Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale ( )

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1 Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale ( ) Offre actuelle, Contour Resp. Olivier CORITON UMR 1349 IGEPP INRA-Agrocampus ouest-univ Rennes 1 INRA Centre de Rennes olivier.coriton@rennes.inra.fr Nantes, le 28 Mars 2013

2 Cytogénétique Moléculaire?

3 Cytogénétique Moléculaire? née de la rencontre «Biologie moléculaire» et «Cytogénétique traditionnelle» FISH L outil principal est l Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur préparation chromosomique permet une «Analyse fine de la structure des chromosomes»

4 FISH Les outils de cytogénétique moléculaire permettent de développer des projets scientifiques d études des génomes pour : 2 à 5 Mb Caractérisation cytogénétique du matériel végétal impliquant des hybrides interspécifiques ou des espèces polyploïdes : identification des chromosomes parentaux ou introgression, Evolution structurale des génomes chez des espèces polyploïdes, Caractérisation des translocations chromosomiques par liaison entre la cartographie génétique et physique, 1 kb Cartographie physique fine sur chromosomes en méiose (stade pachytène) et sur fibres d ADN permettant la caractérisation fine de l ordre du kb autour de locus d intérêt ou la détection d un remaniement chromosomique

5 Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur chromosomes 1- Préparation des lames -> Pour Mitose : Pointe de racine -> Pour Méiose : Anthère (Etamine) Sélection des lames

6 Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur chromosomes mitoses Multi-espèces Niveau de Polyploïdie : 2X 2X 2X 2X 2X 4X 4X 6X 8X

7 Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur chromosomes en méiose Leptotène Zygotène Pachytène Diplotène Diacinèse Métaphase I Anaphase I Anaphase I Métaphase II Anaphase II Télophase II Tétrade Stade pachytène (les chromosomes sont appariés sur toutes leurs longueurs) Résolution x 15 Stade métaphase I

8 Prestations proposées par la plate-forme Hybridation génomique in situ (GISH) qui permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures hybrides interspécifiques ou polyploïdes Localisation sur les chromosomes de séquences d'adn répétées (FISH) 1U 5U 5S v 6S v

9 Prestations proposées par la plate-forme Localisation physique de clones BAC sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC-FISH) Le BAC-Fiber-FISH qui permet l'analyse d'arrangements de séquences sur fibre d'adn peignées

10 Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploïde Le blé tendre, Allohexaploide 2n=6X=42 0,5 MYA Ae. speltoides A-genome T. urartu YA? B-genome D-genome

11 Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploide Mix sondes ADN Génomique D-probe-digoxgénine B-genome A-genome chromosomes «cible» Hybridation A-probe-biotine? B-genome D-genome Détection Anti-dig-Fluorescéine Avidin- Texas red

12 Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploïde Filtre DAPI Filtre Fluorescein Filtre Texas Red

13 Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploide Translocation 4A/7B Translocation 4A/7B

14 Exemple 2 : Techniques FISH + GISH sur Blé dur, tétraploide (AABB) Chr 1A ou 5A? 4A/7B 4A/7B Chr 1A ou 5A?

15 Exemple 3 : Technique GISH-like -> Le COLZA, Allotétraploide B. rapa AA, 2n= YA B. oleracea CC, 2n=18 B. napus AACC, 2n=38

16 Exemple 3 : Technique GISH-like -> Le COLZA, Allotétraploide Sonde spécifique du génome C GISH - like B. rapa AA, 2n=20 B. oleracea CC, 2n=18 B. napus AACC, 2n=38

17 Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale Equipement / Personnel Conditions d accès Cout des prestations Lisibilité Formations Démarche Qualité

18 Plate-Forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale INRA- UMR 1349 Institut de Génétique, Environnement et Protection des Plantes (IGEPP) - LE RHEU

