le pri-miarn est ensuite clivé par la ribonucléase (RNase) III nucléaire Drosha à deux tours d'hélice de la base de la boucle et converti en précurseur de miarn (pré-miarn). Cette structure d'arn en tigeboucle d'environ 70 nt comporte une extrémité 5' phosphoryléc et une extrémité 3' hydroxylée avec 2 nt non-appariés (Lee et al., 2003). Bien que la distance à partir de la boucle soit l'élément majeur déterminant le site de clivage, la séquence environnante serait également importante pour la précision au nt près. En fait, Drosha agirait de concert avec la protéine DiGeorge syndrome critical région 8 (DGCR8), dont le rôle exact demeure obscur, à l'intérieur d'un complexe appelé microprocesseur (Gregory et al., 2004; Han et al., 2004; Zeng and Cullen, 2003). Des homologues de Drosha sont exprimés chez la plupart des eucaryotes supérieurs, mais ne sont pas retrouvés chez les eucaryotes inférieurs, tels que Schizosaccharomyces pombe (S. pombé) (Wood et al., 2002) et Arabidopsis thaliana {A. thaliana) (Wu et al., 2000). Cette observation implique des différences fondamentales dans l'initiation de la synthèse de petits ARN régulateurs, qui a probablement changé au cours de l'évolution. Le pré-miarn est ensuite exporté du noyau vers le cytoplasme par un mécanisme impliquant l'cxportine-5 et le ran-gtp, qui serait nécessaire pour la liaison du présurseur à

15 A son transporteur (Yi et al., 2003). La séquence du pré-miarn semble avoir peu d'importance pour la reconnaissance par le transporteur, qui semble plutôt reconnaître la stucture de l'arn : une boucle et une tige de plus de 16 nt (Zeng and Cullcn, 2004). Le pré-mirna serait, une fois dans le cytoplasme, clivé par une seconde RNase III, Dicer, pour générer un duplexe appelé miarn:miarn* de nt avec des extrémités 3' de 2 nt non-appariés. La protéine Dicer est composée d'un domaine ATPasc/hélicasc hypothétique contenant une boîte DECH en N-terminal, un domaine de fonction inconnue (DUF283), un domaine PIWI/Ago/Zwillc (PAZ) et un domaine RNase III (RIIID) en C-terminal, lui-même composé de deux motifs RNase III et d'un domaine de liaison à l'arndb (Provost et al., 2002a). Bien qu'on retrouve une séquence de localisation nucléaire chez certaines espèces (Schauer et al., 2002), Dicer est localisée surtout au cytoplasme (Billy et al., 2001) et au réticulum cndoplasmiquc (Provost et al., 2002a) dans les cellules en culture. Le clivage par Dicer se déroulerait selon un mécanisme semblable au clivage par Drosha, et serait dépendant de l'atp chez quelques espèces, mais pas chez l'humain (Zhang et al., 2002). Le domaine PAZ participerait à la reconnaissance des nt non-appariés de l'extrémité 3'. Il y aurait ensuite dimérisation intramoléculaire des deux motifs RNase III, assistée par le domaine de liaison à l'arndb et le domaine PAZ, puis, chaque domaine RNase III cliverait un brin du duplexe après 2 tours d'hélice a, du côté opposé au clivage par Drosha. Le nombre de nt non-appariés en 3' dépendrait de l'alignement du pré-miarn, alors que la longueur du miarn mature serait dictée par la distance entre le site de clivage et le domaine PAZ (Zhang et al., 2004). Il a récemment été montré que Dicer agirait de concert avec la protéine «transactivating response RNA-binding protein» (TRBP) dans un complexe permettant le clivage des pré-miarn (Chcndrimada et al., 2005; Haasc et al., 2005). TRBP faciliterait le clivage du pré-miarn in vitro et permettrait le recruitement d'argonaute 2 (Ago2) au miarn ou au petit ARN (siarn, «small interfering»), ce qui entraînerait la formation du complexe effecteur (Chcndrimada et al., 2005) : le complexe chargé d'un siarn est appelé «RNA-induccd silencing complex» (RISC), alors que le complexe contenant un miarn est défini comme un «mirna-containing ribonucleoprotein complex» (mirnp). Récemment, il a été démontré que Dicer faisait partie du complexe effecteur, pontant ainsi les étapes initiatrices et effectrices de la voie de l'iarn (Grcgory et al., 2005). Le complexe effecteur chargé d'amener le miarn ou siarn mature vers un ARNm spécifique, dont la séquence est complémentaire, médiera le clivage ou la répression

