Albinisme oculo-cutané : un peu de chemin parcouru ensemble.

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1 Albinisme oculo-cutané : un peu de chemin parcouru ensemble. Benoît Arveiler Laboratoire de Génétique Moléculaire, Service de Génétique Médicale CHU de Bordeaux Laboratoire Maladies Rares: Génétique et Métabolisme (EA4576) Université Bordeaux Segalen Assemblée Générale Genespoir mars 2013

2 Tout a commencé en 1998 : patient avec AOC associé à une leucodystrophie. mutation de TYR et d une grande délétion de toute la région 11q14.1. TYR, puis OCA2, puis TYRP1, puis SLC45A4, puis OA1, puis HPS1. Recherche de mutations ponctuelles : changement d une lettre Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 ** * *** * * *** *** ** *** Recherche de remaniements génomiques : environ 10% des mutations Exon 1 Exon 4 Exon 5 X X Chaque patient a deux mutations différentes

3 Délétion Hétérozygote des exons 2 à 20 d OCA2 F9 DSCR1 Peak height Exons Exons Th DSCR1 Fc IX Exon2 Exon3 Exon7 Exon10 Exon15 Exon20 Exon24 Exon25 DSCR ,92 2,76 2,11 2,19 1,60 1,94 1,94 1,02 0,96 Fc IX ,09-3,00 2,29 2,38 1,74 2,11 2,10 1,11 1,05 Exon ,36 0,33-0,76 0,79 0,58 0,70 0,70 0,37 0,35 Exon ,47 0,44 1,31-1,04 0,76 0,92 0,92 0,48 0,46 Exon ,46 0,42 1,26 0,96-0,73 0,89 0,88 0,46 0,44 Exon ,62 0,58 1,72 1,32 1,37-1,21 1,21 0,64 0,60 Exon ,51 0,47 1,42 1,08 1,13 0,82-1,00 0,52 0,50 Exon ,52 0,48 1,43 1,09 1,13 0,83 1,00-0,53 0,50 Exon ,98 0,90 2,71 2,07 2,15 1,57 1,91 1,90-0,95 Exon ,04 0,95 2,86 2,18 2,27 1,66 2,01 2,01 1,06 -

4 15q11-q12 Délétion OCA2/Angelman 5 Mb

5 OCA2 délétion «polonaise» duplication TYR SLC45A2 Exon2 (8 kb) Exon3-5 (340 kb) (145kb)

6 D15S1007 D15S1048 D15S815 D15S1019 OCA-I2 OCA-I17 OCA-I20 OCA-I22 OCA-I24 D15S217 D15S156 D15S219 D15S1002 D15S del del del del del del del del del del 185 / / délétion polonaise del dup Rooryck et al, 2011, Hum Genet

7 Réarrangement complexe d OCA2 chez deux patients non apparentés

8 Nombre d analyses réalisées par an :

9 BILAN MUTATIONS 399 PATIENTS OCA1, OCA2, OCA3, OCA4, OA1, HPS1 6% SLC45A2-1 Mut; 1; 0% TYRP1-1 Mut; 1; 0% OCA2-1 Mut; 17; 4% TYR - 1 Mut; 7; 2% OA1-1 Mut; 26; 6% HPS1-2 Mut; 5; 1% SLC45A2-2 Mut; 45; 11% TYRP1-2 Mut; 7; 2% Pas de mutation; 52; 13% OCA2-2 Mut; 98; 25% TYR - 2 Mutations; 94; 24% TYR - 1 Mut + R402Q; 46; 12%

10 19% des patients restent sans diagnostic pourquoi? 1) Les mutations se cachent dans des régions non explorées des gènes: Exon 1 Exon 3 Exon 4 Exon 2 Exon 5 // // // // 2) Les patients n ont pas un AOC pur, mais une forme syndromique. 3) D autres gènes sont à découvrir: Gènes candidats Cartographie d homozygotie chez 9 patients Exome séquencé chez 5 patients; 6 autres à venir

