ETUDE DE LA CONTAMINATION CHIMIQUE DE L ESTUAIRE DE LA SEINE PAR L UTILISATION DE BIOMARQUEURS, DE BIOESSAIS ET COUPLAGE AVEC CES ANALYSES CHIMIQUES

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1 ETUDE DE LA CONTAMINATION CHIMIQUE DE L ESTUAIRE DE LA SEINE PAR L UTILISATION DE BIOMARQUEURS, DE BIOESSAIS ET COUPLAGE AVEC CES ANALYSES CHIMIQUES Groupes "Biogéochimie et Analyses" et "Toxicologie Biochimique" Auteurs : Dr Philippe GARRIGUES, Prof. Jean-François NARBONNE, Dr Hélène BUDZINSKI, Dr Bénédicte MORIN, Dr Sylvie AUGAGNEUR, Pascal MORA, Christelle CLERANDEAU Laboratoire de PhysicoToxicoChimie (LPTC) UMR 5472 CNRS Université de Bordeaux I 3345 TALENCE cédex

2 SOMMAIRE Introduction...p3 I/ Prélèvements sur le terrain, analyses...p3 II/ Résultats et discussion sur les analyses chimiques A. Analyses chimiques...p4 1. Teneurs en HAP dans les sédiments 2. Teneurs en HAP dans les dreissènes 3. Conclusion sur les niveaux de HAP 4. Teneurs en PCB dans les sédiments 5. Teneurs en PCB dans les dreissènes 6. Conclusion sur les niveaux de contamination PCB B. Biotests et analyses biochimiques...p13 1. Evaluation de la toxicité par test Microtox 2. Dosage des biomarqueurs 3. Etude du marqueur de génotoxicité : 8-oxodG 4. Conclusions sur les mesures biochimiques Références...p22 Annexe Expérimentale : analyses chimiques...p25 Annexe Expérimentale : biotests et analyses biochimiques...p28 Annexe Résultats : analyses chimiques...p34 2

3 INTRODUCTION La surveillance biologique afin d évaluer la qualité des milieux aquatiques utilise des organismes aquatiques dans lesquels sont déterminés les niveaux de contaminants chimiques et les niveaux de paramètres biologiques affectés par ces contaminants. Dans le cas de l estuaire de la Seine, le programme Seine Aval 1 a mis en évidence sur certains sites une forte contamination par les HAP (hydrocarbures aromatiques polycycliques), les PCB (polychlorobiphényles) et aussi les métaux lourds. L estimation réelle des effets de ces contaminants sur les écosystèmes touchés est une chose peu aisée, car les outils actuels pour une telle tâche sont encore peu adaptés à un milieu aussi complexe que les milieux estuariens. L utilisation de biomarqueurs, définis comme ''une variation de composants, processus, structures ou fonctions cellulaires ou biochimiques, inductible par les contaminants et qui peut être mesurée dans un échantillon ou un système biologique'' a été proposée au cours des dernières années, en complément du suivi chimique, comme outil de surveillance de l environnement (Stegeman et al. 1992, Calow 1993). Une telle approche de surveillance biologique est capable de mettre en évidence les relations entre présence des contaminants chimiques dans le milieu et réponses écologiques. La moule d eau douce Dreissena polymorpha est un organisme filtreur qui se nourrit de plancton et de déchets organiques, et donc accumule les contaminants directement de la colonne d eau et du matériel particulaire. Ce mode de nutrition fait de la moule une espèce intéressante pour la surveillance biologique car les contaminants ont tendance à se partager entre la phase dissoute et la phase particulaire. Les moules peuvent intégrer des fluctuations des niveaux de contamination sur le court terme et les concentrations dans les tissus reflètent les phases de contamination qui ne peuvent être détectées par l analyse en routine de la qualité de l eau. Ainsi les résultats obtenus lors d un échantillonnage sont caractéristiques de la contamination intégrée par l organisme et ne peuvent pas être extrapolés à des variations annuelles. Les résultats présents ici ont trait aux quatre campagnes de terrain effectuées en Quatre à cinq sites ont été échantillonnés lors de deux missions saisonnières afin de déterminer, d'une part la contamination chimique (métaux lourds, HAP, PCB) dans la matière sédimentaire et les dreissènes, d'autre part une batterie d'indicateurs biochimiques (AChE, stress oxydant par la mesure de l'activité catalase et TBARs, GST). Les profils de concentration des contaminants chimiques, outre le niveau quantitatif de contamination nous renseignent sur l'origine et l'historique des contaminants. Les marqueurs biochimiques nous renseignent sur le degré d'impact sur les organismes des contraintes du milieu (physico-chimie, contamination chimique), ainsi que sur une relation possible avec les contaminants chimiques mesurés. I. PRELEVEMENTS SUR LE TERRAIN, ANALYSES Quatre sites ont été sélectionnés dans l estuaire de la Seine pour un échantillonnage de sédiments et de moules d eau douce (Dreissena polymorpha) : le barrage de Poses qui marque la séparation entre la partie fluviatile et estuarienne de l estuaire de la Seine ; la Bouille, située dans la zone portuaire de Rouen, l île Lacroix située dans la zone urbaine de Rouen ; Oissel située en aval de Rouen et caractérisée par une charge organique importante, visible et odorante, liée à des rejets proches de stations d épuration. Les dreissènes ont été collectées par plongée, accrochées à des pierres ou à des édifices permettant l appontement des navires ; 2 à 3 moules ont été collectées par site, puis sélectionnées afin de ne collecter que les spécimens à peu près de la même taille (1,5 à 2 cm). 3

4 Les protocoles analytiques, tant pour les mesures chimiques que biochimiques sont présents dans les annexes en fin de ce rapport. II. RESULTATS ET DISCUSSION A. ANALYSES CHIMIQUES 1) Teneurs en Hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) dans les sédiments? Année 21. Missions 1 et 2 Les profils des composés aromatiques dans les sédiments montrent un profil globalement d origine pyrolytique, avec une légère prédominance des composés de haut poids moléculaire (supérieur ou égal à 4 cycles aromatiques). La prédominance du phénanthrène sur l anthracène dans un rapport de concentrations souvent inférieur à 1, ainsi que la prédominance du fluoranthène sur le pyrène dans un rapport de concentrations supérieur à 1 confirme cette analyse. Le rapport de concentrations phénanthrène sur anthracène varie entre 2 et 4, avec une valeur dépassant 5 à Oissel. Rappelons qu une valeur de 1 de ce rapport est caractéristique d une matrice typiquement d origine pétrolière. Un apport pétrogénique est donc sensible à Oissel (en particulier la mission n 1). On notera une concentration totale des composés aromatiques dans le sédiment souvent de l ordre de plusieurs milliers de ng/g de sédiment. La variabilité est importante d une mission à l autre, y compris sur les mêmes sites, ceci étant lié à l hétérogénéité des matrices sédimentaires prélevées. On peut néanmoins situer la contamination par les composés aromatiques comme étant qualifiable de "forte contamination" en comparaison avec les autres sites déjà étudiés (voir Baumard, 1998). Par ordre croissant de contamination, et ce malgré l hétérogénéité sédimentaire, on peut classer : Poses, La Bouille, Ille Lacroix, Oissel.? Année 222. Missions 3 et 4 Les profils des composés aromatiques confirment les observations des missions 1 et 2. Une empreinte pyrolytique très nette est remarquée, avec peu d apports pétrogéniques. Les niveaux de concentration sont dans le même ordre de grandeur que les précédentes missions. Par contre les sédiments prélevés au site de La Bouille montrent une concentration très importante dépassant une concentration totale de 3 ng/g qui nous permet d identifier ce site comme "très contaminé". On peut classer par ordre de contamination croissante : Ile Lacroix, Oissel, Poses, La Bouille. 4