16 s traductionnelle de PARNm ciblé, selon que l'arnm et le petit ARN sont parfaitement complémentaires ou non, respectivement (Bartel, 2004). Le complexe RISC a été identifié pour la première fois dans des cellules S2 de Drosophile (Hammond et al., 2000). Il contient plusieurs protéines pouvant lier l'arn, dont la protéine Ago2 (Hammond et al., 2001), la nucléase staphylococcale Tudor (Tudor-SN) (Caudy et al., 2003), VIG (Caudy et al., 2002), et la protéine du X fragile FMRP («fragile X mental retardation protein») (Ishizuka et al., 2002). La protéine Ago2 est un membre de la famille de protéines «Paz and Piwi domain protein family» (PPD) et est formée de 4 domaines structuraux : un domaine N-tcrminal, un domaine PAZ, un domaine central et un domaine PIWI. Son interaction avec Dicer serait médiée par son domaine PIWI et impliquerait la région C-terminale de Dicer qui contient le domaine de liaison aux ARNdb et un des domaines RNase III (Tahbaz et al., 2004). Ago2 a été identifiée en tant que protéine responsable de l'activité «slicer» du RISC, c'est-à-dire de l'activité de clivage de l'arnm médiée par le RISC. Cette donnée nous vient de l'analyse de la structure en crystal du domaine PIWI de la protéine, qui montre une structure semblable aux RNase H et contient un motif très conservé Asp-Asp-His (DDH) requis pour le clivage (Song et al., 2004). Le domaine PIWI serait donc le domaine catalytique de Ago2. D'autres études structurales ont révélé que le domaine PIWI serait également responsable de la liaison à l'extrémité 5' de l'arn simple-brin (Parker et al., 2004). Le domaine PAZ, quant à lui, fournirait une structure en forme de sac permettant la liaison de l'extrémité 3' protubérante des siarn (Lingel et al., 2003). Il y a 8 protéines Ago exprimées chez l'humain (Sasaki et al., 2003) dont les isoformes 1 à 4 apparentés. Ces 4 isoformes peuvent lier les miarn et les siarn, mais seulement la protéine Ago2 est présente dans le RISC et peut cliver les ARNm (Meister et al., 2004). L'extrémité 5' des siarn et miarn semble importante pour le clivage par Ago2. Un groupement phosphate à l'extrémité 5' du brin guide est requis pour un processus iarn efficace (Nykanen et al., 2001), alors que le clivage, déterminé par la distance à partir de cette extrémité, se produit au lien phosphodiester situé entre les bases complémentaires aux bases 10 et 11 du brin guide (Martinez and Tuschl, 2004). Il a été observé que Ago2 pouvait également être requise pour le clivage du brin complémentaire au brin guide dans l'activation du RISC dans le cas des siarn. Ce clivage qui ne s'appliquerait pas aux miarn s'effectuerait de la même façon que le clivage de l'arnm (Rand et al., 2005).

17 6 La protéine Tudor-SN, quant à elle, a été mise en relation récemment avec l'édition de l'arn. Cette protéine interagirait et augmenterait le clivage de substrats hyper-édités d'arndb contenant des paires IU et UI (Scadden, 2005), une signature de l'édition par des protéines de la famille des «adenosinc deaminase acting on RNA» (ADARs) (Bass, 2002). L'édition de l'arn, en empêchant le clivage des pri- et pré-miarn par Drosha et Dicer, respectivement, pourrait être un mécanisme de contrôle naturel de la synthèse des mi ARN. Pour ce qui est de FMRP, une étude récente réalisée dans notre laboratoire l'implique dans l'assemblage des miarn à des ARNm cibles spécifiques à la séquence (Plante et al., 2006). Des études assez récentes ont révélé l'existence de foci cytoplasmiques spécifiques dans lesquels la répression de la traduction ainsi que la dégradation des ARNm par le RISC pouvait se produire. Il s'agit des «processing bodies» (P-bodics) (Liu et al., 2005b) et des «GW182-containing bodies» (GW-bodics) (Eystathioy et al., 2002). Il a été montré que la protéine Ago se retrouvait dans les P-bodies et qu'elle interagissait avec la protéine GW182 (Liu et al., 2005b). Des mutations empêchant Ago de s'y retrouver bloquent la répression traductionnelle des ARNm (Liu et al., 2005a). Des siarn ont également été retrouvés dans les GW-bodics (Jakymiw et al., 2005). L'activité du RISC a également été détectée au noyau (Robb et al., 2005), où elle pourrait jouer un rôle dans la répression transcriptionnelle des gènes. Chez quelques espèces, dont les plantes (Schiebel et al., 1993), le nématode (Smardon et al., 2000) et les champignons tels que Neurospora crassa (N. crassa) (Cogoni and Macino, 1999) et la levure à fission S. pombe (Volpe et al., 2002), des ARN polymérascs dépendantes de l'arn (RdRP) peuvent jouer un rôle d'amplification de la voie de l'iarn. Elles génèrent des ARNdb à partir de transcrits d'arn simple-brin en synthétisant le deuxième brin d'arn en amorçant la transcription en absence d'amorce (Makcycv and Bamford, 2002). Ce système d'amplification est crucial chez les plantes et chez le ver pour amplifier le signal des siarn transmis de cellule à cellule et pour créer une régulation systémique des gènes (Palauqui et al., 1997; Vaistij et al., 2002). Aucun homologue de RdRP n'a cependant été retrouvé chez la drosophile ou chez l'humain (Sugiyama et al., 2005). Le mécanisme de régulation post-transcriptionnelle par la voie de l'iarn est résumé à la Figure 1.