11 «Les mutations se cachent dans des régions non explorées des gènes.» Moyen : séquençage de l intégralité des gènes TYR, OCA2, TYRP1, SLC45A2 = exons + introns + régions régulatrices LCR enh CAAT TATA introns LCR // // // kb 1-10 kb -70b -40b promoteur Région adjacente 5 régulatrice 5 UTR exons 3 UTR TYR: OCA2: TYRP1: SLC45A2: TOTAL : pb Impossible à faire avec techniques de séquençage classique Fait par NGS sur 16 patients porteurs d une seule mutation (octobre 2012) (Integragen, Evry) Rien de particulier pour l instant Analyse toujours en cours

12 «D autres gènes sont à découvrir : Gènes candidats» Gènes candidats impliqués dans la pigmentation : AP3B1 (HPS2), ASIP, BLOC1S3 (HPS8), CNO, CYP1A2, CYP2C8, CYP4B1, DCT, DTNBP1 (HPS7), EDN3 (ET3) (WS4), EDNRB (WS4), ERCC1, ERCC2, ERCC3, ERCC4, ERCC5, ERCC6, ERCC8, EXOC2, Gαi3, GNAS, GPR143, HPS1, HPS3, HPS4, HPS5, HPS6, IRF4/SEC5L1, KIF26A, KIT, KITLG, LYST, MC1R, MITF, MLPH, MYO5A (GS1,3), MYO7A (USH1B), OBSCN, OCA2, PAX3 (WS1,3), PLDN (HPS9), PRKAR1A, RAB27A (GS2), SILV, SLC24A4, SLC24A5, SLC45A2, SOX10 (WS4), TPCN2, TP53, TYR, TRP1, UBE3A, 6p25.3, 15q26,17q25.3, 21q22.13,

13 «D autres gènes sont à découvrir» Cartographie d homozygotie Principe : chez des patients issus d union consanguine, le gène et la région qui l entoure se retrouvent à l état homozygote. x x x x x x x

14 Cartographie d homozygotie Identifier à travers le génome des régions homozygotes, dans lesquelles on recherche des gènes candidats porteurs de mutations homozygotes. Moyen: analyser marqueurs; collaboration Pr. JL Mandel (Strasbourg). Recherche ciblée sur régions candidates: gènes d albinisme, de pigmentation Recherche sans a priori : - y a-t-il des régions communes à plusieurs patients? - regarder dans chaque région si des gènes font figure de candidat Homozygotie au locus HPS1 chez 2 patients Identification d une mutation homozygote chez un patient turque : c.972delc/p.met325trpfsx6.

15 Chez deux patients : Gène CNO Homologue de la Protéine cappuccino de souris Rôle dans la biogenèse d organelles associées avec les mélanosomes, granules denses des plaquettes, les lysosomes. Rôle possible dans le trafic de vésicules intracellulaires. Souris cno-/-: modèle de Syndrome d Hermansky-Pudlak. Pas de mutation trouvée après séquençage de CNO.

16 Chez trois patients : Petite région en 15q14, faiblement positive, contenant SLC24A5. SLC24A5 Pas de mutation trouvée après séquençage de SLC24A5. sauvage Golden

17 «D autres gènes sont à découvrir» Séquençage d exome Génome Humain : gènes environ 180,000 exons 1% du génome 85% des mutations responsables de maladies sont situées dans les régions codant pour des protéines. Stratégie très efficace et éprouvée pour identifier de nouveaux gènes de maladies. Analyse de 6 patients «sans mutation» (Integragen, Evry). Près de variants par patient! Application d une série de «filtres» pour rechercher des variants potentiellement pathogènes.

