ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES

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1 MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté Par Erwan CORCUFF Pour l obtention du diplôme de l Ecole Pratique des Hautes Etudes TITRE : Cytokines et homéostasie lymphocytaire T Soutenu le : devant le jury suivant : Président : Dr Canque Bruno Rapporteur : Dr Bettaïeb Ali Maître de stage : Dr Di Santo James Examinatrice : Dr Garcia Sylvie Examinateur : Dr Eberl Gérard Laboratoire de : Immunophysiologie et immunothérapie des cancers Dr JF Jeannin EPHE (Sciences de la vie et de la terre ). Faculté de médecine,7 bd Jeanne d Arc Dijon Laboratoire : Unité des cytokines et développement lymphoïde Institut Pasteur, Département d immunologie. 25 Rue du Dr Roux Paris. Dr Di Santo : disanto@pasteur.fr ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE Cytokines et homéostasie lymphocytaire T CORCUFF Erwan EPHE Banque de Monographies SVT 1

2 RESUME Les lymphocytes, acteurs clés du système immunitaire, sont soumis tout au long de leur existence aux mécanismes physiologiques de régulation homéostatique. L homéostasie permet de garantir un système immunitaire efficace, en maintenant un remplissage lymphocytaire optimal. Le contrôle et la stabilité du compartiment lymphocytaire périphérique impliquent que, à tout moment, l organisme doit pouvoir induire la mort cellulaire ou apoptose, la survie, la prolifération et l expansion, pour pouvoir ajuster la quantité et la qualité lymphocytaires. Les signaux induisant ces événements cellulaires sont d origines diverses. Pour les lymphocytes T, cellules de l immunité acquise propre aux vertébrés, responsables de la reconnaissance antigénique de haute affinité et de la mémoire immunologique, il a été mis en évidence au moins deux types de signaux. Le récepteur T, responsable de la reconnaissance antigénique et en grande partie de l activation cellulaire, joue aussi un rôle important dans la transduction de signaux contrôlant la mort, la survie et les capacités prolifératives de la cellule T qui le porte, ces événements pouvant avoir lieu dans le compartiment périphérique ou au moment du développement thymique. Les récepteurs à cytokines et plus spécifiquement le récepteur commun gc des interleukines 2, 4, 7, 9, 15 et 21, ainsi que les cytokines correspondantes, jouent un rôle important dans l induction de signaux permettant le contrôle de la durée de vie du lymphocyte T et de ses capacités de prolifération, en périphérie tout comme dans le thymus. Les effets des signaux induits par le TCR et les cytokines, sur la survie, l apoptose et la prolifération périphériques des lymphocytes T sont l objet de cette étude. MOTS CLES : Lymphocytes - Homéostasie - Récepteur T - Cytokines Introduction Immunité 1 Adaptative et innée Rôle des lymphocytes T 2 Les lymphocytes T ab Les lymphocytes T ab CD4 et CD8 3 Les lymphocytes T ab et leurs différents stades d activations 4 Le développement des lymphocytes T 6 Thymus Développement T ab 7 Différenciation CD4 et CD8 14 Export thymique 15 Homéostasie 16 Homéostasie lymphocytaire Homéostasie des lymphocytes T Événements majeurs liés à l homéostasie 17 Dérégulation homéostatique 18 Apoptose 19 Compétition Survie 22 Notion et Définition Interaction CMH-TCR Cytokines 24 EPHE Banque de Monographies SVT 2

3 Molécules de la famille des Bcl-2 Prolifération homéostatique 26 Notion et Définition Interaction CMH-TCR Cytokines 27 Projet 28 Modèles d études 29 Matériels et méthodes Modèles murins 31 Lignées de souris TCR transgéniques Lignées de souris receveuses 32 Anticorps et réactifs 33 Obtention des cellules T 34 Analyse par cytométrie de flux 34 Marquages cellulaires (CD) Marquage intracellulaire (Bcl-2) 35 Transferts adoptifs de cellules T 35 Résultats Les cytokines et l homéostasie des cellules T CD4 tg 37 Détermination du rôle individuel des cytokines 38 Hôtes et transferts Survie 39 Prolifération 40 La molécule Bcl-2 et la survie des cellules T CD4 tg 42 Expression endogénique Expression transgénique 43 Quantification des CD4 tg thymiques et spléniques 43 Rôle de la molécule Bcl-2 en absence de l interleukine 7 44 Transferts de CD4 Bcl-2 gc- Résultats préliminaires Les cytokines et l homéostasie des cellules T CD8 tg 46 Rôle de la chaîne gc dans la génération et la survie des T CD8 transgéniques Analyse phénotypique des trois modèles transgéniques EPHE Banque de Monographies SVT 3

4 La protéine Bcl-2 et la survie des cellules T CD8 tg 47 Expression transgénique Quantification des CD8 tg thymiques et spléniques Discussion Survie 49 Signaux de survie : rôle du CMH Signaux de survie : rôle des interleukines 50 Cytokines essentielles 51 Autres signaux Effets de l hôte 52 Prolifération 53 Prolifération : rôle du CMH Prolifération : interleukine 7 et Bcl-2 54 Origines des cellules transférées Effets de l hôte 55 Transgénèse et recombinaison homologue: limites des modèles 58 Perspectives «Décryptage» des modèles CD8 TCR transgéniques 58 Nombre de récepteurs T Niveau d activation des récepteurs T 59 Population CD8 tg «CD44 like» Détermination des facteurs cytokiniques essentiels aux CD8 tg Conclusion 60 Figures 61 Bibliographie 86 -/- : Déficience d un gène par recombinaison homologue Liste des abréviations EPHE Banque de Monographies SVT 4