18 7 Figure 1. Régulation des ARN messagers (ARNm) médiéc par les microarn (miarn) et les petits ARN interférents (siarn) (Oucllet et al., 2006). Les gènes de miarn sont transcrits en miarn primaires (pri-miarn) qui sont reconnus et clivés par le microprocesseur en miarn précurseurs (pré-miarn) qui sont exportés au cytoplasme par l'exportine-5. Ils sont ensuite clivés par Diccr, qui agit de concert avec la protéine «transactivating response RNA-binding protein» (TRBP) dans le complexe initiateur, pour générer un duplexe miarn:miarn*. Après la séparation et la sélection du brin effecteur, le miarn mature est intégré au complexe effecteur «mirna-containing ribonuclcoprotein» (mirnp) qui médie la répression d'arnm spécifiques. Des petits ARN interférents (siarn) peuvent être introduit dans les cellules pour être intégres dans la machinerie endogène via le «RNA-indueed silencing complex» (RISC) qui reconnaît et médie le clivage spécifique des ARNm Les petits ARN régulateurs Les petits ARN sont les principaux acteurs de la voie de l'iarn et sont responsables de la spécificité du processus. Il y en a deux types : les siarn et les miarn. Ce sont de petites molécules d'arndb de nt qui diffèrent selon leur structure, leur origine et leur mode d'action.

19 S Les siarn sont générés par le clivage de longs substrats d'arndb qui peuvent être endogènes (dérivés de l'activité d'une RdRP ou de la transcription bidirectionnelle de gènes ou de transposons), exogènes (ARN viral) ou synthétiques. Les deux brins du siarn sont parfaitement complémentaires et comportent des extrémités 3' protubérantes de 2 nt. Ils sont phosphorylés en 5' et hydroxylés en 3' (Elbashir et al., 2001b). Généralement, le brin du duplexe comportant l'extrémité 5' la moins stable thermodynamiquement est sélectionné et incorporé dans le RISC (Schwarz et al., 2003), où il guide son activité endonucléasique vers le site complémentaire de l'arnm cible, menant au clivage de ce dernier (Hamilton and Baulcombe, 1999; Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000). L'utilisation de siarn synthétiques représente une approche efficace pour étudier la fonction des gènes car ils permettent de réduire rapidement et efficacement l'expression d'un gène de manière spécifique (Elbashir et al., 2001a). Leur utilisation offre de nombreuses possibilités également dans le domaine de la thérapeutique. Les miarn, quant à eux, sont encodés dans le génome et sont transcrits en pri-miarn par la polll (Lee et al., 2002). On pense que plus de 92% des gènes pourraient être régulés par les miarn (Miranda et al., 2006) et, jusqu'à maintenant, on a identifié plus de 1500 miarn ( De récentes études montrent que leur production pourrait être régulée par un mécanisme d'édition des pré- et pri-miarn (Luciano et al., 2004). Quoiqu'on peut les retrouver sous forme de regroupement formant leur propre unité transcriptionncllc (Lee et al., 2002), au moins 40% des miarn sont transcrits à partir d'une séquence intronique d'un gène codant pour une protéine (Rodriguez et al., 2004), ce qui laisse entendre qu'ils peuvent être exprimés en même temps que la protéine qu'ils régulent. Les miarn possèdent toutes les caractéristiques structurales et chimiques du siarn à la différence qu'ils montrent un