18 EXOME PATIENT ALBINISME - Illumina HiSeq2000 ( exons; 50 Mb) Chr Nb SNPs Profo ndeur (moye nne) HZ HTZ Référ encés (dbsn p) Nouv eaux (no dbsnp ) 3'UTR 5'UTR Coda nts Nouv eaux Coda nts Nonsens Fauxsens Silenc ieux Intron En dehors des gènes X Y mir

19 ADN Séquençage Exome Variants Filtres : hypothèse maladie rare récessive -2 variants dans un même gène -Frq htz < 1 hmz =0 -Couverture > 8x -Variants affectant des séquences codantes (Exon, faux sens, non sens, épissage) variants Sélection de Gènes - Pathogénicité des variants (Polyphen2, Alamut) -Fonction du Gène - Confirmation par séquençage Sanger - Etude de ségrégation chez les parents 50 variants Séquençage Sanger de gènes candidats chez d autres patients OCA = confirmation 15 gènes candidats investigués Etudes fonctionnelles

20 Autres 1) Optimisation des outils, techniques : nouvelles amorces PCR, 2) Etudes fonctionnelles sur mutations d épissage 3) Base de données clinico biologiques 4) Collaboration R. Aquaron : Analyses haplotypes G47D (TYR) et del exon 7 (OCA2) Utilisation des crédits: - Réactifs, prestations séquençage NGS - Salaires: S. François (technicien); F. Morice-Picard (thèse); D. Simon (vacations)

21 PERSPECTIVES 1) Finir analyse exome : - Analyse de 5 gènes candidats restants chez 20 patients sans mutation (phénotype AOC typique, ADN disponible) - Séquencer l exome de 6 nouveaux patients (dont deux apparentés) Appel d Offres Fondation Maladies Rares ) Analyse des nouveaux gènes OCA6 et OCA7 chez 20 patients : - c10orf11 : aucune mutation trouvée (ponctuelle, délétions) - SLC24A5 : 5/20 patients mutés à confirmer pour certains. NB: aucun variant de SLC24A5 mis en évidence dans exome 3) Séquençage complet des gènes OCA1-4 : finir l analyse 4) Analyse des 19 gènes d albinisme syndromique

22 APPLICATION DIAGNOSTIC HOSPITALIER Le NGS de débitmoyenpermetde séquencersimultanémentdes dizainesde gènessurun nombrerestreintde patients : totalement adapté au diagnostic de maladies rares. But principal : faire plus viteet plus complètementcequel onfaisaitdéjà. Actuellement: OCA1, 2, 3, 4, OA1, HPS1 Temps de réponse : 1 à 12 mois Nouvelles possibilités grâce au NGS machine installée : Analyse de tous les gènes d albinisme : OCA: TYR, OCA2, TRP1, SLC45A2, GPR143, c10orf11, SLC24A5, nouveaux gènes à venir HPS: HPS1, AP3B1 (HPS2), HPS3, HPS4, HPS5, HPS6, DTNBP1 (HPS7), BLOC1S3(HPS8), PLDN(HPS9) WS : PAX3 (WS1,3), MITF (WS2), EDN3(ET3) (WS4), EDNRB (WS4), SOX10(WS4) GS: MYO5A(GS1,3), RAB27A(GS2), MLPH(GS3) CHS: LYST Piebaldism: KIT Modificateurs: MC1R, KITLG, SLC24A4, (SLC24A5),. Séquençage de gènes entiers (exons + introns + séquences flanquantes) Avantages: Exhaustivité Flexibilité accrue Rapidité : semaines -mois

23 Conseil Génétique Distinguer les formes syndromiques des non syndromiques. Mode de transmission : autosomique récessive. Risque de récurrence familial = 25%. Diagnostic prénatal à discuter, en fonction notamment de la sévérité de la forme familiale, du vécu familial,. Plus le nombre de patients testés est élevé, meilleure est la connaissance de la maladie d un point de vue médicoscientifique: corrélation génotype-phénotype : relation entre mutation dans tel ou tel gène et expression de la maladie.

24 Remerciements: Service de Génétique Médicale, CHU Bordeaux: Fanny Morice-Picard (UB) Eulalie Lasseaux (CHU) Stéphane François (UB) Delphine Simon (UB) Claudio Plaisant (CHU) Dorothée Cailley (CHU) Caroline Rooryck-Thambo (UB, CHU) Audrey Rouault (CHU) Claire Castaing (CHU) Didier Lacombe (UB, CHU) Service de Dermatologie, CHU de Bordeaux: Alain Taieb Nombreux cliniciens des CHU Genespoir, les patients et leurs familles DHOS (Min. Santé), UNADEV