5 Ag Antigène APC : AlloPhycoCyanine Bcl-2-Tg: souris transgénique pour la protéine anti-apoptotique Bcl-2 CD : marqueur de différenciation (Cluster of Differentiation) CD25 : IL-2Ra CD44 : molécule liant l acide hyaluronique afin de médier l adhésion des leucocytes CD62L : L-sélectine, molécule d adhésion des leucocytes médiant les interactions vers l endothélium CFSE : 5, 6-CarboxyFluorescein diacetate Succinimyl Ester CMH : Complexe Majeur d Histocompatibilité TN : thymocyte immature Triple Négatif (TCR - CD3 - CD4 - CD8 - ) DN : thymocyte immature Double Négatif (TCR CD4 - CD8 - ) DP : thymocyte Double Positif (TCR - CD3 + CD4 + et CD8 + ) FITC : Fluorescéine IsoThioCyanate g c : chaîne g commune aux récepteurs des cytokines Hy : antigène mâle HY : souris RAG-2 -/- TCR-Tg antihy-cd8 + Ig : Immunoglobuline IL : Interleukine I.V. : injection de cellules par intraveineuse J : jour Ml : souris RAG-2 -/- TCR-Tg antihy-cd4 + MATA: souis RAG-2 -/- TCR-Tg antihy-cd8 + LCMV : Virus de la ChorioMeningite Lymphocytaire NK : cellules Natural Killer pag-cmh : Complexe peptide antigénique-cmh PBS : Phosphate Buffered Saline P14 : souris RAG-2 -/- TCR-Tg gp33-41 LCMV-CD8 + RAG : gène activateur de recombinaison (Recombinase Activating Gene) SP : thymocyte mature Simple Positif (TCR-CD3 + CD4 + ou TCR-CD3 + CD8 + ) SVF : Sérum de Veau Fœtal TCR : récepteur pour l antigène des cellules T (T Cell Receptor) TCR-Tg : souris transgénique pour le récepteur T aux antigènes Immunité : Le système immunitaire des vertébrés est composé de deux types d immunité, l une est dite innée et l autre acquise ou adaptative. La réponse immunitaire chez les vertébrés se déroule en deux phases distinctes et complémentaires correspondant aux deux types d immunité. Tout d abord la réponse précoce, rapide et peu spécifique de l immunité innée intervient dans les premières heures de l infection. L immunité adaptative plus spécifique, tardive et durable vient compléter cette défense, et constituer la mémoire immunologique [1] EPHE Banque de Monographies SVT 5

6 Immunité Adaptative et innée L immunité innée constitue la première ligne de défense de l organisme. La peau, le ph et la kératine constituent la barrière physique et chimique de cette défense [2]. Le complément et les peptides anti-microbiens en sont les molécules, et les acteurs cellulaires sont les cellules lymphoïdes «Natural Killer» ainsi que les cellules myéloïdes macrophagiques, les mastocytes, basophiles, neutrophiles et granulocytes. Les cellules NK possèdent des récepteurs activateurs et inhibiteurs permettant de répondre aux divers motifs protéiques bactériens, viraux ou parasitaires [3]. Elles peuvent également remarquer l absence de molécules du «soi» du Complexe Majeur d Histocompatibilité (CMH) de classe I [4]. Ces reconnaissances entre les récepteurs et leurs ligands sont peu spécifiques. L immunité adaptative est propre aux vertébrés, plus particulièrement aux mammifères et a été acquise plus tardivement au cours de l évolution, en même temps que les organes lymphoïdes secondaires [5]. La barrière physique de cette immunité est constituée par les anticorps exportés à la surface des épithéliums ainsi que par les lymphocytes intra-épithéliaux. Les anticorps circulants ainsi que les cytokines effectrices telles que le TNFa et l IFNg sont à l œuvre ; les cellules T, B et Cellules Présentatrices d Antigènes ou «CPA» en sont les acteurs cellulaires. Les cellules T sont d origine thymique (T = Thymus) et les cellules B sont générées dans la moelle osseuse (B = Bone marrow). Les Cellules présentatrices d Antigènes professionnelles sont les cellules dendritiques, qui captent les antigènes, les transportent jusque dans les organes lymphoïdes secondaires et les présentent aux lymphocytes T. Les CPA professionnelles sont représentées par les cellules dendritiques. Cette immunité se caractérise par l acquisition d une mémoire spécifique d antigènes, de haute affinité. Cette immunité acquise permet une protection spécifique à long terme, c est la mémoire immunologique [1]. Rôle des lymphocytes T Les lymphocytes T, acteurs principaux de l immunité acquise, ont pour rôle de protéger l individu contre toute perturbation liée à l intrusion de pathogènes dangereux pour celui-ci. Ils permettent de générer et maintenir la mémoire immunologique, spécifique d antigènes. L initiation et le développement de l immunité acquise requièrent la capture des antigènes par les Cellules dendritiques, leur apprêtage puis leur présentation par les molécules du CMH de classe I et II, aux cellules T CD8 et CD4 respectivement. Les Lymphocytes T ab Les lymphocytes T présentent à leur surface des récepteurs dits «TCR» = T Cell Receptor, ayant la capacité de reconnaître spécifiquement des motifs peptidiques associés aux molécules du CMH, présentés par les CPA. Il existe deux types de lymphocytes T, les T ab et les T gd. Nous nous intéresserons aux lymphocytes T ab qui constituent la population majoritaire T et les acteurs principaux de l immunité adaptative. Les lymphocytes T ab, CD4 et CD8 Les lymphocytes T ab de l immunité adaptative ont été définis en deux sous-populations majeures, en fonction de l expression de leurs corécepteurs CD4 et CD8, ces deux types de cellules T pouvant être définis par leurs principales fonctions respectives. Schématiquement, les CD4 sont les lymphocytes auxiliaires (helper), et les lymphocytes CD8 cytotoxiques (CTL). Les lymphocytes auxiliaires ont la capacité de s activer, de générer des cellules mémoires et de faire coopérer entre elles et par elles toutes les cellules de l immunité acquise. Elles sécrètent de nombreuses cytokines, médiateurs cellulaires permettant une action locale et à courte distance sur les cellules environnantes. Ces lymphocytes jouent un rôle central dans le système de défense adaptatif. Leur absence peut créer de graves dérèglements et immunodéficiences fatales pour l organisme, comme dans la maladie humaine du SIDA. Les lymphocytes CD8 cytotoxiques ont la capacité de détruire par sécrétion de molécules, telles que la perforine et les granzymes, les cellules ou microorganismes étrangers. Elles génèrent également des cellules mémoires, mais ne produisent que peu de cytokines comparativement aux cellules CD4. Ces deux molécules, CD4 et CD8, sont des corécepteurs essentiels pour les lymphocytes T. La différenciation thymique des lymphocytes T en l absence de ces molécules est perturbée (), leurs fonctions dans l activation sont aussi EPHE Banque de Monographies SVT 6