appariement imparfait des deux brins du duplexe miarn:miarn*, ce qui engendre un certain degré d'instabilité (Khvorova et al., 2003). Le brin guide, qui possède l'appariement à l'extrémité 5' le moins stable, est incorporé dans le RISC et, généralement, le brin passager est détruit (Matranga et al., 2005). Il est généralement accepté que les miarn entraînent une répression de la traduction (Bartcl, 2004), bien que dans certains cas une dégradation de l'arnm a été rapportée. À cet effet, la complémentarité en 5' est plus importante que celle en 3' pour la reconnaissance de la cible (Vclla et al., 2004), les nt en positions 2-7 étant critiques pour celle-ci (Enright, MicroRNA targets in Drosophila). La région ciblée est souvent située dans la région 3' non-traduitc

20 9 (NTR) de l'arnm (Xie et al., 2005). Jusqu'à maintenant, aucun miarn n'a été décrit chez les eucaryotes uniccllulaires simples, tels que les champignons et les levures Les rôles de l'iarn Plusieurs études ont démontré l'importance des miarn dans le développement. Chez Caenorhabditis elegans (C. elegans), le passage d'un stade larvaire à un autre (Ll à L4) serait sous le contrôle de gènes hétérochroniques régulés tcmporcllement, tel que lin-14. Le miarn lin-4 et sa cible lin-14 seraient sous le contrôle du développement du ver jusqu'à l'âge adulte (Bochm and Slack, 2005). Le miarn let-7 a également été identifié chez le ver. Celui-ci contrôlerait le passage du stade larvaire L4 à l'âge adulte également via la régulation de gènes hétérochroniques, dont fait partie lin-41 (Reinhart et al., 2000). let-7 a également été retrouvé chez le poisson zébré ou «zebrafish» (Kloosterman et al., 2004), où il régule le développement embryonnaire, et chez la souris et le poulet (Lancman et al., 2005; Schulman et al., 2005), où il régule les homologues du gène lin-41 de C. elegans. Les miarn sont aussi important pour le développement de la mouche. D'ailleurs, la stratégie de dcplétion de miarn individuel occasionne un phénotype dévcloppemental sévère pour plus de 25 des 47 miarn testés (Aboobakcr et al., 2005). Quelques études chez le poisson zébré (Giraldez et al., 2005) et la souris (Bcrnstein et al., 2003) ont également démontré l'importance de Diccr dans le développement, dont l'absence entraîne une morphologie anormale du cerveau et une léthalité embryonnaire, respectivement. Certains miarn semblent être impliqués dans l'apoptose. Chez la drosophile, le miarn bantam inhibe l'apoptose via le contrôle du gène hid (Brcnnecke et al., 2003), alors que chez l'humain, le miarn mir-21 aurait un rôle anti-apoptotique (Chan et al., 2005). Quant aux miarn mir-15a et mir16-l, ils agiraient chez l'humain comme répresseurs de Bcl2 pour induire l'apoptose (Cimmino et al., 2005). Chez les plantes, la co-suppression et le PTGS peuvent jouer un rôle de défense contre l'invasion virale (Matzke and Matzke, 1995). De plus, chez plusieurs eucaryotes dont C. elegans (Ketting et al., 1999; Tabara et al., 1999), Drosophila melanogaster (D. melanogaster) (Aravin et al., 2001) et Mus musculus (M. musculus) (Svoboda et al., 2004), certaines composantes de la voie de l'iarn sont requises pour réprimer les éléments transposables, ou transposons, qui peuvent consister en de l'adn viral intégré chez l'hôte.