5 SOMME DES HAP DANS LES SEDIMENTS (missions 1 à 4) 35 Oissel 3 25 Ile Lacroix la Bouille Poses 2 ng/g Mission 1 Mission 2 Mission 3 Mission 4 SOMME DES HAP DANS LES SEDIMENTS (classement par site, mission 1 à 4) 35 Mission Mission 2 Mission 3 Mission 4 2 ng/g Oissel Ile Lacroix la Bouille Poses 5

6 2) Teneurs en hydrocarbures aromatiques dans les dreissènes.? Année 21. Missions 1 et 2 Les teneurs en hydrocarbures aromatiques sont situées dans la gamme de concentration de 1 à 15 ng/g de poids sec, ce qui indique des bivalves très sensiblement contaminées. On observe un profil assez lissé avec une concentration globalement équivalente des tétracycliques, suivie par les concentrations des benzofluoranthènes, du enzo(a) et benzo(e) pyrène. Les 5 cycles sont faiblement représentés, de même que l anthracène. Le phénanthrène (P) prédomine nettement sur l anthracène (A) dans les échantillons de dreissènes de La bouille. Explication : (1) plus grande solubilité du phénanthrène par rapport à l anthracène, (2) plus grande biodisponibilité des composés aromatiques d origine pétrolière qui pourraient être présents dans l eau et donc être accumulés par les dreissènes. On peut faire la même remarque en ce qui concerne Poses D/2, où une prédominance du phénanthrène est encore à noter. Ces mêmes observations ont été faites par Baumard et al. (1999) sur les moules marines Mytilus galloprovincialis dans différents ports de la mer Méditerranée. Cette signature n apparaissait pas dans les sédiments, comme elle n apparaît pas non plus dans les sédiments associés aux points de collecte des dreissènes. On remarquera aussi une prédominance du pyrène sur le fluoranthène dans les échantillons de dreissènes, contrairement à ce qui est observé dans les échantillons de sédiments. Comme le pyrène et le fluoranthène ont quasiment la même solubilité aqueuse et que les dreissènes sont des filtreurs, le profil observé dans les bivalves est représentatif du rapport de ces composés dans la phase aqueuse, c est à dire une concentration du pyrène supérieure à celle du fluoranthène. Ce rapport est caractéristique d HAP d origine pétrolière, beaucoup plus disponibles que les HAP pyrolytiques, liés aux matières en suspension ou sédimentaires. Cela conforte les observations faites sur le couple phénanthrène/anthracène, à savoir une contamination des dreissènes plus par les HAP pétroliers présents dans la phase aqueuse que les HAP pyrolytiques associés aux sédiments. Un classement en fonction de la concentration en HAP dans les dreissènes pourrait se faire selon : Poses, La Bouille, Oissel et l Ile Lacroix.? Année 22. Missions 3 et 4 Les teneurs en hydrocarbures aromatiques sont situées dans la gamme de concentration supérieure à 15 ng/g de poids sec, ce qui indique des bivalves très contaminées, beaucoup plus en 22 qu en 21. On observe une contamination importante pour la station de Poses lors de la mission 3, qui n est pas en correspondance avec la contamination du sédiment correspondant. Comme pour les missions 1 et 2, on observe un profil assez lissé avec une concentration globalement équivalente des tétracycliques, suivie par les concentrations des benzofluoranthènes, du benzo(a) et benzo(e) pyrène. Les cinq cycles sont faiblement représentés, de même que l anthracène. On notera aussi que sur tous les sites, les dreissènes sont systématiquement plus contaminées lors de la mission 3 (printemps 22) que lors de la mission 4 (été 22). On observe les mêmes tendances que les dreissènes prélevées dans les missions 1 et 2 : une contamination par les HAP d origine pétrolière présents dans la matrice aqueuse. Cela peut s expliquer par une charge en contaminants plus importante pendant les mois d hiver : plus grand débit, plus de phénomènes de ruissellement et donc de flux contaminants plus importants dans la phase aqueuse. Un classement en fonction de la concentration en HAP dans les dreissènes pourrait se faire selon : Oissel, Ile Lacroix, la Bouille, Poses. 6

7 SOMME DES HAP DANS LES DREISSENES (classement par site, missions 1 à 4) 14 Oissel 12 Ile Lacroix la Bouille 1 Poses ng/g Mission 1 Mission 2 Mission 3 Mission 4 SOMME DES HAP DANS LES DREISSENES (classement par site, missions 1 à 4) 14 Mission 1 12 Mission 2 Mission 3 1 Mission 4 ng/g Oissel Ile Lacroix la Bouille Poses 7

8 3) Conclusions sur les niveaux des HAP Les concentrations en HAP dans les sédiments et les dreissènes nous donnent une image différente de la contamination : contamination liée directement aux flux particulaires et à la sédimentation en ce qui concerne le sédiment, contamination liée essentiellement à la colonne d eau et aux particules sédimentaires en suspension pour les dreissènes. Il n y a donc aucune corrélation entre les concentrations en HAP dans les sédiments et les dreissènes, de même qu'il n'y a aucune caractéristique des stations : le niveau de concentrations en HAP varie dans des proportions importantes tant pour les échantillons de sédiments que pour les échantillons de dreissènes, et ceci quelles que soient les saisons, les sites et les missions. Les niveaux de concentration en HAP montrent des sites (sédiments, dreissènes) très contaminés lorsque l'on compare à d autres sites fluviatiles (estuaire de la Gironde, Garonne, Dordogne, Escaut, Rhin) (Baumard, 1998) ou à d'autres sites marins côtiers. On a globalement à faire à un environnement aquatique très fortement contaminé par les HAP. 4) Teneurs en PCB (Polychlorobiphényles) dans les sédiments.? Année 21. Missions 1 et 2 Les profils des PCB dans les sédiments sont les mêmes pour tous les échantillons de sédiments et montrent donc la même origine des PCB. Ils montrent un profil globalement tri-nodal, avec une prédominance des composés pentachlorés (11, 118), puis des composés hexachlorés (153, 138 : les plus importants en concentrations), puis les composés heptachlorés (18, 17). La somme totale des concentrations en PCB dans les échantillons de sédiments dépasse les 1 ng/g, faisant des sédiments de l estuaire de la Seine des sédiments très contaminés par les PCB. Le classement en concentration croissante de PCB est, pour les 4 sites : Ile Lacroix, Poses, La bouille, Oissel.? Année 222. Missions 3 et 4 Les profils des PCB confirment les observations des missions 1 et 2. Par contre les niveaux de concentrations en PCB sont dans un facteur 2 supérieur aux missions 1 et 2. (environ 2 ng/g). Par ordre de contamination croissante : Ile Lacroix, Oissel, Poses, La Bouille. 5) Teneurs en PCB dans les dreissènes.? Année 21. Missions 1 et 2 On observe très nettement un lissage de la contamination des PCB dans les dreissènes, où l'on retrouve la distribution tri-nodale des sédiments : les pentachlorobiphényls (11, 118), les hexachlorobiphényls (153, 138), puis les heptachlorobiphényls (18, 17). C est un profil relativement classique qui est à rapprocher des profils déjà rencontrés chez des filtreurs marins (Mytilus edulis, Ruditapes decussatus). On notera que la concentration des PCB est dans la gamme de 8-1 ng/g de poids sec dans les dreissènes. En ce qui concerne les profils des PCB, on n observe pas un pourcentage important de PCB faiblement chlorés (trois atomes de chlore) car en fait seul le PCB 28 a été recherché. De précédentes études sur des moules dulçaquicoles (Elliptio complanata, Lampsilis radiata) ont montré un enrichissement relatif des PCB faiblement chlorés (trichlorobiphényls) relativement aux composés plus chlorés (au delà de trois atomes de chlore). Classiquement ces profils sont caractéristiques de la contamination de la colonne d eau, les composés les moins chlorés étant plus solubles dans la phase aqueuse. 8