7 primordiales. CD4 et CD8 participent dans les événements précoces de transduction du signal après reconnaissance du complexe CMH-peptide par le TCR [6]. Outre ces deux corécepteurs qui jouent un rôle primordial à la fois lors du développement et enfin pendant la réponse immunitaire, une multitude de molécules de co-stimulation interviennent aussi dans l activation cellulaire T, telles les molécules thy1,1, CD28, CTLA-4, ou des molécules dites accessoires telles CD2, CD45.. D autre part, la molécule CD3, dont les sous-unités sont associées au TCR, permet de transduire efficacement et finement le signal du récepteur T vers les cascades enzymatiques intracellulaires. Les lymphocytes T ab naïfs, mémoires et activés Une cellule T naïve est une petite cellule quiescente ; elle exprime faiblement le récepteur aux hyaluronates CD44 [7], fortement la forme de haut poids moléculaire de la phosphatase CD45RB [8] chez la souris et la L-selectine CD62L [7] impliquée dans sa recirculation. Ce récepteur CD62L permet aux lymphocytes naïfs de pénétrer spécifiquement via des cellules épithéliales (High Endothelium Venule) dans les ganglions périphériques, sans avoir été activés. Lors du contact avec l antigène, la cellule entre dans une phase d activation et présente de nombreux changements phénotypiques et morphologiques. L intensité d expression de CD69 (marqueur d activation précoce) puis de CD44 est augmentée. L expression de nombreuses intégrines comme LFA-1 et de L-selectine diminue, tout comme celle de la molécule CD45RB. Une cellule effectrice est une cellule de grande taille en cycle, de phénotype CD44 fort-cd62l faible et qui sécrète des lymphokines ou présente une activité cytotoxique. Une cellule mémoire maintient une forte expression en surface de CD44, qui est considéré comme un marqueur stable des cellules mémoires. Les cellules mémoires seraient en partie en cycle[9], bien que des données contradictoires aient été rapportées [10], plus précisément, les cellules mémoires acquièrent au cours du temps une capacité d auto renouvellement, et de réponse immunologique plus rapide [11]. Alors que la distinction phénotypique entre une cellule T naïve et une cellule T effectrice mémoire est claire, celle qui différencie une cellule effectrice d une mémoire est plus difficile. Plus précisément, chez l homme les cellules T mémoires ont été subdivisées en fonction de l expression du récepteur aux chémiokines CCR7 et du récepteur CD62l [12]. Les lymphocytes T mémoires humains CCR7-, dits TEM (T Effector Memory), expriment des récepteurs leur permettant de migrer vers les sites d inflammation. Ces TEM peuvent activer ainsi leurs fonctions effectrices immédiatement. Une autre population de cellules T mémoires CCR7+, dite TCM (T Central Memory) reste dans le circuit lymphatique. Ces TCM n ont pas de fonctions effectrices immédiates, mais ont la capacité de stimuler les cellules dendritiques et de se différencier en cellules TEM. Ces populations TCM et TEM ont également été retrouvées chez la souris, mais elles ne représentent pas forcément deux populations distinctes, elles feraient partie d un processus de différenciation linéaire au cours duquel toutes les populations sont représentées [13]. Les cellules mémoires dérivent de précurseurs naïfs, mais les modalités de leur génération restent à définir. Chez la souris, deux hypothèses sont avancées, l une suppose que la génération des cellules mémoires est linéaire, une cellule mémoire est générée après activation d un lymphocyte naïf. L autre privilégie une progression non linéaire, les cellules mémoires pouvant être générées directement à partir d une cellule naïve ou d une cellule activée [14]. Développement des lymphocytes T: Le thymus Organe lymphoïde principal, le thymus est le siège de la production des lymphocytes T pendant toute la vie[15]. Le microenvironnement cellulaire spécialisé du thymus permet le développement des lymphocytes T. Les premières évidences du rôle central du thymus dans la génération des lymphocytes T matures ont été observées grâce à des expériences de thymectomie néo-natale chez la souris [16]. De même, les souris nude présentent un défaut génétique naturel dans la formation thymique, ne permettant pas de générer des lymphocytes T ab fonctionnels [17]. Les précurseurs T Le thymus est colonisé par des progéniteurs dérivant de cellules dites cellules souches. Ces cellules souches, ou CSH, ont été identifiées en 1951 [18] et possèdent plusieurs caractéristiques. Ces cellules sont pluripotentes et donc EPHE Banque de Monographies SVT 7

8 capables de générer la plupart des cellules sanguines comme les lignées lymphoïdes, myéloïdes, mégacaryocytaires et érythroïdes. Elles ont également la capacité d autorenouvellement, permettant de maintenir un niveau stable de production des cellules sanguines au cours de la vie. Le maintien de l expression de la télomèrase dans les CSH est une des raisons de cette caractéristique d auto renouvellement [19]. Les cellules colonisant le thymus peuvent être plus ou moins engagées dans la lignée lymphoïde. Les lymphocytes T, B et NK ont d abord été définis comme provenant d un Progéniteur Lymphoïde Commun (PLC) [20], mais des données plus récentes remettent en cause ces premières données. Le PLC a été mis en évidence dans la moelle osseuse de souris, il est pluripotent et restreint aux lymphocytes T, B et NK, comme cela a été démontré in vivo [21] Il reste à définir les événements et les lieux permettant aux PLC de se différencier en lymphocytes T, l environnement thymique étant favorable à cet engagement [22]. Cependant des études semblent indiquer qu il est possible de retrouver des pro thymocytes dans le sang fœtal [23] ou dans la rate [24] ainsi que dans les ganglions de souris nude [25], suggérant ainsi que les PLC peuvent se différencier en pro thymocytes en dehors du thymus. Deux lignées lymphocytaires matures T ont été identifiés, les T ab et T gd, caractérisées par l expression de leur récepteur T (TCR). La lignée ab constitue celle qui nécessite la présentation de peptides antigéniques par les molécules du complexe majeur d histocompatibilité (CMH), alors que quelques gd semblent capables de reconnaissance antigénique en dehors de toute présentation par le CMH [26] Développement T ab Du stade Double Négatif au stade Double Positif Le développement des précurseurs de cellules T ab dans le thymus se déroule en plusieurs étapes identifiables par l expression de certaines molécules de surface (CD). A chaque stade du développement les cellules T expriment un panel variable de marqueurs de surfaces, permettant l identification phénotypique de chacune des étapes. Le thymocyte le plus immature n exprime pas de corécepteur CD4 ou CD8, et est alors identifié comme une cellule double négative (DN). Au stade précédent, la cellule est également négative pour le complexe du corécepteur CD3 et du récepteur TCR, et est appelée triple négative (TN). Analyse cytométrique et représentation schématique des populations thymiques d une souris sauvage C57Bl6. Les étapes successives de développement des cellules DN sont représentées par l acquisition et la disparition séquentielle des marqueurs de surface CD44 et CD25. Quatre étapes sont ainsi identifiées, DN1, 2,3 et 4. EPHE Banque de Monographies SVT 8