21 10 Un tel mécanisme servirait à stabiliser le génome, étant donné que les événements de transposition induisent des mutations et favorisent des événements de recombinaison qui peuvent occasionner des réarrangements chromosomiques majeurs (Curcio and Dcrbyshire, 2003). Finalement, il a été démontré, chez plusieurs organismes, que les petits ARN peuvent induire des modifications au niveau de la chromatine. Chez Tetrahymena thermophila (T. thermophilu), les siarn sont utilisés pour marquer des séquences d'adn particulières, comportant souvent des répétitions, pour les éliminer du macronucléus transcriptionnellement actif (Mochizuki and Gorovsky, 2004a; Mochizuki and Gorovsky, 2004b). Chez S. pombe, il a clairement été démontré que l'iarn facilite les modifications de la chromatine à partir de séquences répétées avec, pour conséquence, la répression de l'expression des gènes. Ceci a un impact sur plusieurs fonctions chromosomiques de base, telles que la formation et le maintien de l'hétérochromatine (Volpc et al., 2002) et la ségrégation des chromosomes (Volpe et al., 2003). Tout comme chez S. pombe, des transcrits centromériques provenant de répétitions satellites ont été détectes chez la souris (Lehnertz et al., 2003) et chez l'humain (Saffcry et al., 2003), impliquant la voie de l'iarn dans la formation de l'hétérochromatine péricentromérique chez les mammifères. La connexion entre la voie de l'iarn et les modifications des histoncs a également été établie chez d'autres organismes, tels que la drosophile (Pal-Bhadra et al., 2004). 1.2 La levure Schizosaccharomyces pombe L'organisme S. pombe est un champignon unicellulaire qui a été isolé pour la première fois à partir d'une bière de millet provenant d'afrique de l'est et envoyée en Allemagne en 1890 ( Son nom origine de sa ressemblance au genre Saccharomyces du point de vue de la formation de spores et de sa capacité de fermentation, mais marque sa différence importante du point de vue morphologique. Le nom de son espèce provient de l'origine de son isolation : «pombe» veut dire «bière» en swahili, une langue d'origine africaine. Les cellules de S. pombe ont une forme en bâtonnet

22 11 et se divisent par fission médiane. Il s'agit d'un archaeascomycète qui aurait divergé de la lignée des ascomycètes il y a environ 1144 million d'années. La croissance de cet organisme est rapide (temps de génération de 2 à 4 heures) mais sans danger, puisqu'il est non-pathogène. De plus, la levure à fission est très facile à manipuler en laboratoire, ce qui en fait un modèle très populaire en recherche pour étudier les processus biologiques de base. La grande force de ce système provient de sa génétique; il est très facile d'isoler des souches mutantes, ce qui permet de caractériser les gènes impliqués dans un processus particulier. De plus, il est fréquent que les connaissances acquises avec cet organisme soient transposées à des systèmes plus complexes, tel que l'humain, puisque les gènes impliqués dans ces processus de base y sont souvent les mêmes La voie de PiARN chez S. pombe Le génome de S. pombe code pour trois protéines importantes de la voie de l'iarn, c'est-àdire Dcrl, Agol et Rpdl, une RdRP (Wood et al., 2002). Ces trois protéines ont été retrouvées dans des compartiments similaires du cytosol chez S. pombe, ce qui indique qu'elles pourraient y jouer un rôle dans la voie de l'iarn (Carmichael et al., 2006). Des souches mutantes de ces trois protéines montrent des phénotypes très caractéristiques et sont donc de bons modèles pour étudier le mécanisme et la fonction biologique de la voie de l'iarn. La plupart des études réalisées chez S. pombe en rapport avec la voie de l'iarn sont concentrées sur son rôle au niveau de l'hétérochromatine. En effet, on a vite remarqué, grâce aux phénotypes des mutants délétionnels créés, que la voie de l'iarn agissait au niveau du noyau selon un mécanisme de répression de la transcription des gènes se traduisant par une condensation de la chromatinc Le mécanisme de répression transcriptionnelle des gènes Au niveau de l'hétérochromatine de S. pombe se trouvent des séquences répétées de type dg et dh, desquelles origine une production d'arn sens et antisens provenant de la transcription des deux brins de l'adn génomique. Ces ARN forment des ARNdb qui sont des substrats pour Dcrl. Cette affirmation est appuyée par l'accumulation de transcrits sens