9 On notera là encore un effet systématique qui conduit les échantillons collectés en hiver à être plus contaminés que les échantillons de dreissènes collectés en été sur les mêmes sites. Cela rejoint les observations faites aussi sur les concentrations en HAP dans les échantillons de dreissènes. Contrairement au niveau de concentration de PCB dans les sédiments et au niveau de concentration des HAP dans les sédiments et les dreissènes, nous avons un niveau de concentration par les PCB quasiment identique dans les dreissènes de tous les sites.? Année 22. Missions 3 et 4 Les profils dans les dreissènes sont identiques à ceux de l année précédente avec la même distribution tri nodale. On remarquera néanmoins une concentration plus importante en PCB que pour l année 21 (gamme de 1-12 ng/g poids sec). Les niveaux de concentrations en PCB sont pratiquement les mêmes quels que soient les sites, avec peu de fluctuations si ce n est les PCB 11 et 153. Il n est pas possible de différencier les sites via la contamination des dreissènes par les PCB. 45 SOMME DES PCB DANS LES SEDIMENTS (missions 1 à 4) 4 35 Oissel Ile Lacroix la Bouille Poses 3 25 ng/g Mission 1 Mission 2 Mission 3 Mission 4 45 SOMME DES PCB DANS LES SEDIMENTS (classement par site, missions 1 à 4) 4 35 Mission 1 Mission 2 Mission 3 Mission ng/g Oissel Ile Lacroix la Bouille Poses 9

10 SOMME DES PCB DANS LES DREISSENES (missions 1 à 4) Oissel Ile Lacroix la Bouille Poses 8 ng/g Mission 1 Mission 2 Mission 3 Mission 4 SOMME DES PCB DANS LES DREISSENES (missions 1 à 4) Mission 1 Mission 2 Mission 3 Mission ng/g Oissel Ile Lacroix la Bouille Poses 6) Conclusions sur les niveaux de contamination par les PCB Les sites sont aisément différenciables par le niveau de concentration des PCB dans les sédiments alors qu il n est pas possible de les différencier par l observation des concentrations de PCB dans les dreissènes. Les échantillons de l année 22 sont toutefois plus contaminés (sédiments et dreissènes) qu en 21 avec une différence d environ un facteur 2. Néammoins les profils de PCB sont comparables dans les échantillons de sédiments et de dreissènes. Le profil des concentrations des PCB analysés dans les sédiments montre une forte prédominance de trois congénères, les PCB 138, 153 et 18. L'ensemble des échantillons de sédiments analysés met en évidence la faible representativité d'un certain nombre de congénères fortement chlorés, comme le PCB 2 (2,2',3,3',4,5',6,6'-octCB), PCB 26 (2,2',3,3',4,4',5,5',6 nona CB) et PCB 29 (décachlorobyphényle). Cette présence, même minime indique l'existence dans les sources de contamination des sédiments de l'estuaire de la Seine de mélanges industriels fortement chlorés, dont la teneur podérale en chlore est supérieure ou égale à 6% (mélanges industriels de type Arachbar 126, 1262 ou 1268). 1

11 Les congénères présumés les plus toxiques, PCB 77 (3,3'4,4' TeCB) et le PCB 126 (3,3',4,4',5 PeCB) sont très peu présents, concentrations inférieures au seuil de sensibilité de la méthode. Le PCB 126 n'a été déterminé dans aucun des échantillons sédimentaires. Ces congénères sont en général rarement observés dans des échantillons de sédiments (de Voogt et al., 1993). Cela est dû en grande partie à la faible représentativité de ces congénères dans les formulations industrielles, avec des proportions comprises entre,2% et,9% (pourcentage massique) pour le PCB 77 et inférieures à,7% (pourcentage massique) pour le PCB 126 (Kannan et al., 1987). Ils ont pu néanmoins être détectés par la mise ne œuvre d'un protocole analytique spécifique. Pour ce qui est des dreissènes, l'empreinte de PCB est semblable pour l'ensemble des sites échantillonnés avec, comme pour les échantillons de sédiments, une prédominance des congénères PCB 153, 138, 11 et 18. Ce profil est très proche de celui obtenu dans d'autres études sur différents bivalves marins (Thompson, 1998) ou dans de précédentes études sur l'estuaire de la Seine (Jaouen, 2). 11