9 Seulement 20% de ces cellules DN se différencient en cellules T gd, alors que le reste s engage vers la différenciation T ab. Le premier stade DN1 se caractérise par l expression unique du marqueur CD44. La déficience génétique pour la molécule c-kit ou le scf (stem cell factor) induit une réduction du nombre de cellules DN1 de l ordre de 40 fois par rapport à un thymus normal [27]. Cette réduction peut être due à un défaut de colonisation thymique, ou de prolifération et de survie des thymocytes[28]. La transition du stade DN1 à DN2 (CD44 CD25) s accompagne d une intense prolifération. Les souris invalidées pour l IL7 ont permis de supposer que cette cytokine est nécessaire et impliquée fortement, à ce stade de développement, dans la régulation de l expansion thymique[29]. Les souris invalidées pour l interleukine 7, le récepteur à l interleukine IL7Ra[30, 31] et le gène du récepteur gc commun aux interleukines[32] présentent des défauts de développement lymphocytaire à ce stade précis. Mais ces anomalies peuvent êtres dues à un défaut de survie et de prolifération des thymocytes. Enfin, quelques lymphocytes Tab peuvent poursuivrent leur développement, alors que celui des gd est totalement abrogé [33]. L utilisation de souris invalidées (Knock Out) a permis de décrypter les événements de maturation, des DN3 aux lymphocytes pré T. Durant cette transition, les gènes g, d et b du récepteur T sont réarrangés, et les cellules sont engagées définitivement vers la lignée T. En même temps que le réarrangement productif de la chaîne b est effectué à la surface des lymphocytes, la chaîne pré-ta est associée au complexe CD3 pour former le pré récepteur T, permettant ainsi la transduction du signal [34]. L émergence du complexe pré récepteur T donne le signal pour l expansion rapide et l expression des corécepteurs CD4 et CD8, et les thymocytes deviennent Double Positifs, DP. La progression vers le stade DP est dépendante de l activité de deux enzymes responsables du réarrangement des immunoglobulines, RAG1 et RAG2 [35, 36] Du stade Double Positif au stade Simple Positif Les kinases intracellulaires jouent un rôle dans la transduction du signal durant la différenciation des thymocytes DP vers la maturation en simples positifs. Les souris déficientes pour des kinases de la famille des syk et ZAP-70, montrent un blocage de la différenciation des DP, avec absence de cellules matures SP [37]. La chaîne a du récepteur T est exprimée à ce stade de développement. Le réarrangement des chaînes a et b du TCR Le TCR et l association de ses chaînes a b sont les récepteurs essentiels qui permettent aux lymphocytes T d agir spécifiquement contre la multitude et la diversité des pathogènes rencontrés. La multitude d antigènes présentés ne peut être contrôlée que par un ensemble de cellules T composé par un grand nombre de clones exprimant chacun un TCR précis. La diversité du répertoire des récepteurs T n est pas due à un grand nombre de gènes codant pour un TCR, mais à la combinaison de plusieurs segments de gènes. Les récepteurs T sont composés de deux chaînes protéiques, l une dite bêta (b) et l autre alpha (a). Ces deux chaînes sont constituées de parties intra cytoplasmiques permettant la transduction de signaux, de portions extracellulaires constituées de régions Constantes (C), Jonctionnelles (J), Diverses (D) pour la chaîne b, Variables et Hypervariables (V). Ces deux dernières régions variables et hypervariables sont la clé de la spécificité antigénique ou peptidique. Le réarrangement des segments de gène codant pour les chaînes a et b du TCR a lieu au niveau somatique, dans un ordre précis [38]. Les réarrangements du locus du TCRb ont lieu avant celui du TCRa [39], le TCRb étant réarrangé au stade DN3, et le TCRa au stade DP et SP. Les réactions de recombinaison sont assurées par un complexe enzymatique, le RSS, dont les séquences sont localisées autour des segments de gène V, D et J, codant pour les chaînes a et b du TCR[40]. La réaction est initiée par deux enzymes RAG1 et RAG2 (recombinase activating gene), exclusivement exprimées dans les cellules lymphoïdes. Chez les souris déficientes pour l expression de RAG1 et RAG2, le développement lymphocytaire est bloqué au stade DN2 [35, 36]. EPHE Banque de Monographies SVT 9

10 Représentation schématique du développement T : La diversité additionnelle Aux réarrangements s ajoutent d autres phénomènes permettant d augmenter drastiquement la diversité des TCR dans un individu. En premier, lieu le processus de recombinaison permet de générer une diversité additionnelle ; les étapes de jonction des segments pour les chaînes a et b étant lâches quant à la position exacte de la jonction de recombinaison, elles permettent l induction de glissement dans la séquence (nucléotides P). Enfin, la jonction parfois indirecte entre les segments et la recombinaison induit l ajout de nucléotides entre les segments. Ce mécanisme a été défini comme étant la N-addition, dont l enzyme TdT (Terminal deoxynucleotide Transferase) est responsable. La souris déficiente TdT montre après analyse du répertoire T que cette enzyme contribue à 90 % à la diversité des TCR ab [41] L appariement des chaînes a et b contribue aussi à augmenter la diversité du répertoire des TCR. Le domaine hypervariable des chaînes a et b est une région de haute diversité nommée CDR3 (Complementary Determining Region 3), située au niveau des jonctions de gènes [42]. Des études structurales ont permis de montrer que la région CDR3 joue un rôle déterminant dans l interaction entre le TCR et le complexe formé par les peptides antigéniques et les molécules du CMH [43]. Exclusion allélique Les thymocytes sont sous le contrôle d un mécanisme qui évite de mettre en place plusieurs réarrangements simultanés des gènes codant pour la chaîne b du TCR, évitant la production de deux chaînes b distinctes à la surface d une cellule [44]. Cependant, on trouve environ 1% de lymphocytes T exprimant deux chaînes b [45] L exclusion allélique est abolie dans les souris déficientes pour des protéines impliquées au niveau du complexe TCR (CD3e, p56lck) ou pour des protéines adaptatrices comme SLP-76. Mais les voies de signalisation impliquées dans la prolifération et la maturation des lymphocytes T sont distinctes de celles impliquées dans l exclusion allélique [46]. Inclusion allélique Contrairement à la chaîne b, il est courant de voir exprimées deux chaînes a à la surface d une cellule [47] [48, 49]. EPHE Banque de Monographies SVT 10