19 1- Équipements Laboratoire de Cytogénétique Moléculaire Microscopie * Epifluorescence Axioplan 2 Zeiss * Système d'imagerie Caméra refroidie (Photometrics Cool SNAP HQ) Logiciel d'acquisition METAVUE (UNIVERSAL IMAGING) 2- Personnel

20 3- Accès La plate-forme étant ouverte à 50% de sa capacité vers les équipes de recherche : Site web : Un appel d offre accompagné d une plaquette de présentation Pour la prise en charge des prestations en fonction des demandes, nous avons deux niveaux d engagement : soit nous répondons à une prestation complète soit nous accueillons du personnel des unités demandeuses

21 4- Cout des prestations Localisation sur les chromosomes de séquences d'adn répétée (FISH) = 33 Euros/lame Hybridation génomique in situ (GISH) qui permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures hybrides interspécifiques ou polyploïdes = 38 Euros/lame Localisation physique de clones BAC sur les chromosomes (BAC-FISH) sur chromosomes en mitose et en méiose (stade pachytène) = 33 Euros/lame Le BAC-Fiber-FISH qui permet l'analyse d'arrangements de séquences sur fibre d'adn peignées (BAC Fiber-FISH) = 33 Euros/lame -> 200 Euros pour 6 lames

22 5- Lisibilité Depuis 2009 «LABELLISATION DES OUTILS COLLECTIFS» L'INRA a prévu de reconnaître 4 types d'outils collectifs en fonction de leur envergure : 1- Plateformes Stratégiques INRA 2- Plateformes INRA 3- Plateaux Techniques INRA 4- Ateliers INRA Le collège de direction a rendu son arbitrage identifiant notre outil comme Plateau Technique (PT) auprès de la CNOC : Outil N 37 «Plate-Forme de cytogénétique moléculaire «

23 6- Formations La plate-forme a également une mission de formation et d'information auprès des chercheurs, techniciens et stagiaires pour un transfert de technologie. Exemples : * Sur Bananier - Afin de caractériser des translocations, le BAC-FISH a été mis au point sur la plate-forme de cytogénétique de Montpellier (Resp. A. D Hont). -> L accueil de M. Rodier nous a permis d échanger et d'optimiser les techniques de marquage des clones BAC et de détection * Sur Caféier diploïde (C. canephora), nous avons pu mettre au point et former V. Viader (CIRAD-IRD-Montpellier) à la technique de BAC-FISH

24 7- Qualité La PF s est adossée à la démarche qualité mise en place par l unité sous l animation de deux groupes de travail «AQR» et «Métrologie» en lien avec un animateur qualité suivant le référentiel INRA (ISO 9001). Les principales actions «qualité» mises en œuvre sur la PF ont été : (1) Mise en place des cahiers de laboratoires, (2) Rédaction de 30 Modes Opératoires, (3) Document unique OPPI (Outil de Pilotage de la Prévention à l INRA), (4) Métrologie : Contrôle des températures (Frigo, Congélateur, Etuve) (OCEASOFT) Contrôle des balances Contrôle annuel des micropipettes METTLER TOLEDO

25 FISH chez les plantes? Exemples de projets développés au sein de l unité Equipe 1 - Biodiversité et Polyploïdie Décrire et structurer la diversité génétique, l exploiter via la recombinaison homologue et homéologue (Resp. A-M Chèvre) 50% Plate forme de cytogénétique Moléculaire

26 [1] Quels sont les mécanismes de spéciation et de régulation des recombinaisons homologues et homéologues : Phase 1 : Suivi des modifications structurales qui interviennent dans les génomes lors de la stabilisation d espèces allopolyploïdes Stratégies : Espèces diploïdes 1+1#2 Synthétiques 4X, 6X? Espèces allopolyploïdes 4X, 6X ans 2000 ans ANR Biodiversité (AABBDD,2n=6X=42) (AACC, 2n=4X=38)