12 Matrice P Pyr BaP IPyr SHAP Référence Moule (ng/g PS) Estuaire et baie de Seine 34,5 161,8 3,9 11,9 82 données RNO (1996) Bretagne Nord 14,1 17,9 1,4 2,3 11 données RNO (1996) Bretagne Sud 15,6 2,8 1,9 2, 123 données RNO (1996) Gironde 9,2 6, - 1,8 56 données RNO (1996) Méditerranée 32,7 4 26,5 7,2 412 données RNO (1996) Port d'arcachon 34,8 57, ,8 483 Baumard et al. (1998a, 1999) Port d'ajaccio 21,2 52,7 1,8 3,1 28 Baumard et al. (1998b, 1999) Port de Vecchio 8,6 2,6,4,6 26 Baumard et al. (1998b, 1999) Bonifacio 13,6 1,4 9,7 7,5 121 Baumard et al. (1998b, 1999) Port de Kiel (Mer Baltique) Baumard et al. (1999) Dreissène (ng/g PF) Rhin 5,1 12 6, 1, 152 Hendriks et al. (1998) Meuse , Hendriks et al. (1998) Oissel (mission 2) , 1173 Ce rapport (SHAP=13 HAP) Sédiment (ng/g PS) Baie de Seine Munschy et al. (1996) Estuaire de seine Munschy et al. (1996) Port d'arcachon Baumard et al. (1998a, 1999) Port d'ajaccio Baumard et al. (1998b, 1999) Port de Vecchio 4,1 3,7 2,1 2, 43 Baumard et al. (1998b, 1999) Bonifacio 2,2 1,6 1,2 1,4 17 Baumard et al. (1998b, 1999) Port de Kiel (Mer Baltique) 27,1 59,1 6,7 9,4 361 Baumard et al. (1999) Oissel (mission 2) Ce rapport (SHAP=13 HAP) Foie de Flet (ng/g PS) Estuaire de seine ,6-3,5 4,2-4, Burgeot et al. (1997) Baie des Veys 18,3 12,6 2,2 3,8 82,5 Burgeot et al. (1997) Niveau de présence de quelques HAP dans différents compartiments de l'environnement marin d'après Jaouen, 2 Localisation Concentration Référence Mer du Nord,1-4,4 Kamman et al. (1992) Baltic Proper (Suèdeà <2-11 Kjeller et Rappe (1995) Rio de la Plata (Argentine) <3-998 Colombo et al. (199) Lac Ontario (Canada) Oliver et al. (1989) Bassin du Niagara (51±16) Oliver et al. (1989) Bassin de Mississauga (69±22) Oliver et al. (1989) Bassin de Rochester (63±34) Oliver et al. (1989) Bassin de Kingston (2±15) Oliver et al. (1989) Gasco Bay (E.U.) <1-485 Kennicutt et al. (1994) Lac Supérieur (E.U.) <8-18 Jeremiason et al. (1994 New Bedford (E.U) 8 Elskus et al. (1994 Narrabansett Bay 1-5 Elskus et al. (1995 New Bedford port Brannon et al. (1991) Littoral Français Marchand (1985) Estuaire de la Loire <1-17 Marchand (1985) Gironde <5-3 Marchand (1985) Bassin d'arcachon <5-48 Marchand (1985) Baie de Marseille 4-75 Marchand (1985) Marseille - Cortiou 2-15 Marchand (1985) Littoral Provence Côte d'azur <5-6 Marchand (1985) Littoral corse <2 Marchand (1985) Baie de Seine 5-3 Abarnou et al. (1998) Estuaire de Seine 5-5 Ce rapport Concentration Concentration des PCB des (Equivalent PCB (équivalent mélanges mélanges techniques) techniques) (ng.g (ng.g-1, poids poids sec) sec) dans les sédiments d'après PIERARD, 1995 dans des d'après Jaouen, 2 12

13 B. BIOTESTS ET ANALYSES BIOCHIMIQUES 1) Evaluation de la toxicité d extraits organiques de sédiments par le Microtox.? Méthode Une quantité de sédiments prélevés est lyophilisée, pesée et extraite par un solvant organique. Après évaporation l extrait est repris dans un solvant qui ne présente pas de toxicoité vis à vis de Photobacterium phosphoreum, bactéries luminescentes utilisées pour le test microtox. 3. La toxicité des extraits de sédiments sera évaluer par le microtox selon la norme NF EN ISO Le microtox mesure la lumière émise par les bactéries luminescentes avant et après leur mise en contact avec l extrait de sédiment, l importance de la perte de lumière indique le degré de toxicité du sédiment. Une courbe dose réponse sera calculée pour quatre concentrations d extraits de sédiments. Les CE5 5 mn seront déterminées pour chaque extrait de sédiment (concentration effective d un extrait causant une diminution de 5 % de l émission lumineuse des bactéries).? Résultats et interprétation des CE5 des extraits organiques des sédiments prélevés au cours des missions 3 (2/3/22) et 4 (3/7/22). Microtox Seine-Aval extraits organiques sédiments (classement par mission) Ce5 en g de sédiment/l Mission 1 7/8/1 Mission 2 27/11/1 Mission 3 2/3/2 Mission 4 3/7/2 Oissel Ile-la-Croix La Bouille Poses Yville Microtox Seine-Aval extraits organiques sédiments (classement par site) CE5 en g de sédiment/l Oissel 1 Oissel 2 Oissel 3 Oissel 4 Ile-la-croix 1 Ile-la-croix 2 Ile-la-croix 3 Ile-la-croix 4 La bouille 1 La bouille 2 La bouille 3 La bouille 4 Poses 1 Poses 2 Poses 3 Poses 4 Yville 4 13

14 Pour la mission 3, les extraits organiques des sédiments de Ile-Lacroix semblent être les moins contaminés (ou présentant le moins de toxicité vis à vis de Photobacterium phosphoreum). Pour la mission 4, les CE5 des extraits organiques des sédiments semblent supérieurs pour les sites d Ile-Lacroix et Poses. Ces sédiments présentent donc une toxicité plus faible (vis à vis de Photobacterium phosphoreum) que pour les autres sites. Les sédiments des sites Oissel, La Bouille et Yville seraient plus contaminés. Sur l ensemble des missions, les sédiments du site La Bouille restent en moyenne les plus contaminés alors que ceux d Ile-Lacroix restent en moyenne peu contaminés. On observe une augmentation croissante de la toxicité des extraits des sédiments pour le site de Oissel. Pour le site de Poses, les extraits de sédiments de la mission 3 semblent plus contaminés que pour les autres missions. Les variations observées intra sites peuvent être dépendantes de l homogénéité des sédiments. En effet le test microtox est réalisé à partir d une faible quantité de sédiments prélevés (1.45g de poids sec de sédiment) ; or si le sédiment n est pas homogène ou selon les lieux et conditions de prélèvement (d une mission à l autre), la quantité de sédiment peut être prélevée dans des zones contenant plus ou moins de contaminants chimiques. Si l'on tente une corrélation entre contenu HAP / PCB, et résultats du test Microtox sur les extraits organiques de sédiments, on a une tendance qui va dans le bon sens. Ainsi le sédiment Oissel 1 apparaît sur ce site comme faiblement contaminant, ce qui est le cas pour le contenu en PCB et dans une concentration moyenne pour les HAP. Oissel 3 et 4 sont les sites les plus contaminés en termes de résultats Microtox, ce qui est aussi le cas pour ce qui est de la concentration en PCB. Pour la série des sédiments prélevés sur l'ile Lacroix, la concentration totale en HAP et PCB est globalement inférieure à celle des autres sites, ce qui se traduit aussi pour les résultats Microtox par une toxicité apparentée plus faible. Les sites de la Bouille sont caractérisés par une concentration HAP/PCB globalement supérieure à la moyenne des sites, avec une concentration en HAP (3,5, pas la moyenne) très forte pour la mission 4. Le test Microtox montre une toxicité forte pour ce site. Enfin, la mission 3 sur le site de Poses montre une toxicité maximum pour le test microtox, qui correspond aussi à une concentration très importante en PCB (trois fois la moyenne de concentrations de tous les sites) pour cette mission. En conclusion des résultats de toxicité obtenus par le test microtox sur les extraits organiques de sédiments, on observe une asses bonne corrélation avec des concentrations en HAP/PCB. 2) Dosage des biomarqueurs? Méthode Les dreissènes sont collectées à raison de 1 individus par site. Après dissection, l'ensemble des tissus de chaque individu est congelé à 8 C et stockés jusqu à l analyse. Les différents biomarqueurs (activité GST, Catalase, TBARS, 8-oxodG) ont été déterminés comme présenté dans l'annexe "Biotests et Analyses Biochimiques". Les activités sont rapportées en mg de protéines.? Résultats et interprétations sur les biomarqueurs Catalase, GST et Tbars mesurés sur les dreissènes prélevées au cours des missions 3 (2/3/22) et 4 (3/7/22). L'activité acétylcholinesterase (AChE) a été mesurée sur l'animal entier. Les taux d'activité mesurés (de l'ordre de 1 u/mg de protéines) sont dix fois inférieurs à ceux obtenus pour la moule marine Mytilus edulis ou galloprovincialis et sont donc trop faibles pour observer des différences entre individus ou sites. 14