11 Les lymphocytes T ont les deux allèles de la chaîne a réarrangés et 30% de ceux-ci ont deux réarrangements en phase ouverte de lecture [50]. Ce phénomène est l inclusion allélique. Mais l exclusion allélique peut aussi avoir lieu, un thymocyte avec deux réarrangements productifs peut au final n exprimer qu une seule chaîne a, la compétition lors de l association avec la chaîne b et les contraintes structurales jouant ce rôle d exclusion [51, 52]. Sélection positive et négative Les thymocytes doubles positifs réarrangent activement la chaîne a du TCR et expriment de faibles niveaux d hétérodimères du TCR ab, qui interagissent avec les complexes CMH-peptides présents sur l épithélium thymique. A ce stade, 90% des cellules meurent par apoptose, en absence de signaux leur permettant de poursuivre leur différenciation [53]. Les thymocytes qui ne peuvent interagir avec les molécules du CMH meurent par négligence. Ceux dont l interaction avec le CMH est trop forte meurent par sélection négative. Cette sélection négative est essentielle pour le maintien de la tolérance au soi. Ainsi, au cours de la maturation thymique du stade DP TCR low au stade DP TCR high, des lymphocytes T spécifiques de superantigènes exprimés dans le thymus des souris sont tous délétés [54], cette sélection négative ayant pour but d éviter toute réaction immunitaire contre l hôte, origine de certaines maladies auto-immunes. La sélection négative est elle aussi fortement régulée par les signaux et molécules liées à l apoptose. La famille des Bcl-2 joue un rôle central, via Bcl - 2, bax, bad et bim. Toutes ces molécules pro ou anti apoptotiques peuvent induire in vitro et in vivo la mort ou la survie des thymocytes DN, DP et SP.[55-57]. La sélection positive permet de sélectionner les thymocytes capables de reconnaître les molécules du CMH adéquates, et de générer une signalisation intracellulaire adaptée. En périphérie, les lymphocytes T matures sont ainsi capables de reconnaître de façon optimale les molécules du CMH et de l antigène apprêté [58]. Cette sélection a également été mise en évidence dans des expériences de reconstitution hématopoïétique [59]. Avec ces expériences, il a notamment été démontré que la classe des molécules du CMH à laquelle le TCR est restreint influence le choix de la différenciation des cellules DP en simples positifs CD4 ou CD8. Les souris ZAP-70 et Syk déficientes ont un blocage complet au stade DN3 [60]. La molécule Lck est importante également dans la sélection positive des DP [61]. De plus, la déficience en CD45, une tyrosine phosphatase régulatrice de l activité des kinases src, montre un arrêt de la différenciation au stade DP [62]. Ces derniers exemples permettent de démontrer le rôle du TCR et surtout des molécules impliquées dans la transduction du signal, au cours de ces sélections thymiques. Différenciation CD4 ou CD8 La nature du mécanisme incitant les lymphocytes DP à se différencier en CD4 ou en CD8 est encore non établi. Deux modèles ont été proposés : le modèle stochastique (indépendant du lien TCR-CMH) et le modèle instructionniste (dépendant des interactions TCR-CMH). Pour le modèle instructionniste, les parties intra-cytoplasmiques des corécepteurs CD4 et CD8 sont impliquées dans le choix de l engagement [63] Le modèle stochastique suggère que le choix dans la suppression des gènes codant pour CD4 ou CD8 n est pas déterminé par la restriction du TCR aux molécules du CMH lors de la sélection positive [64, 65]. Plusieurs cascades moléculaires décrites pour l engagement et la différenciation de lignées cellulaires dans d autres systèmes expérimentaux, comme la drosophile ou la xénope, semblent jouer le même rôle dans la différenciation T [66]. Des expériences récentes ont impliqué la cascade des molécules Notch dans la différenciation des lignées T ab et gd, ainsi que la différenciation CD4 et CD8. La molécule TSLP, un facteur thymique dont le récepteur est associé au récepteur a de l interleukine 7, a également été impliquée dans le développement thymique T, et plus précisément dans la différenciation des CD4 SP [67]. Plus récemment, le facteur de transcription ckrox a été identifié comme acteur important de la différenciation vers la lignée CD4 SP [68] [69] Export thymique Le rôle du thymus est, entre autres, d assurer un niveau constant de lymphocytes T périphériques. Il a été établi que l export de lymphocytes T thymiques en périphérie permet le remplacement des T naïfs périphériques sans EPHE Banque de Monographies SVT 11

12 modifications du compartiment des cellules T mémoires [70]. Quelques facteurs de transcription ont été identifiés comme ayant un rôle dans la survie des lymphocytes récemment exportés du thymus, la molécule «Krüpper like zinc finger» ou LKLF en est un exemple [71], MCl 1, facteur directement lié à l expression de la molécule Bim de la famille des Bcl-2 en est un autre exemple (2003 nature), ainsi que NFAT4 [72]. D autres molécules, comme par exemple l hormone de croissance GH, jouent un rôle important dans cet export thymique, plus particulièrement en favorisant l implantation des CD4 récemment produits par le thymus, dans les ganglions périphériques [73]. Homéostasie Les mécanismes homéostatiques permettent que le nombre de cellules composant le système immunitaire soit stable, et qu ils corrigent toutes perturbations de cet état par un retour à l équilibre [74-77] Le nombre de lymphocytes étant constant, cela implique que pour chaque thymocyte exporté meure un lymphocyte périphérique. Les mécanismes de régulation montrent que l organisme possède la capacité de mesurer le niveau de remplissage du compartiment lymphocytaire et de contrôler la production ou la répression des molécules et cellules impliquées dans ces phénomènes. Homéostasie lymphocytaire : L homéostasie des lymphocytes est le processus actif qui permet de conserver à un état stable le nombre de cellules B, T, NK-T et NK soumises aux limites d espace de l organisme et de ressources disponibles [70, 74-76]. Ce processus implique des mécanismes de régulation qui permettent de maintenir les populations lymphoïdes à des niveaux optimums afin de favoriser à tout moment le déclenchement d une réponse immunitaire efficace contre n importe quel antigène puis le retour à un équilibre après perturbation. Elle permet également de prévenir tout type d immunodéficience, par le maintien des populations T naïves et mémoires. Homéostasie des lymphocytes T : L homéostasie du groupe de cellules T est contrôlée à plusieurs niveaux et dépend de l équilibre entre la production thymique et la survie, la prolifération et l apoptose des cellules déjà présentes en périphérie [74]. La difficulté majeure est de pouvoir dissocier la survie lymphocytaire de la prolifération homéostatique, les deux phénomènes étant étroitement liés par le partage de facteurs communs, les interactions du TCR, les cytokines et la transduction du signal via les récepteurs. De même, les cascades enzymatiques, les molécules de l apoptose et les facteurs de transcription interviennent à la fois dans le développement thymique, la survie périphérique et la prolifération homéostatique. Les signaux spécifiques qui régulent l homéostasie des cellules T sont différents selon les sous-populations de lymphocytes T concernées et selon l état de différenciation et d activation cellulaire. Certaines études montrent que les cellules T naïves et mémoires activées n appartiennent pas à la même «niche écologique», la taille de chaque compartiment étant régulée de manière indépendante [70]. Les lymphocytes naïfs, effecteurs et mémoires ont apparemment une durée de vie hétérogène et des besoins différents en ressources pour leur maintien en périphérie. Une des probables conséquences de ces deux aspects est que la proportion de chacune de ces populations varie avec l âge, le statut environnemental et l histoire infectieuse de l individu. Par exemple, des individus jeunes ont une prédominance de cellules naïves, alors que les cellules mémoires s accumulent avec l âge [78]. Événements majeurs liés à l homéostasie L homéostasie lymphocytaire est nécessaire pour maintenir et assurer une réponse immunitaire spécifique d antigènes. Elle permet au système immunitaire de réguler à la fin d une réponse immune le nombre de lymphocytes. C est la EPHE Banque de Monographies SVT 12