23 12 et antisens provenant des régions centromériques lorsque les composantes de la voie de l'iarn sont mutées (Volpe et al., 2002), ainsi que par l'identification, par séqucnçage d'une librairie de petits ARN, de siarn complémentaires à l'adn centromérique de S. pombe (Reinhart and Bartel, 2002). Les siarn ainsi générés sont ensuite incorporés sous forme de duplexes dans le complexe «RNA-induccd initiation of transcriptional genc silencing» (RITS), qui contient également la protéine Agol, Chpl, une protéine à chromodomaines qui lie l'hétérochromatinc, et Tas3, une protéine contenant des séquences Gly-Trp répétitives de fonction inconnue (Vcrdel et al., 2004). Le mécanisme de conversion du duplexe de siarn en siarn simple-brin fonctionnel n'est pas connu, mais pourrait impliquer une activité de clivage par Agol (Irvinc et al., 2006). Le complexe RISC serait par la suite dirigé aux régions ciblées sur la chromatinc via la complémentarité du siarn (Noma et al., 2004). On a d'abord pensé que le siarn était incorporé directement dans le complexe RITS. Cependant, une étude récente a démontré que le duplexe de siarn était d'abord incorporé dans un premier complexe, le complexe ARC (Argonaute, siarn, chaperonc), qui contient deux protéines jusqu'alors inconnues, les chaperones «Argonaute binding proteins» (Arb) Arbl et Arb2. Arbl inhiberait l'activité de clivage de Agol, l'empêchant du même coup de catalyser la formation du siarn simple-brin et de guider le complexe vers les régions complémentaires sur la chromatinc. Ce complexe pourrait donc être un régulateur négatif de la formation de l'hétérochromatinc (Buker et al., 2007). Deux modèles ont été proposés pour le recrutement du complexe RITS à des régions spécifiques du chromosome (Grcwal and Moazed, 2003; Lippman and Marticnsscn, 2004; Verdel et al., 2004). Dans le premier modèle, le siarn associé au RITS se lie directement à l'adn, ce qui nécessite un déroulage de la double-hélice d'adn pour permettre aux deux acides nucléiques de se lier. Dans le second modèle, le RITS est recruté indirectement via une interaction avec les nouveaux transcrits d'arn. Une fois associé aux transcrits naissants, le complexe RISC recrute deux complexes additionnels : le complexe Rikl («Rikl containing-complex») et le complexe «RNA-dircctcd RNA polymerase» (RDRC). Le complexe Rikl est constitué de plusieurs protéines, dont la protéine Clr4, une H3-K9 histonc méthyltransférasc (Horn et al., 2005; Jia et al., 2005; Li et al., 2005; Thon et al.,

24 ). La méthylation des histones par Clr4 produit un site de liaison pour les protéines Chpl, qui fait partie du complexe RITS, et Swi6, une protéine orthologuc de HPl («hcterochromatin protein 1») (Lachncr et al., 2001). Le chromodomainc de HPl interagit spécifiquement avec les histones H3 méthylécs à la lysine 9. La liaison de la protéine Swi6 favorise l'extension de la formation de l'hétérochromatinc par le recrutement de protéines supplémentaires, telles que Clr4 et la cohésine Rad21 (Bernard et al., 2001). Le site de formation de l'hétérochromatinc est donc riche en protéines Swi6 et Rad21, et est silencieux transcriptionncllcmcnt. La liaison de Chpl, quant à clic, permet une liaison efficace du RITS à la chromatine, qui est nécessaire pour le recrutement du complexe RDRC et la synthèse de l'arndb (Motamedi et al., 2004). Le complexe RDRC, quant à lui, contient la protéine Rdpl, l'hélicase Hrrl et la protéine Cidl2, qui fait partie de la famille des poly(a) polymérascs non-canoniques, et permet de réguler la formation d'arndb et de siarn via un processus d'amplification, une étape nécessaire à l'extension de la formation de l'hétérochromatine. En effet, Rdpl convertit les transcrits d'arn en ARNdb qui, lorsque converti par Dcrl, génère d'autres siarn (Motamedi et al., 2004). La protéine Agol serait indispensable à ce processus. En effet, des mutations insérées au site actif de Agol ont permis de démontrer que son activité de clivage est requise pour le recrutement du complexe aux régions centromériques. Le clivage par Agol pourrait fournir des extrémités 3' hydroxylées qui seraient la cible de Rdpl pour son activité (Irvine et al., 2006). En fait, Rdpl jouerait un rôle primaire dans la production des siarn. Dans des cellules n'exprimant pas Rdpl, il n'y a aucun siarn détecté dans le RISC, bien que des ARNdb devraient être tout de même produits à partir de transcrits provenant des deux brins d'adn (Motamedi et al., 2004). Ceci indique que l'étape d'amplification est indispensable pour la formation de l'hétérochromatinc et que les premiers siarn produits ne servent qu'à initier la voie. Le mécanisme de répression transcriptionncllc par la voie de l'iarn est résumé à la Figure 2. L'hétérochromatine de S. pombe se retrouve dans trois régions principales : les centromères, les télomères et dans le locus mat2/3, qui est en rapport avec le type sexuel, ou «mating type». La voie de l'iarn serait nécessaire à l'initiation de la formation de l'hétérochromatine au niveau de ces trois régions. Elle serait également nécessaire au maintient de celle-ci dans la région du centromère, contrairement aux régions mat2/3 et aux