15 Ces observations avaient déjà été effectuées dans le cadre du projet européen BIOMAR dans lequel des dreissènes de la réserve Oder avaient été prélevées et analysées. (LPTC, résultats non publiés). De même Jaouen (2) n'a pu mettre en évidence une activité AChE significative sur les branchies de dreissènes dans le cadre du programme Seine Aval 1. Les TBARS Le taux de MDA (acide malonedialdéhyde) est un produit des réactions de préroxydation lipidique qui se forme lors de l'attaque des lipides polyinsaturés (de la famille n-6) par des espèces réactives de l'oxygène générées par certains contaminants (HAP, PCB, pesticides, métaux). Les hydroperoxydes ainsi formés se décomposent en intermédiaires radicalaires et en aldéhydes dont un des représentants les plus réactifs est le malonedialdéhyde (MDA). Le MDA est un agent alkylant puissant capable de réagir avec les macromolécules biologiques. Le dosage de ce composé présente donc un intérêt certain chez les animaux soumis à des contaminations multibles (Narbonne et al., 1991, Pellerin-Massicote, 1994). La méthode d'analyse appelée TBARS (Thio Barbituric Acid Reactive Species) a longtemps été définie comme la méthode permettant d'analyser le MDA. Néanmoins, d'autres entités radicalaires peuvent être formées et sont sous le nom de TBARs. Cette mesure traduit tout de même une peroxidation lipidique. 1,4 Tbars S9 Dreissenes entières (Classement par mission) nmol Tbars /mg prot 1,2 1,8,6,4,2 Oissel Ile-la-Croix La Bouille Poses Yville 7/8/1 27/11/1 2/3/2 3/7/2 Mission 1 Mission 2 Mission 3 Mission 4 1,4 Tbars S9 Dreissenes entières (Classement par site) 1,2 nmol Tbars /mg prot 1,8,6,4,2 Oissel Ile-la-Croix La Bouille Poses Yville 15

16 Un test Tukey a été réalisé pour déterminer quels sont les sites significativement différents entre eux par mission. Mission 3 : il n existe pas de différence significative entre les sites. Mission 4 : seul le site La Bouille est significativement différent du site Oissel. Un test Tukey a été réalisé pour déterminer quelles sont les missions significativement différentes entre elles : la mission 3 est significativement différente de la mission 1 et 2. D'autre part, la mission 4 est significativement différente de la mission 1, 2 et 3. Si on tente de corréler les mesures TBARS qui reprennent globalement un stress oxydant aux mesures réalisées pour les PCB et les HAP dans les dreissènes, on observe une bonne concordance entre le contenu en PCB et l'élévation des Tbars. Cela est déjà globalement très net : lorsque l'on compare les mesures entre elles, la mission 4 montre dans tous les sites une forte contamination en PCB des dreissènes corrélés à une forte concentration de TBARS. A l'intérieur d'une série d'échantillonnages d'un même site, cela est aussi vrai. Les dreissènes de la mission 2 apparaissent comme les plus faiblement contaminées en PCB de toutes les mesures effectuées, ceci étant corrélé à une faible production de TBARS. Les dreissènes de la mission 4 sur le site de la Bouille sont les plus contaminées en PCB de toutes les mesures effectuées, cela étant aussi vrai pour les mesures TBARS. On observe donc une bonne corrélation entre la concentration en PCB et la production de TBARS. Cela confirme bien la capacité oxydative des PCB, bien reflétée par la mesure des TBARS. L'activité Glutathion S-transférase (GST) Les GST sont des enzymes de métabolisation de phase II, dont la fonction est de conjuguer à une molécule de glutathion une grande variété de substrats pour permettre leur élimination. Parmi ceux-ci, se trouvent des molécules xénobiotiques d'intérêt écotoxicologique comme les PCB, les HAP et les pesticides. Ces enzymes sont généralement solubles et présentes sous plusieurs isoformes dont certaines sont inductibles par les contaminants qu'elles détoxiquent. Cette particularité en a fait une activité intéressante en tant que marqueur biochimique. Bien que nos connaissances sur ces enzymes chez les mollusques soient encore assez restreintes, leur intérêt en tant que biomarqueur de contamination par les contaminants de type HAPS, PCB et pesticides dans les milieux marin et dulçaquicole a été démontré (Boryslawskyj et al., 1988, Narbonne et al., 1991). 18 GST S9 Dreissenes entières (Classement par mission) nmol /mn/mg prot Oissel Ile-la-Croix La Bouille Poses Yville 7/8/1 27/11/1 2/3/2 3/7/2 Mission 1 Mission 2 Mission 3 Mission 4 16

17 18 GST S9 Dreissenes entières (Classement par site) nmol /mn/mg prot Oissel Ile-la-Croix La Bouille Poses Yville Un test Tukey a été réalisé pour déterminer quels sont les sites significativement différents entre eux par mission. Mission 3 : il n existe pas de différence significative entre les sites Mission 4 : seul le site La Bouille est significativement différent du site Oissel et Ile la Croix. Un test Tukey a été réalisé pour déterminer quelles sont les missions significativement différentes entre elles : il n existe pas de différence significative entre les missions. Les résultats statistiques des mesures de GST ne nous permettent pas de différencier les échantillons de dreissènes, que ce soit par site ou par mission. Cela indique clairement l'action d'autres composés xénobiotiques que ceux mesurés dans cette étude (HAP, PCB) pour expliquer cet effet "moyennement" obtenu pour les mesures de GST. Néanmoins, de précédentes études effectuées dans le milieu marin côtier ont mis en évidence une bonne corrélation entre mesures de GST et mesures de la concentration en HAP/GST. Cela pourrait s'expliquer par la présence en concentration plus importante dans le milieu dulçaquicole d'autres composés xénobiotiques autres que HAP/PCB tels que certains pesticides par exemple, qui ne sont que difficilement détectés en milieu côtier. L'activité catalase Les catalases catalysent la réduction du peroxyde d'hydrogène en eau et en oxygène moléculaire. Ce sont des enzymes peroxysomales dont le ôle est de prévenir les peroxidations des molécules biologiques induites par l'eau oxygénée. Ces enzymes sont sensibles à certains contaminants inducteurs de stress oxydatif au niveau des membranes cellulaires, comme les HAP, PCB, certains pesticides (paraquat)(livingstone et al., 1993a) et les métaux (Labrot et al., 1996). Bien que cette activité paraisse sensible aux facteurs environnementaux d'origine anthropique ou naturelle (Pellerin-Massicote, 1994), elle est un paramètre à surveiller dans le cas de contamination par des composés inducteurs de stress. 17