13 phase dite de contraction, ou du déclin de la réponse immune. Cette régulation permettant l élimination de la quasi-totalité des cellules produites au cours de la réponse immune se fait par un phénomène de mort cellulaire, tout comme le développement des thymocytes régulé par apoptose, excluant 95% des thymocytes lors de la sélection thymique. L homéostasie du système immunitaire est dépendante de plusieurs événements : a) La génération thymique de cellules matures naïves b) La réponse immune et les conséquences sur le compartiment des cellules mémoires et activées c) La capacité des cellules T à proliférer pour repeupler un compartiment lymphocytaire déficient d) Les capacités de survie de chacune des populations matures e) La compétition des cellules entre elles pour les ressources disponibles, partagées et en quantités limitées. La combinaison des signaux via le TCR et les récepteurs à cytokines ainsi que des facteurs de transcriptions et des molécules de la famille des Bcl-2 semble être le moteur essentiel de ces mécanismes. Dérégulation homéostatique Dans des conditions particulières, l homéostasie est fortement altérée, avec une impossibilité de maintenir l organisme au niveau stable de référence. Cette modification de l équilibre permet à l organisme de s adapter à la contrainte du moment pour survivre au mieux. Comme exemple expérimental on peut citer le cas de greffes thymiques en surnombre sur des souris, augmentant le nombre de lymphocytes T périphériques de façon drastique, sous l influence de la surproduction thymique [79]. Le cas humain du SIDA est un exemple de dérégulation de l homéostasie du système immunitaire, la disparition des CD4 sous l action du virus HIV est une rupture de cet équilibre. Une restauration partielle peut être induite après traitement rétroviral, permettant à l homéostasie de reprendre le contrôle après perturbation [80]. Autre exemple, dans le cas de la grippe ou de la rougeole, il a été décrit une délétion massive et à long terme des lymphocytes T [81]. Dans certains modèles murins, le nombre incontrôlé et excessif de cellules T peut entraîner la mort, c est le cas des souris invalidées pour le récepteur a de l interleukine 2, noté IL 2Ra -/- [82]. Apoptose : L Apoptose est un processus hautement régulé permettant aux cellules eucaryotes de déclencher leur mort [83-86]. Le suicide cellulaire et la mort cellulaire programmée sont les autres termes synonymes de l apoptose. Cette mort cellulaire est distinguable de la nécrose, mort cellulaire différente par de nombreux aspects morphologiques et biochimiques [87, 88]. Après condensation et fragmentation du noyau, la membrane plasmique forme des vésicules qui se détachent sans se fragmenter, et les cellules ainsi que leur contenu sont rapidement phagocytés. L apoptose est un processus actif qui requiert de l énergie pour maintenir une activité catabolique, et de signalisation pour les cascades enzymatiques. Pour la nécrose, la membrane est fragmentée et entraîne une réaction inflammatoire locale. Dans le cas de la nécrose, la mort est liée à une incapacité d utilisation et de maintien de cette énergie, qui aurait permis de réguler l activité des voies de signalisation des cascades enzymatiques. L apoptose est la forme dominante de mort cellulaire physiologique, et fait partie du développement des organismes et de leur adaptation à l environnement [89, 90]. De plus, une de nombreuses maladies, dont les cancers, les maladies auto-immunes et neuro-dégénératives, sont en grande partie une conséquence de la dérégulation de l apoptose. Une grande variété de stimulus naturel peut déclencher l apoptose cellulaire, les interactions récepteurs/ligands [91], l action de facteurs de croissances [92], les dommages de l ADN [93] et l hypoxie [94]. Alors que les signaux initiateurs peuvent être différents, les événements induits sont similaires et partagent des caractéristiques intracellulaires, effectrices et régulatrices : 1) Les Caspases, une famille de protéases qui coupent les résidus aspartiques sont les clés activatrices de l apoptose [95]. EPHE Banque de Monographies SVT 13

14 2) Les mitochondries jouent un rôle central dans l apoptose et sont responsables du largage de facteurs qui induisent l apoptose, comme le cytochrome c [96] [97]. 3) Un composant de la bicouche lipidique, le phosphatidyl sérine, est externalisé précocément dans la plupart des processus apoptotiques [98]. 4) L ADN est tardivement fragmenté [99] par des endonucléases (environ 200 paires de bases), mais cela ne semble pas être toujours le cas [100]. Enfin, les membres de la famille des BCl-2 semblent êtres les régulateurs universels de l apoptose des cellules eucaryotes [101]. Compétition Le maintien du système immunitaire à l équilibre dans un environnement où l espace et les ressources sont limités, et malgré une production thymique quotidienne, fait penser qu un mécanisme de compétition intercellulaire doit exister. La compétition entre lymphocytes a été mise en évidence pour les lymphocytes B et les lymphocytes T [102, 103], elle repose sur deux éléments principaux : 1) La présence d une population compétitrice doit modifier la taille à l équilibre d une autre population. 2) La compétition doit modifier la durée de vie de cette population L accessibilité des cellules T aux CPA ou la disponibilité à l interleukine 7 seraient les éléments clés de cette compétition [104]. Cette dynamique de génération et de maintien d un répertoire large et variable de lymphocytes dans le système immunitaire a été nommé «écosystème immunitaire» [74]. Survie Notion : Estimer la durée de vie des lymphocytes est difficile à entreprendre. Ces dernières années, de nombreuses études ont tenté de répondre à cette notion. La diversité des réponses est liée tout d abord à la définition propre de cette notion, et ensuite aux différentes méthodes et approches expérimentales utilisées. Plusieurs concepts ont été développés la population des cellules T serait un mélange de cellules à courte et longue durée de vie, allant de 2 à 3 jours jusque8 semaines [105, 106] [107], ces études utilisant des cellules T d origines différentes (transgéniques et sauvages), et des souris receveuses différentes pour les transferts (lymphopéniques, alymphoïdes). Le problème majeur soulevé par ces études utilisant des modèles expérimentaux hétérogènes est qu ils ne permettent pas de dissocier parfaitement la survie des lymphocytes de leur prolifération homéostatique. Cependant, certains facteurs ou ressources permettant la survie des lymphocytes ont été identifiés. Interaction CMH-TCR : Parce que les lymphocytes T naïfs meurent rapidement in vitro, les facteurs de survie et les signaux impliqués dans leur survie in vivo ont fréquemment été étudiés. Dans certaines expériences, les molécules du CMH apparaissent importantes. Par exemple, les T CD4 récemment exportés du thymus ne peuvent pas efficacement repeupler les organes périphériques d une souris n exprimant les molécules de CMH de classe II que dans le thymus [108, 109]. Pour les CD8, des lymphocytes T transgéniques naïfs disparaissent en quelques jours, après transfert dans des souris déficientes en molécules du CMH I [110]. D autre part, les lymphocytes T naïfs CD4 ou CD8 meurent si les récepteurs T sont génétiquement éliminés [111, 112]. Dans d autres études les molécules du CMH n apparaissent pas essentiels à certains aspects de leur survie. Deux d entre elles montrent que des T CD4 transférés dans des hôtes non irradiés mais dépourvus de molécules de CMH II survivent parfaitement [113, 114]. Trois aspects ont contribué à une absence de cohérence entre ces différentes études. La première est due à la prolifération des lymphocytes naïfs dans des hôtes dépourvus de populations T [115] conduisant à une différence importante EPHE Banque de Monographies SVT 14

