Lactobacillus casei inhibe l invasion de cellules épithéliales mammaires bovines par Staphylococcus aureus

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1 Lactobacillus casei inhibe l invasion de cellules épithéliales mammaires bovines par Staphylococcus aureus Bouchard Damien, Rault Lucie, Berkova Nadia, Le Loir Yves, Even Sergine UMR1253 INRA Agrocampus Ouest STLO

2 Les mammites Streptococcus uberis Escherichia coli Staphylococcus aureus Mammites Santé Animale Pertes économiques ( 120 /vache/an) Heikkila et al., 2012 Problèmes sanitaires Sécurité Alimentaire Toxi-infections Problèmes dans la transformation

3 Cycle infectieux GLANDE MAMMAIRE Multiplication Adhésion Internalisation Réplication intracellulaire Biofilm Lyse Dissémination Contamination par voie ascendante S. aureus

4 Cycle infectieux GLANDE MAMMAIRE Multiplication Adhésion Internalisation Réplication intracellulaire Biofilm Lyse Dissémination Contamination par voie ascendante Chronicité des infections à S. aureus S. aureus

5 Stratégies de lutte Prévention Traitement Vaccins Faible efficacité Antibiotiques Faible efficacité Risque de dissémination de l antibio-résistance EcoAntibio 2017 antibiotiques de 25% en 5 ans -Promouvoir les approches alternatives 1000 tonnes d ATB par an en medecine vétérinaire en France (20% a destination des bovins)

6 Stratégies de lutte Prévention Traitement Vaccins Faible efficacité Antibiotiques Faible efficacité Risque de dissémination de l antibio-résistance EcoAntibio 2017 antibiotiques de 25% en 5 ans -Promouvoir les approches alternatives Sélection génétique Stratégies alternatives Homéopathie Lutte biologique (Bactéries lactiques) Huiles essentielles Thérapie phagique Lysostaphine

7 Les Bactéries lactiques Innocuité, statut GRAS et QPS pour certaines espèces Propriétés technologiques, capacités probiotiques pour l homme ou l animal Présentes dans le microbiote du trayon Antagonisme sur les flores délétères ou pathogènes (aliments fermentés, écosystèmes intestinal, vaginal et mammaire) Capacité de L. lactis à inhiber la croissance et la virulence de S. aureus (Even et al 2009, Nouaille et al. 2014) Capacité de L. lactis à stimuler in vivo la réponse immunitaire mammaire (Beecher, 2009) Antagonisme de bactéries lactiques de l écosystème mammaire contre des pathogènes isolés de mammites (Espeche, 2012, Vet Mic) Lutte biologique probiotique mammaire

8 Objectif S. aureus Glande mammaire Bactéries lactiques Evaluer la capacité des bactéries lactiques à interférer avec les étapes de colonisation du tissu mammaire bovin (in vitro)

9 Stratégie Staphylococcus aureus (souches isolées de mammite bovine) 1. RF122 (clone majeur associé aux mammites bovines) (Fitzgerald, 1997) 2. NB305 (induit des mammites chroniques (Banner, 2004; Hensen, 2000, JDS). Cellules épithéliales mammaires bovines MAC-T Capacité de L. casei à inhiber l adhésion et l internalisation de S. aureus dans des CEMb Lactobacillus casei 1. CIRM-BIA 667 (ATCC393) souche type 2. BL23 (souche probiotique intestinale) Foligne, 2007 / Rochat, 2007) 3. CIRM-BIA1542 (isolée du microbiote mammaire bovin)

10 Capacité d adhésion de S. aureus et L. casei Ratio bactéries : cellules S. aureus 100:1 L. casei 2000:1 RF 122 < NB 305 Souches de L. casei homogènes S. aureus > L. casei

11 Capacité d internalisation de S. aureus et L. casei Ratio bactéries : cellules S. aureus 100:1 L. casei 2000:1 RF 122 < NB 305 Variabilite au sein de L. casei

12 Inhibition de l adhésion de S. aureus par L. casei Préincubation des L. casei pendant 2h Infection avec S. aureus pendant 1h Ratio bactéries : cellules S. aureus RF / NB MOI 100:1 L. casei 667 /BL23 ROI 2000:1 L. casei 1542 ROI 400:1 Souche dépendance de l inhibition de l adhésion de S. aureus par L. casei

13 Inhibition de l internalisation de S. aureus par L. casei Coinfection avec L. casei et S. aureus pendant 2h Traitement à la gentamicine pendant 2h S. aureus RF / NB MOI 100:1 Ratio bactéries : cellules L. casei 667 /BL23 ROI 2000:1 L. casei 1542 ROI 400:1 Inhibition de l internalisation de S. aureus RF122 et NB305 par les 3 souches de L. casei

14 Rôle de L. casei sur la vie intracellulaire de S. aureus? GLANDE MAMMAIRE Multiplication Adhésion Internalisation Réplication intracellulaire Biofilm Lyse Dissémination

15 Survie intracellulaire de S. aureus et L. casei T 1/2 = 6.1 h T 1/2 = 5.1 h P= 0.12 S. aureus L. casei L. casei n affecte pas la cinétique de déces de S. aureus internalisé L. casei internalise dans les cellules MAC-T et survit avec une efficacité meilleure que S. aureus

16 Structure et viabilité des cellules MAC-T lors des infections MAC-T + RF122 + RF122 + LB 667 Comptage de la viabilité Bleu de Trypan Mesure de l activité métabolique Dosage MTT Le traitement bactérien n affecte ni la viabilité cellulaire ni la morphologie

17 Mécanisme d inhibition de l adhésion et de l internalisation S. aureus S. aureus + L. casei S. aureus + heat-killed L. casei S. aureus + Acide lactique (ph 6,8) Surnageant de culture de L. casei Filtre à 0.4 µm Conditions de références Viabilité requise? Production de substances inhibitrices? Contact nécessaire?

18 Résultats 2 Mécanisme d inhibition de l adhésion + medium L inhibition de l adhésion requiert un contact avec L. casei vivant ou non

19 Mécanisme d inhibition de l internalisation L inhibition de l internalisation requiert un contact avec L. casei vivant

20 Mécanisme d internalisation de S. aureus - Fraunholz et Sinha, 2012, Front Cell Infect Mic - - Ogawa,1985, Inf. Imm. Bayles, 1998, Inf. Imm. -

21 FnbA FnbA Mécanisme d inhibition de l internalisation de S. aureus L. casei BL23 possède une FnbA Hypothèse : inhibition par compétition pour la fibronectine ou l intégrine BL23 X BL23 FnbA Test des deux souches dans le modèle d inhibition de l internalisation Munoz-Provencio et al., 2010

22 Taux de BL internalisées (%) Mécanisme d inhibition de l internalisation de S. aureus 120 *** NB305 + BL23 + BL23 FnbA La délétion de la Fibronectine-Binding Protein de L. casei ne diminue pas sa capacité d inhibition de l internalisation

23 «Take home messages» L. casei inhibe l adhésion de S. aureus de manière souchedépendante L. casei inhibe l internalisation de S. aureus RF122 et Newbould 305 L inhibition de l adhésion et de l internalisation repose sur un contact cellulaire de L. casei (vivant pour l internalisation) L. casei n affecte pas le taux de survie intracellulaire de S. aureus Un traitement des cellules par L. casei n affecte pas leur structure ni leur viabilité

24 Damien Bouchard Yves Le Loir Lucie Rault Nadia Berkova Instituto de agroquimica y tecnologia de Alimentos-CSIC Vicente Monedero