18 6 Catalase S9 Dreissenes entières (Classement par mission) 5 nmol /mn/mg prot Oissel Ile-la-Croix La Bouille Poses Yville 7/8/1 27/11/1 2/3/2 3/7/2 Mission 1 Mission 2 Mission 3 Mission 4 6 Catalase S9 Dreissenes entières (Classement par site) 5 nmol /mn/mg prot Oissel Ile-la-Croix La Bouille Poses Yville Un test Tukey a été réalisé pour déterminer quels sont les sites significativement différents entre eux par mission. Mission 3 : il n existe pas de différence significative entre les sites. Mission 4 : il n existe pas de différence significative entre les sites. Un test Tukey a été réalisé pour déterminer quelles sont les missions significativement différentes entre elles: les missions 1 et 2 sont significativement différentes des missions 3 et 4. Comme pour les mesures TBARS, les mesures d'activité catalase montrent une différence significative entre les missions 1 et 2 et les missions 3 et 4. les sites au sein d'une meê mission sont difficiles à différencier. On retrouve là encore les mêmes observations faites sur les concentrations en PCB dans les dreissènes ; les missions 1 et 2 présentent des échantillons de dreissènes moins contaminés en PCB que les missions 3 et 4. L'activité catalase se révèle donc un bon marqueur du stress oxydatif imputable au PCB. 18

19 3) Etude du marqueur de génotoxicité : la 8-oxo désoxyguanosine (8-oxodG) Les biomarqueurs de génotoxicité sont étudiés depuis peu comme indicateurs précoces des effets engendrés par les polluants au niveau de l'adn. Les bases modifiées de l'adn résultent des réactions avec les espèces réactives de l'oxygène. La formation de ces lésions, proposée chez les vertébrés comme un évènement crucial de l'initiation de la cancérogénèse chimique pourrait avoir des applications directes en tant que biomarqueurs de génotoxicité chez les espèces sentinelles et permettre ainsi la prédiction à long terme de l'exposition aux contaminants génotoxiques présents dans le milieu naturel. Dans ce cas, leur signification en terme d'effets sur les écosystèmes pourrait être plus importante que celle des seuls biomarqueurs d'exposition plus communément mesurés chez ces organismes. La 8-oxodG est la seule base oxydée de l'adn qui a été étudiée chez la moule (Akcha et al., 1999 ; Marsh et al., 1993 ; Canova et al., 1998). La production de radicaux libres par le métabolisme des bivalves démontre les capacités de ces organismes à exprimer un stress oxydatif. Dans le cas des HAP, la stimulation de la production de radicaux libres semble dépendre essentiellement de l'entrée dans les cycles redox de leurs métabolites quinconces. La glande digestive semble être un tissu cible du stress oxydatif lors de l'exposition aux HAP (F. Akcha, Canova et al., 1998). Cependant, pour l'instant les études in situ réalisées sur la moule n'ont pas permis de montrer une corrélation entre la contamination du milieu en hydrocarbures aromatiques polycycliques et la formation de lésions de l'adn. Branchies Taux de 8-oxodG dans les restes (animal entier sans branchies) 18, 16, 14, 13,5 13,8 12, 8-oxodG / 1e6 dg 1, 8, 6, 9,9 5,51 4,66 6,14 5,23 7,58 6,97 4,82 4,72 4, 3,48 3,96 2,95 2,37 2,95 2,,, Pos1 Ois1 LaBou1 Ile1 Pos2 Ois2 LaBou2 Ile2 Pos3 Ois3 LaBou3 Ile3 Pos4 Ois4 LaBou4 Ile4 Yville4 19

20 Restes Taux de 8-oxodG dans les branchies 18, 16, 14, 13,53 12, 12,27 8-oxodG / 1e6 dg 1, 8, 8,66 7,44 6,34 7,24 6, 4, 2, 4,18 5,16 2,22 4,73 3,8 3,67 3,26 2,59 2,92 2,23 5,49, Pos1 Ois1 LaBou1 Ile1 Pos2 Ois2 LaBou2 Ile2 Pos3 Ois3 LaBou3 Ile3 Pos4 Ois4 LaBou4 Ile4 Yville4 Le taux de 8-oxodG dans les branchies et restes des dreissènes est compris entre 2 et 8 modifications (8-oxodG) pour 1 million de bases normales (dg) pour les missions 2, 3 et 4. Ces valeurs ont été obtenues avec une méthode d extraction d ADN optimisée après la mission 1 qui indiquait des taux de 8oxodG plus fort provenant probablement d artefact au cours de la manipulation. Bien qu il n existe pas de données dans la littérature sur le taux de 8-oxodG dans les tissus de dreissènes, ces valeurs sont du même ordre de grandeur que les valeurs obtenues sur d autres organismes et pourront être utilisées comme valeur de référence. Les résultats obtenus pour les missions 1 et 2 sont peu significatifs, du fait d'un problème méthodologique non résolu en 21, mais résolu en 22. Les missions 3 et 4 apparaissent très différentes avec des taux de 8-oxodG plus importants. Ceci est à rapprocher d'une part des mesures de TBARS qui montrent une augmentation importante pour tous les sites de la mission 4, et d'autre part d'une concentration importante en PCB sur tous les sites de la mission 4. Dans la mission 4, les sites de Poses et de la Bouille ont des concentrations en PCB dans les dreissènes. On observe aussi pour ces deux sites des valeurs importantes de TBARS ainsi que des valeurs élevées du taux de 8-oxodG. On ne trouve néanmoins pas de relations statistiquement significatives, en particulier à cause de l'écart important sur la mesure du taux de 8-oxodG. 4) Conclusions sur les mesures biochimiques Le peu de différences significatives obtenues entre les sites, pour les missions 3 et 4 pour les biomarqueurs Tbars, Catalase et GST (ainsi que la 8oxoDG) a pour conséquence que toute étude discriminante ou indiciaire est sans objet. 2