25 14 télomcrcs, qui pourraient maintenir l'hétérochromatinc en absence d'iarn (Hall et al., 2002). Ceci peut être expliqué par l'existence d'un sentier alternatif pouvant jouer la même fonction. H3 non-méthylées H3 méthylées à la Lys9 Figure 2. Modèle de la formation de l'hétérochromatinc médiéc par l'iarn (Elgin and Grewal, 2003). De l'arn double-brin (ARNdb) est généré à partir d'une séquence répétée, soit grâce à l'activité d'une ARN polymérase dépendante de l'arn (RdRP), soit par l'appariement de transcrits sens et antisens produits par des promoteurs ayant une orientation opposée. L'ARNdb est ensuite clivé par Dcrl pour produire des petits ARN interférents (siarn), qui sont utilisés pour localiser les complexes permettant la modification des histones. La formation de l'hctérochromatine se propage alors grâce à l'activité combinée des H3-lysine 9 méfhyltransférases et des protéines associées Swi6/HPl. RISC, «RNA-induced silencing complex». Une étude des cibles de la voie de l'iarn a permis d'identifier des gènes qui ne sont pas normalement associés à des loci hétérochromatiques connus (Cam et al., 2005). L'iARN pourrait donc moduler l'assemblage de l'hétérochromatine dans le but de réguler

26 15 l'expression de gènes individuels chez S. pombe, comme c'est le cas pour quelques loci endogènes chez A. thaliana (Zilbcrman et al., 2003). Cette étude a également permis d'identifier les gènes ribosomaux, qui contiennent des séquences répétitives et qui sont situés près des télomères sur le chromosome III, parmi les cibles de méthylation par la voie de l'iarn Les protéines majeures de la voie de l'iarn La protéine De ri Le gène codant pour la protéine Dcrl (no. d'accession : Q09884) est situé sur le chromosome III chez S. pombe et comporte 4125 pb. La protéine Dcrl chez S. pombe est non-épissée et est très similaire à la protéine Dicer chez l'humain, bien qu'elle soit un peu plus petite (protéine de 1374 acides aminés (158 Kda) versus protéine de 1912 acides aminés (217 Kda)). Les gènes codant pour la protéine Dicer semblent avoir été bien conservés au cours de l'évolution : la séquence primaire en acides aminés montre une similarité relativement élevée et les domaines de liaison à l'atp, la boîte DECH et le second motif RNasc III sont présents et très similaires, alors que le premier motif RNasc III est un peu décalé vers l'extrémité C-tcrminalc dans la protéine Dcrl. Par contre, une différence notable est l'absence du domaine PAZ, qui semble jouer un rôle dans la reconnaissance des extrémités des pré-miarn (Ouellet et al., 2006). Des immunoprécipitats de la protéine incubés en présence du pré-miarn humain let-7 ou avec de longs substrats d'arndb ont montré une activité permettant le clivage d'arndb et la production d'arn d'environ 23 nt (Provost et al., 2002b). L'enzyme Dcrl est donc capable de cliver les pré-miarn et les précurseurs des siarn in vitro. Le domaine C-terminal de la protéine semble suffisant pour ce clivage, puisque le domaine montrait la même activité après avoir été exprimé et purifié à partir de Escherichia coli (E. coli) (Qian et al., 2005). En plus de son rôle dans la voie de l'iarn, la protéine Dcrl serait également impliquée dans la régulation de quelques événements du cycle cellulaire, tels que la cytokinèse, les arrêts du cycle cellulaire en cas de stress génotoxique et les croisements de type sexuel («mating») (Carmichacl et al., 2004). Cette régulation se ferait indépendamment des siarn. Les souches délétionnelles de Dcrl montrent un phénotype en lien avec un dysfonctionnement au niveau de la condensation de la chromatine. Il y a d'abord une