27 Quelles sont les différences entre un colza synthétique et un colza naturel? B. Rapa (Navet) AA, 2n=2X=20 x B. Oleracea (choux) CC, 2n=2X=18 1- Modifications structurales : Le GISH-like a montré d des irrégularités méiotiques avec des appariements entre les génomes A et C permettant la formation de translocations dès la 1ere méiose -> Caractérisation des réarrangements a pu être validée par BAC-FISH. S0 C1 C1 A1 B. Napus (colza) AACC, 2n=4X=38 C1 Nicolas et al, 2008, 2009 Leflon et al, 2010 Szadkowski et al 2010, 2011 Ksiazczyk et al, 2011 Suay et al, Modifications fonctionnelles dès l hybridation. Le choc génomique se traduit par des modifications au niveau des séquences ribosomiques liées à une régulation épigénétique. ANR Biodiversité Coll Moulon, IJPB-Versailles, URGV-Evry, Univ Rennes1, Brno-Czech Republic

28 Quelles sont les différences entre un blé synthétique et un blé naturel? x 1- Stabilité méiotique : le GISH n a pas montré d importantes irrégularités, défaut partiel d appariement homologue conduisant à la formation d aneuploides, Blé dur AABB 2n = 4X= 28 DD (Aegilops tauschii) 2n = 2X= Modifications structurales : aucun réarrangement ou élimination de séquence d ADN n a été observé chez les blés synthétiques au cours des trois premières générations, Blé tendre AABBDD 2n = 6X= 42 Mestiri et al 2010, 2013 Chagué et al, 2010 Chelaifa et al, Expression des gènes (transcrits) : additivité majoritaire pas d effet génération pas d effet du génome D peu de différences avec blé tendre Coll URGV-Evry ANR Biodiversité

29 [2] les transferts de gènes entre espèces Optimisation d introduction de gènes d intérêt Les connaissances acquises permettent Mécanismes impliqués dans la stabilisation d une espèce polyploïde Evaluation de flux de gènes (AABBDD, 2n=42) (AACC, 2n=38) * Résistance aux nématodes à partir de Aegilops variabilis (Coriton et al, 2009) Effet de la position des (trans)gènes sur le flux 1B 6B 5D Added chromosome * Recombinaison entre chromosomes homéologues de Blé : Caractérisation de lignées isohoméoalléliques pour les gluténines de haut poids moléculaire (Dumur. J et al, 2009b, 2009b) 1A /1D

30 FISH chez les plantes? Projets développés en collaboration avec des équipes extérieures

31 La plate-forme est ouverte à 50% de sa capacité : Collaboration à différents projets de recherche extérieurs R. Freuda-Agyeman, H. Rahman - University of Alberta CANADA G. King, C. Ryder Univ Warwick - UK PFMCV INRA, CNRS Univ- Rennes INRA- Evry MUSEUM- Paris INRA- Versailles INRA- Angers INRA- Colmar A. Kovarik, Academy of Sciences, Brno CZECH REPUBLIC INRA- Lusignan INRA- Clermont-Fd INRA- Bordeaux INRA- Toulouse INRA CIRAD IRD Montpellier A. Mason, M. Nelson University of Queensland Brisbane AUSTRALIA

32 PROJETS : Structures hybrides interspécifiques ou polyploïdes? 1- UR de Génétique et d'amélioration des plantes fourragères - LUSIGNAN Projet : Analyse de la dynamique de la diversité génétique au sein de peuplement de Ray-grass introgressé par la Fétuque 2- UMR Diversité et génome des plantes cultivées MONTPELLIER Projet : Suivi de populations d Aegilops au contact de blés cultivés et étude des phénomènes d introgression 3- UR 419 sur les Espèces fruitières et la Vigne, «Analyse des génomes de Fragaria» - BORDEAUX Projet : Utilisation de la cartographie physique pour définir l origine du génome des espèces polyploïdes au sein du genre Fragaria en particulier chez le fraisier cultivé F. x ananassa (Espèce octoploïde) 4 - UMR GenHort INH ANGERS Projet : Hybridation somatique interspécifique chez pélargonium - caractérisation cytogénétique et moléculaire