15 en terme de nombre absolu de cellules récupérées dans la rate des souris CMH+ et CMH- après transfert. Cette différence peut être due à l effet de la prolifération plutôt que de la survie. Ensuite, parce que les cellules T transférées peuvent être rejetées par les cellules NK et CTL des hôtes, leur disparition dans des hôtes allogéniques ou MHC déficients peut être due au rejet plutôt qu à l absence de signaux de survie via le CMH [116]. De plus, l origine des cellules T transférées transgéniques ou sauvages peut avoir des impacts différents sur la survie observée, sachant que l allo-réactivité due à la présence d antigènes mineurs et majeurs du CMH sur les cellules de l hôte peut induire les signaux de mort ou de prolifération sur les cellules T transférés. Enfin, alors que dans certaines études [113], mais pas dans d autres [114] [117], il a été tenté de dépléter les cellules mémoires, cette déplétion n étant pas complète, on ne peut exclure l éventualité d un effet»compétitif» des cellules mémoires avec les T naïfs (figure 25). Enfin, pour les cellules T mémoires, les interactions dues aux molécules de restriction n apparaissent pas indispensables pour leur survie [75, 118, 119]. Cytokines : Les premières évidences décrivant les cytokines comme facteurs de survie des cellules naïves viennent des découvertes faites in vitro et démontre que, pour préserver ces cellules en culture, il faut nécessairement les IL4, 6 et 7 [120]. La première étude qui a démontré in vivo le rôle vital de l IL7 a été réalisée par l équipe du Dr Bottomly. Des souris thymectomisées et injectées avec des anticorps anti-il7 montrent une profonde déplétion en cellules naïves, mais pas en cellules mémoires, et plus spécialement dans des souris invalidées pour l IL4 [121]. Plus récemment, le transfert de lymphocytes naïfs dans des souris invalidées pour l interleukine 7 [118] a montré que le temps de survie des lymphocytes naïfs était drastiquement diminué (en quelques semaines). Il en est de même pour le transfert de lymphocytes T CD4 transgéniques et déficients pour la chaîne gc commune, dans des hôtes alymphoïdes montrant une survie inférieure à cinq jours [122]. De façon contraire, il a été réalisé des transferts de cellules T naïves dans des hôtes transgéniques pour l interleukine7, l augmentation de cette cytokine permettant d augmenter significativement le nombre de cellules naïves en périphérie [123]. Pour les CD4 mémoires, il a été démontré l indépendance de ces cellules pour leur survie, aux cytokines partageant le récepteur commun gc [122]. Au contraire, pour les CD8 mémoires, l IL-7 ou l IL-15 permettent leur survie [75, 118, 119]. Molécules de la famille des Bcl-2 : Les facteurs trophiques (cytokines, hormones, etc..) sont connus pour induire la synthèse des molécules de la famille des Bcl-2 [101]. Les protéines de cette famille contiennent entre une et quatre régions distinctes d homologie, les domaines BH [124] ; les membres peuvent être divisés en deux groupes distincts, selon leur fonction : les anti-apoptotiques et les proapoptotiques. Pour les anti-apoptotiques, deux d entre eux ont été identifiés comme ayant un rôle dans la survie et la persistance des lymphocytes T et B, la molécule Bcl-2 et la molécule MCl1 [125, 126], tandis que Bcl-Xl aurait un rôle restreint aux cellules érythroïdes [127] Les molécules pro-apoptotiques contiennent entre deux et trois domaines BH, ce sont les molécules BAX, BAK, BCL-Xs et BIM, leur expression protéique entraînant l apoptose cellulaire [128]. Ces molécules se fixent, entre autre sur la molécule Bcl-2 pour induire l absence de survie, leur conférant un rôle apoptotique sur la plupart des lignées cellulaires. Comme pour le développement T, les cellules matures T dépendent pour leur survie de l interaction TCR-CMH et de l interleukine 7, les deux récepteurs, TCR et IL7Ra, permettant une signalisation intracellulaire conduisant à la production de la molécule Bcl-2, induisant la survie de ces cellules. EPHE Banque de Monographies SVT 15