27 16 accumulation de longs ARN provenant de la transcription des régions ccntromériques (Provost et al., 2002b) et une délocalisation du RITS des ccntromères due à l'absence de siarn (Vcrdcl et al, 2004). Les souches montrent également une croissance plutôt lente et une mauvaise ségrégation des chromosomes durant l'anaphasc (Provost et al., 2002b) La protéine Agol Le gène codant pour la protéine Agol (no. d'accession : ) comporte 2876 pb et est situé sur le choromosome III. La protéine Agol est produite à partir d'un ARNm épissé de 2505 pb et comporte 834 acides aminés (94 kda). Elle montre une localisation nucléaire et cytoplasmiquc (Carmichael et al, 2006; Motamcdi et al., 2004) et possède une activité ribonucléasique, tel que démontré par l'incubation de la protéine recombinante purifiée à partir de E. coli avec un ARNm et des oligoribonucléotides de 23 nt complémentaires à sa séquence (Irvine et al, 2006). Cette activité promeut la génération d'arndb par Rdpl, puisque ses produits de clivage non-protégés ou coiffés (Gazzani et al., 2004) et comportant des extrémités 3' hydroxylec (Motamedi et al., 2004) sont optimaux pour l'activité de Rdpl. Dans des souches mutantes de Agol, aucun si ARN dérivé des régions ccntromériques n'est détecté (Irvine et al., 2006) et un phénotype semblable aux souches délétionnclles de Dcrl est observé. Tout comme Dcrl, Agol serait impliquée dans les événements du cycle cellulaire nommés plus haut (Carmichael et al., 2004). Une étude récente a démontré une interaction entre l'extrémité N-terminale de Agol et la protéine , qui fonctionne dans la régulation du cycle cellulaire (Stoica et al., 2006). Cette interaction serait impliquée dans le contrôle du passage en mitose au stade G2/M. Une telle interaction a également été observée avec les protéines humaines, ce qui suggère un lien entre Agol et le cycle cellulaire. Aucun lien entre Dcrl et la protéine n'a été rapporté jusqu'à maintenant dans la littérature La protéine Rdpl Le gène codant pour la protéine Rdpl (no. d'accession : ) est situé sur le chromosome I et comporte 3648 pb. La protéine est non-épissée et comporte 1215 acides aminés (139 Kda). Elle a, tout comme Agol, été détectée dans le noyau et le cytoplasme chez S. pombe (Carmichael et al., 2006; Motamedi et al., 2004). Son rôle primaire dans la génération des ARNdb serait dépendant de son association à la chromatine via les transcrits

28 17 naissants (Motamedi et al., 2004). Son rôle d'amplification serait, quant à lui, dépendant de sa capacité à générer des ARNdb à partir des extrémités 3' hydroxylées produites lors du clivage par Agol (Irvine et al., 2006). Il est intéressant de noter que son activité est indispensable à la formation des siarn (Motamedi et al., 2004), contrairement aux RdRP des plantes et de C. elegans, qui ne sont requises que pour l'amplification (Dalmay et al., 2000; Sijen et al., 2001). Il semble que le caractère indispensable de la protéine ait évolué pour devenir secondaire, et ensuite disparaître chez les eucaryotes supérieurs. 1.3 Résultats antérieurs Les études de maîtrise d'un ancien étudiant du laboratoire, Pierre Plante, avaient deux objectifs principaux : 1) identifier des protéines pouvant être régulées par la voie de l'iarn et, plus particulièrement, par Dcrl, chez S. pombe, et 2) identifier des protéines pouvant interagir avec Dcrl, et, par le fait même, réguler l'activité de Dcrl Identification de protéines pouvant être régulées par Dcrl Les protéines pouvant être régulées par Dcrl et par la voie de l'iarn ont été identifiées par analyse comparative en gels à deux dimensions d'extraits protéiques provenant de deux souches, soit la souche déficiente en Dcrl (Hu655) et la souche de type sauvage (Hu303). Les protéines montrant une variation d'expression d'un facteur plus grand que deux entre les deux lignées étaient identifiées par une analyse de «liquid chromatography-mass spectrometry-mass spectrometry» (LC-MS-MS). Cette approche a permis d'identifier 8 protéines dont l'expression augmentait ou diminuait chez la souche déficiente en Dcrl. Parmi celles-ci, 3 protéines faisaient partie de la voie de la glycolyse : l'hcxokinase 2 (HK2), la phosphoglycérate kinase (PGK) et l'énolase (L.-A. Gobeil et al., sous presse, voir annexe Tableau 1 et Figures 2 à 4). Tel que montré à la Figure 3, la voie de la glycolyse comprend 9 réactions et mène à la production de deux molécules d'atp, deux molécules de pyruvatc et deux molécules de NADH par molécule de glucose. La première réaction de la voie nécessite l'utilisation d'une molécule d'atp et permet la formation de glucosc-6-phosphatc à partir du glucose. Cette réaction est catalysée par l'hk2. Ensuite, le glucose-6-phosphate est converti en fructose-6- phosphatc, puis une autre molécule d'atp est utilisée pour phosphoryler l'intermédiaire et