21 L ensemble de ces résultats sur les biomarqueurs, compte tenu du peu de variations entre les sites par mission est difficilement interprétable. Pour la mission 4, La Bouille semble être le site qui induirait le plus l activité GST et la quantité de Tbars chez la dreissène, correspondant à une plus forte contamination en toxiques de ce site. Pour les Tbars, la mission 4 est significativement différente et supérieure à la mission 3 (alors que l opérateur est le même). On retrouve cette même différence entre la mission 3 et 4 pour le biomarqueur 8oxoDG. Il semblerait qu une augmentation de l oxydation se soit produite pour les échantillons de dreissènes entre ces 2 missions, liée en particulier au changement chimique du milieu aquatique puisque l'on observe une concentration importante en PCB dans les dreissènes pendant la mission 4. Des hypothèses peuvent être émises sur le peu de variations obtenues sur certains biomarqueurs entre les sites, en particulier pour l'activité GST : - Les conditions de prélèvement influent sur la conservation de certaines enzymes au niveau de la température de congélation et du temps de dissection/congélation (différents entre chaque opérateur). Au niveau du prélèvement, la congélation des tissus à 8 C peut être préjudiciable à la conservation de certaines enzymes. La congélation optimale pour les tissus de mollusque est de 18 C ; au-dessus de cette température les enzymes peuvent être endommagées, limitant les variations entre les sites. Pour les futures missions il serait nécessaire de congeler les échantillons dans de l azote liquide dès la fin de la dissection, et ainsi voir s il existe des différences entre les deux méthodes de congélation sur les enzymes. - Les biomarqueurs mesurés (notamment la GST) sur les dreissènes ne permettent pas de discriminer les sites de façon optimale. Pour les futures missions, d autre biomarqueurs pourraient être mesurés. Ceci ne remet pas en cause la dreissène comme espèce sentinelle car pour d autres biomarqueurs (MRX, test SOS Chromotest ) il existe des différences entre les sites. - Pour les biomarqueurs Catalase et Tbars les variations obtenues entre les deux premières missions 1, 2 et les deux dernières 3, 4 correspondent à des variations saisonnières ou à une variation de la contamination (physique ou chimique) du milieu aquatique. CONCLUSION Les niveaux de HAP, tant dans les sédiments que dans les dreissènes, indiquent un environnement aquatique fortement contaminé. Aucune corrélation n'est observée entre teneurs dans les sédiments et les teneurs dans les dreissènes. Cela provient du mode de contamination des bivalves qui se fait par voies dissoutes et particulaire. Ainsi, la concentration du phénanthrène est plus importante dans les bivalves que son homologue l'anthracène (dix fois moins soluble) dans les sédiments et les dreissènes. Pour ce qui est de la teneur en PCB, on est aussi dans le cas d'environnement aquatique très contaminé. On note grossièrement que les concentrations en PCB sont plus importantes pour les missions 3 et 4 (sédiments et bivalves) que pour les missions 1 et 2, sans qu'une corrélation forte entre sédiments et bivalves apparaisse. On notera plus particulièrement un "lissage de la concentration en PCB dans les bivalves, quels que soient les sites considérés pour chaque mission. Ceci est une indication d'une contamination saisonnière due à des variations dans les flux et les apports des PCB au milieu aquatique. La biodisponibilité plus grande des PCB comparée aux HAP, ainsi que la métabolisation possible plus grande des HAP que des PCB conduisent à des comportements totalement différents (Abarnou, Seine Aval 1). En ce qui concerne les mesures biologiques, les résultats des tests microtox sur les extraits organiques de sédiments semblent grossièrement corréler à la concentration en HAP. Ceci paraît tout à fait 21

22 normal dans la mesure où l'étape d'extraction organique rend les HAP plus biodisponibles que lorsqu'ils sont piégés dans la matrice sédimentaire. L'activité d'oxydation révélée par la mesure des TBARS apparaît assez parfaitement corrélée à la concentration en PCB dans les dreissènes, mettant en évidence le pouvoir important du stress oxydatif des PCB. Le marqueur biochimique de phase II, le GST, ne montre aucune tendance, laissant apparaître le même niveau d'induction sur tous les sites et dans toutes les missions. Le marqueur de génotoxicité 8-oxodG, après une phase de mise au point qui ne permet pas d'exploiter les résultats de la première mission. Néanmoins, les taux de 8-oxodG sont plus importants pour les missions 3 et 4, comme cela était le cas pour la mesure des TBARS et la concentration en PCB dans les dreissènes. La poursuite de l'étude en 23 permettra peut-être de conforter l'action apparemment prédominante de la concentration en PCB sur les teneurs des marqueurs biochimiques. Les analyses statistiques et des corrélations plus précises seront présentées dans le rapport final. LISTE DE REFERENCES AKCHA, F. Thèse de l'université de Bordeaux (1999) Etude de la formation d'adduits et de 8-oxodGuo à l'adn de moule, Mytilus sp : Perspectives d'utilisation dans le milieu marin en tant que biomarqueurs de génotoxicité des hydrocarbures aromatiques polycycliques. AKCHA, F., BURGEOT, T., LESKOWICZ, A., BUDZINSKI, H., NARBONNE, J. F. Induction and removal of bulky B[a]P-related DNA adducts and 8-oxodGuo in mussels (Mytulis galloprovincialis) exposed in vivo to B[a]P-contaminated feed. Marine Ecology Progress Series. Sous presse. CANOVA, S., DEGAN, P., PETERS, L. D., LIVINGSTONE, D. R., VOLTAN, R.,VENIER, P. (1998) Tissue dose, DNA adducts, oxidative DNA damage and CYP1A-immunopositive proteins in mussels exposed to waterbone benzo[a]pyrene. Mutat. Res. 399, MARSH, J. W., CHIPMAN, J.K., LIVINGSTONE, D. R. (1993) Formation of DNA adducts following laboratory exposure of the mussel, Mytilus edulis, to xenobiotics. Sci. Tot. Environ. Suppl BORYSLAWSKYJ, M., GARROOD, A.C., PEARSON, JT, WOODHEAD, H. (1988) Elevation of glutathione S-transferase activity as a stress response to organochlorine compounds in the fresh water mussel Sphaerium corneum. Mar Env. Res., 24, p CALOW P. (1993) General principles and overview, In : Handbook of ecotoxicology, Calow P. Ed., 1 : 1-5. LABROT, F., RIBERA, D., SAINT-DENIS, M., NARBONNE, J.F. (1996) In vitro and in vivo studies of potential biomarkers of lead and uranium contamination: lipid peroxidation, acetylcolinesterase, catalase and glutathione peroxidase activities in three non-mammalian species. Biomarkers, 1, p LAGADIC, L., CAQUET, T., AMIARD, J.C. (1997) Biomarqueurs en écotoxicologie : principes et définitions. Dans Biomarqueurs en écotoxicologie, aspects fondamentaux, éditeurs : Lagadic L., Caquet T., Amiard J.C. Ramade F. Masson, p.1-9. LIVINGSTONE, D.R. (1993) Biotechnology and pollution monitoring: use of molecular biomarkers in the aquatic environment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 57, p