33 PROJETS : Dynamique des génomes chez des espèces polyploïdes- Eléments Transposables 5- UMR 1095 Amélioration et Santé des Plantes CLERMONT-FERRAND Projets : Elements transposables et Histoire évolutive de Triticum sp- 6- UR Génomique Végétale (URGV) - EVRY Projets : Etude de l activation des Éléments transposables chez le blé tendre 7- UMR CNRS 6553 Ecobio «Evolution des Genomes et Speciation - RENNES Projet 1: Evaluation de l implication des rétrotransposons dans la variation de la taille des génomes chez des espèces de lupins écologiquement divergentes Projet 2 : Origine de la polyploïdie dans le complexe Hordeum murinum en Afrique du Nord : Diversité et évolution

34 PROJETS : Cartographie physique fine de locus sur chromosomes 8- UMR SVQV- Génétique et d'amélioration de la Vigne - COLMAR Projet : Localisation des contigs de séquences de l assemblage du génome 9- UMR619 Biologie du Fruit - BORDEAUX Projet : Etude des conséquences de la polyploïdie sur le fonctionnement et la croissance cellulaire au cours du développement du fruit 10- UMR990 INRA/INP-ENSAT Génomique et Biotechnologies des Fruits - TOULOUSE Projet : Assignation de BAC par FISH en appui pour le séquençage du chromosome 7 de la Tomate

35 Exemple de projet de Cartographie Physique UMR990 INRA/INP-ENSAT Génomique et Biotechnologies des Fruits - TOULOUSE

36 chr Chromosome 7 project Genomic and Biotechnology of Fruit UMR990 INRA/INP-Toulouse France Farid Regad, Mondher Bouzayen (Project leader)

37 Genome Structure Diploid specie 12 chromosomes pairs Genome size 950MB Repeat sequence 30% Sequencing of gene-rich euchromatic region - 220MB Estimated number of BACs to be sequenced: 277

38 FISH mapping status FISH : Plate-Forme Rennes S. Stack (Colorado, USA) Z. Cheng (Pékin, Chine) 0 50 BACs clones will be or not on the chromosome situations

39 (1) (2) BAC LE_ HBa 0104E B15 BAC LE_ HBa 0006H B15 BAC LE_ HBa 0224G B15 (3) (4) BAC LE_ HBa 0027G B15 BAC LE_ HBa 0173A B15 BAC LE_ HBa 0116J06

40 FISH mapping status BACs are in the process on the chromosome 0 High-resolution FISH strategies on pachytene chromosomes K7

41 Infos: 15 BACs BAC name SL_EcoRI0127B09 plasmid pindigoba C-5 Details insert size (kb)? position cm? LE_HBa0048M11 LE_HBa0140O20 pbelobac 11 pbelobac 11? 85, LE_HBa0018L21 pbelobac 11?? LE_HBa0309F18 pbelobac LE_HBa0102J11 pbelobac LE_HBa0046G04 LE_HBa0195N01 pbelobac 11 pbelobac ? 63,5? LE_HBa0006H17 LE_HBa0030C22 LE_HBa0024K03 LE_HBa0028P04 LE_HBa0224G23 pbelobac 11 pbelobac 11 pbelobac 11 pbelobac 11 pbelobac ? ?? ,5 LE_HBa0309B15 pbelobac 11 K7 subtelomeric site on the long arm of chromosome LE_HBa0057J04 Renferme la séquence centromérique TGR4

42 Mitose -> La résolution des chromosomes en mitose n est pas suffisante (impossible de visualiser le pool de BAC)

43 Méiose K7 K7 Steve stack (US) BAC 309B15 Hans dehong (NL)

44 Méiose K7 K7 Steve stack (US) BAC 309B15 Hans dehong (NL)

45 Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale ( ) MERCI DE VOTRE ATTENTION