16 Prolifération homéostatique Notion et définition : La prolifération homéostatique pourrait être définie comme la tendance d une population de cellules T à proliférer lorsqu elle se trouve dans un environnement lymphopénique ou alymphoïde, jusqu à atteindre un plateau défini par l homéostasie et par la nature des cellules considérées. Les premières expériences de thymectomie néonatale ont permis de démontrer que le niveau de remplissage du compartiment T dans les organes périphériques se maintenait en l absence de toute production thymique [129]. Les cellules T sont capables de persister en périphérie [106], et de proliférer après transfert dans une souris irradiée ou génétiquement déficiente en lymphocytes T [130, 131]. Cette prolifération est limitée par l espace, les ressources disponibles et les cellules compétitrices en présence). Comme pour la survie, la notion de compétition cellulaire est également à l œuvre pour les événements de prolifération homéostatique. La faculté de division cellulaire T est liée à l expression de la télomérase par les lymphocytes T pendant la phase d expansion [132]. Dans des conditions normales, la plupart des cellules T périphériques sont quiescentes (phase de cycle cellulaire G1) et seulement une fraction mineure de cellules T mémoires sont en division [9, 133]. Interactions TCR-CMH : La dépendance de la prolifération homéostatique vis-à-vis de l interaction TCR-CMH est, comme pour la survie, sujette à discussion. Pour certains, la prolifération homéostatique semble dépendante de l expression des molécules du CMH [134, 135] auxquels ces cellules sont restreintes. Par conséquent, il apparaît que la prolifération homéostatique est fortement dépendante de l interaction de faible affinité [136] entre le TCR et les complexes pag-cmh du soi, en l absence de l antigène. Pour d autres, il a été montré que des T CD4 naïfs peuvent induire une prolifération homéostatique dans des hôtes déficients pour le CMH II [117, 137]. Enfin, l initiation de la prolifération est indépendante de la présence du CMH adéquat, mais les éléments de restriction aux molécules du CMH sont nécessaires au cours de la prolifération homéostatique pour l acquisition du marqueur d activation CD44 [116]. Une autre série d expériences montre que cette prolifération est indépendante du CMH pour son initiation, mais dépendante pour une prolifération prolongée [138]. Cytokines : En l absence de l interleukine 7, toute prolifération homéostatique est abolie [139]. La façon dont cette prolifération est induite reste inconnue. Le fait que cette prolifération n a pas lieu dans des hôtes dont le compartiment lymphocytaire est normal fait penser que cette prolifération est induite par une augmentation de la disponibilité de l interleukine 7 dans les hôtes immuno-déficients. L IL7 est un costimulateur connu pour amplifier le niveau de signalisation du TCR lors de son contact avec le CMH. Cette idée est cohérente avec l observation faite chez l homme, où la disparition de cellules T est corrélée avec une augmentation de l interleukine 7 [140], ainsi que chez la souris [6]. EPHE Banque de Monographies SVT 16

17 Projet Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l homéostasie d une population de l immunité adaptative, les lymphocytes T CD4+ naïfs. Cette population d origine thymique migre et subsiste préférentiellement dans les organes lymphoïdes secondaires et participe activement à l immunité acquise. Ces cellules constituent une sous-population particulière déjà bien étudiée, les CD4 auxiliaires. Elles ont la capacité de répondre à toutes formes antigéniques via leur récepteur T, de générer des cellules mémoires et de faire coopérer entre elles et par elles toutes les autres cellules de l immunité acquise ou innée. Ces lymphocytes jouent un rôle central dans ce système de défense adaptatif, leur absence pouvant créer de graves dérèglements et immunodéficiences fatales pour l organisme, comme dans la maladie humaine du SIDA. Nous avons étudié la dépendance de ces lymphocytes T CD4 naïfs aux cytokines partageant le récepteur gc, ainsi que la variabilité proliférative des cellules naïves, en fonction de l absence unique ou combinée de ces cytokines. Nous avons pu commencer à décrypter et identifier certains signaux et cascades moléculaires via les récepteurs à cytokines et TCR, impliqués dans la mort ou la survie cellulaire de ces lymphocytes. Nous avons donc utilisé un modèle murin TCR transgénique CD4, dont la spécifité antigénique est connue et l état d activation homogène et maîtrisé. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés également aux lymphocytes CD8 naïfs murins dans différents modèles TCR transgéniques. Modèles d études Source expérimentale de lymphocytes T murins : Pour étudier le comportement et les caractéristiques des lymphocytes CD4 et CD8 murins, l immunologiste de laboratoire dispose de plusieurs outils «vivants». Les souris congéniques sauvages ou «Wild type» de types C57 Bl6 constituent la base murine «normale» de toutes nos expériences. Ces souris sont constituées de tous les éléments lymphocytaires existant chez la souris. L étude spécifique de lymphocytes T CD4 naïfs devient difficile quand cette population se trouve mélangée et immergée au milieu de tous les autres intervenants immunitaires, de même la polyclonalité et la diversité du répertoire lymphocytaire ne permettent pas d observer facilement le devenir d un clone lymphocytaire. Le nombre et l état d activation de ces lymphocytes étant également difficile à homogénéiser dans ce contexte, l utilisation de souris transgéniques pour un TCR donné apparaît comme étant la solution la plus efficace pour ces études, permettant ainsi d étudier un clone monoclonal de lymphocytes T à l état naïf, en nombre suffisant et facilement identifiable. Les souris TCR transgéniques utilisées sont pour les CD4, les mutants «marylin» anti-hy développées par le Dr Lantz, ainsi que ses mutantes «matahari» anti-hy mais CD8+. Pour les CD8, deux autres modèles ont été étudiés, d une part les «HY». et d autre part les «P14 anti-lcmv». Tous les modèles étudiés ici sont également déficients pour le gène de la recombinase active RAG2, gène responsable du réarrangement des immunoglobulines et surtout des chaînes a du récepteur T. Cette déficience RAG2 associée au transgène de ces TCR permet la monoclonalité des cellules T générées, ainsi que leur «naïveté», aucune réaction croisée n étant connu pour ces TCR définis. Modèle de souris receveuses : L étude de la survie et de la prolifération homéostatique des lymphocytes nécessite le transfert adoptif des lymphocytes T dans des hôtes immuno-déficients dont le fond génétique ne diffère pas (C57Bl6). On notera que les souris immuno-déficientes communément utilisées à l heure actuelle, présentent des différences fondamentales dans le degré de lymphopénie, la disponibilité des ressources cytokiniques, la compétition avec d autres cellules lymphoïdes et l interaction avec les cellules épithéliales et dendritiques. Nous utilisons principalement deux types de souris alymphoïdes pour ces expériences, d une part les souris déficientes (knock out) pour le gène Rag 2 de la recombinase active de réarrangement des immunoglobulines, du BCR (B Cell Receptor) et du TCR, souris dépourvues de lymphocytes T et B, et, d autre part des souris doubles déficientes pour le gène Rag 2 et le gène gc du récepteur commun aux interleukines 2, 4, 7, 9, 15 et 21, permettant ainsi d augmenter le EPHE Banque de Monographies SVT 17

18 degré de lymphopénie en excluant les lymphocytes NK résidant dans les souris Rag 2 KO. Le gène gc étant commun (entre autres) aux interleukines 2,4,7 et 15, nous avons également utilisé les souris invalidées pour les ligands et certains récepteurs de celles-ci, pour voir l effet individuel, synergique ou redondant de chacunes de ces interleukines. Les effets constatés et observés sont au niveau de la capacité intrinsèque des populations TCR transgéniques CD4 ou CD8, pour leur survie ou leur capacité proliférative. Bibliographie 1. Gourley, T.S., et al., Generation and maintenance of immunological memory. Semin Immunol, (5): p Degli-Esposti, M.A. and M.J. Smyth, Close encounters of different kinds: dendritic cells and NK cells take centre stage. Nat Rev Immunol, (2): p Kane, K.P., E.T. Silver, and B. Hazes, Specificity and function of activating Ly-49 receptors. Immunol Rev, : p Karre, K., NK cells, MHC class I molecules and the missing self. 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