23 MARTEL, P.H., KOVACS, T.G. VOSS, R.H. (1996) Effluents from canadian pulp and paper mills: a recent investigation of their potential to induce mixed fonction oxygenase activity in fish. in Environmental fate and effects of pulp and paper mill effluents. edited by M.R. Servos, Munkittrick, K.R., Carey, J. abd Van Der Kraak, G.J. St Lucie Press Delray Beach; Florida, pp MATHER-MIHAICH E, DI GIULIO RT. (1991) Oxidant, mixed-function oxidase and peroxisomal responses in channel catfish exposed to a bleached kraft mill effluent. Arch Environ Contam Toxicol.;2(3): MICHEL, X., SALAÜN, J.P., GALGANI, F., NARBONNE, J.F. (1994) Benzo(a)pyrene hydroxylase activity in the marine mussel, Mytilus galloprovincialis : a potent marker of contamination by polycyclic aromatic hydrocarbons. Mar. Environ. Res., 38, p MORA, P., MICHEL, X., NARBONNE, J.F. (1999) Cholinesterase activity as potentila biomarker in two bivalves. Environ. Toxicol. Pharmacol. 7, p NARBONNE, J.F, GARRIGUES, P., RIBERA, D., RAOUX, C., MATHIEU, A., LEMAIRE, P., SALAÜN, J.P., LAFAURIE, M. (1991) Mixed function oxygenase enzymes as tools for pollution monitoring : field studies on the french coast of the mediterranean sea. Comp. Biochem. Physiol. C, 1, p NARBONNE, J.F, M., DAUBEZE, CLERENDEAU, C., GARRIGUES, P. (1999) Scale classification based on biochemical markers in mussels: application to pollution monitoring in European coasts. Biomarkers, 4, 6, p PAYNE, J.F., MATHIEU, A., MELVIN, W., FANCEY, L. (1996) Acetylcholinesterase, an old biomarker with a new future? Field trials in association with two urban rivers and paper mill in newfoundland. Mar. pol. Bull. 32(2), p PELLERIN-MASSICOTE, J. (1994) Oxidative processes as indicators of chemical stress in marine bivalves. J. Aquat. Ecosyst. Health, 3, p STEGEMAN, J.J., BROUVER M., DI GIULIO R.T., FÖRLIN L., FOWLER B.A., SANDERS B.M. AND VAN VELD P.A. (1992) Molecular esponses to environmental contamination : enzyme and protein systems as indicators of chemical exposure and effect, In : Biomarkers Biochemical Physiological and Histological Markers of Anthropogenic Stress. Huggett R.J., Kimerle R.A., Mehrle P.M. and Bergman H.L. Eds., 6 :235. VIDAL, M.L., NARBONNE, J.F. Characterization of glutathione S-transferase activity in the Asiatic clam Corbicula fluminea. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 2, 64, FITZPATRICK, P.J., SHEEHAN, D. (1993) Separation of multiple forms of glutathione S-transferase from the blue mussel, Mytilus edulis. Xenobiotica 23, FITZPATRICK, P.J., KRAG, T.O.B., H JRUP, P., SHEEHAN, D. (1995) Characterization of a glutathione S-transferase and a related glutathione-binding protein from gill of the blue mussel Mytilus edulis. Biochem. J. 35, SIDHU, M., PRASAD, R., GILL, K.D., NATH, R. (1997) Alterations in isoforms of glutathione S-transferase in liver and kidney of cadmium exposed rhesus monkeys : purification and kinetic characterization. Mol. Cell. Biochem. 166,

24 PIERARD C. (1995) Détermination des composés polychlorobiphenyles dans l'environnement sédimentaire marin et estuarien (thèse présentée à l'université de Bordeaux I). JAOUEN-MADOULET A. (2) Distribution et effets biologiques des PCB et des HAP dans les organismes de l'estuaire de Seine (thèse présentée à l'université du Havre) DE VOOGT, P., WELLS, D.E., REUTERGARDH, L., et BRINKMAN, U.A.TH. (1993) Biological activity, determination and occurrence of planar, mono-and di-ortho PCBs. Environnemental Analytical Chemestry of PCBs, J. Albaigés, Gordon and Breach Science Publishers, KANNAN, N., TANABE, S., WAKIMOTO, T. Et TATSUKAWA, R. (1987). Coplanar polychlorinated biphenyls in Aroclor and Kanechlor mixtures. J. Assoc. off. Anal. Chem. 7,

25 ANNEXE EXPERIMENTALE : ANALYSES CHIMIQUES ANALYSES DES HAP ET DES PCB Tout le matériel de laboratoire, en verre, est soigneusement lavé puis chauffé toute une nuit à 45 C (ce qui permet d enlever toutes traces organiques). Les solvants utilisés sont de qualité HPLC. Les tissus et les sédiments sont lyophilisés et broyés avant extraction. Préparation de l'échantillon pour l analyse des HAP Les tissus biologiques ainsi que les sédiments, avant extraction, sont dopés avec des étalons internes aromatiques perdeutérés (naphtalène d8, dibenzothiophène d8, phénanthrène d1, fluoranthène d1, chrysène d12, benzo(a)pyrène d12, benzo(e)pyrène d12, benzo(k)fluoranthène d12, benzo(ghi)pérylène d12). Les échantillons sont extraits par micro-ondes en utilisant comme solvant le dichlorométhane. L extrait organique est re-concentré. L extrait organique est ensuite fractionné en fraction saturée et fraction aromatique (séparation sur micro-colonnes d'alumine/silice). Les fractions aromatiques sont analysées directement par chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de masse (CG/SM) en mode d acquisition par sélection d ions (ions moléculaires des composés quantifiés). La quantification est effectuée par étalonnage interne en utilisant les composés aromatiques perdeutérés. Un étalonnage des appareils est effectué en utilisant des solutions étalons de composés perdeutérés et des solutions étalons de composés natifs (SRM 226 NIST, Gaithersburg, MD, USA). Des blancs de protocole sont réalisés pour chaque série d expérimentation de façon à s affranchir d éventuelles contaminations. Analyses par CG/SM Les analyses sont effectuées sur un chromatographe en phase gazeuse HP 689 (Agilent Technology, USA) équipé d'un injecteur splitless (délai de purge 1 min, débit de purge 6 ml/min, mode splitless pulsé). L'injecteur est maintenu à 27 C. Le programme de température du four est le suivant : 5 C (2 min) à 29 C (2 min) à 5 C/min. Le gaz vecteur est l'hélium à un débit constant de 1 ml/min. La colonne capillaire utilisée est une colonne HP5-MS (Agilent Technolgy, USA) : 3 m x.25 mm ID x.25 µm épaisseur de film. Le chromatographe en phase gazeuse est couplé à un spectromètre de masse MSD 5973 (impact électronique : 7 ev, voltage: 18 V) opérant en mode de sélection d'ions (SIM) avec les ions moléculaires de chaque composé à doser à 1 scan/s. La température de l'interface est de 29 C. Les HAP sont quantifiés par étalonnage interne par rapport à des HAP perdeutérés; Les facteurs de réponse des différents composés sont mesurés en injectant une solution étalon, SRM 226, contenant les HAP à des concentrations certifiées (NIST, Washington, MD, USA) à laquelle ont été rajoutés les HAP perdeutérés utilisés comme étalons internes. Les résultats des dosages seront exprimés sous la forme de concentrations en ng de composés par g de poids de matrice sèche (après lyophilisation et broyage). 25