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1 GESTION DU RISQUE M Y C O T O X I N E S Marqueurs biologiques liés aux mycotoxines Avantages et inconvénients Christina Schwab Chef de produit, Gestion du risque mycotoxines

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3 Christina Schwab Chef de produit, Gestion du risque mycotoxines Marqueurs biologiques liés aux mycotoxines Avantages et inconvénients L analyse régulière des aliments afin de détecter la présence éventuelle de mycotoxines contribue largement à l efficacité de la stratégie de gestion des risques liés aux mycotoxines utilisée par l éleveur. L ingestion d aliments contaminés expose les animaux d élevage aux effets délétères des mycotoxines sur la santé. Les scientifiques œuvrent depuis plus de 30 ans au développement de substances appelées «marqueurs biologiques» afin de parvenir à établir une corrélation entre les effets observés sur la santé et l exposition à une contamination par les mycotoxines, et ce, grâce au dosage d un paramètre essentiel dans le sang ou d autres échantillons physiologiques. Quels sont les avantages et les inconvénients de l utilisation des marqueurs biologiques liés aux mycotoxines? Les mycotoxines sont des métabolites toxiques sécrétés par des champignons filamenteux et sont retrouvés dans la quasi-totalité des céréales. Environ 95 % de la contamination des céréales par des mycotoxines, quelle que soit la mycotoxine impliquée, a lieu avant la moisson. Malgré la mise en œuvre largement répandue de mesures préventives dans les bonnes pratiques agricoles, 81 % des échantillons d aliments analysés en 2013 (plus de échantillons) contenaient des mycotoxines (rapport BIOMIN sur les mycotoxines, 2013). Étant donné que les conséquences des mycotoxines et leurs effets sur la santé varient considérablement d un animal à l autre, les scientifiques, vétérinaires et éleveurs sont constamment à la recherche de marqueurs biologiques concluants d un point de vue diagnostique. Qu est-ce qu un marqueur biologique lié aux mycotoxines? Marqueur biologique d exposition aux mycotoxines Il est important de distinguer les marqueurs biologiques liés à l exposition aux mycotoxines de ceux liés à leurs effets au sein de l organisme. La présence d aflatoxine M 1 (AfM 1 ) dans le lait de vache constitue un bon exemple de marqueur biologique d exposition (voir tableau 1). Les marqueurs biologiques d exposition permettent de mesurer la quantité de mycotoxines ou de métabolites dans le sang, le lait, l urine, les matières fécales ou d autres échantillons physiologiques. Il est possible, dans une certaine mesure, que la concentration Tableau 1. Marqueurs biologiques potentiels d une exposition aux principales mycotoxines utilisées dans les études scientifiques et marqueurs associés aux effets de ces mycotoxines. Mycotoxine Aflatoxine B 1 (AfB 1 ) Fumonisine B 1 (FB 1 ) Déoxynivalénol (DON) Zéaralénone (ZEN) Ochratoxine A (OTA) Marqueur biologique d exposition AfM 1 dans le lait FB 1 dans le sang, l urine et les matières fécales DON, dé-époxy-don et autres métabolites dans l urine, les tissus et les matières fécales ZEN, zéaralénol, zéaralanol et autres métabolites dans le sang, l urine et les matières fécales OTA et ses métabolites dans le sang, l urine et les tissus (rein) Source: Biomin, adapté de Baldwin et al., 2011 en mycotoxines d un échantillon physiologique soit détectée inchangée alors que le reste est métabolisé. Marqueur biologique associé aux effets Sous-produits de la réaction AfB 1 -albumine dans le sang Sous-produits de la réaction AfB 1 -ADN dans l urine et les tissus Rapport Sa/So dans le sang et les tissus Cytokines proinflammatoires dans le sang et les tissus Conjugués d acide glucuronique dans l urine et les matières fécales Perturbation endocrinienne au niveau des tissus Sous-produits de la réaction OTA-ADN dans les tissus 3

4 Christina Schwab Chef de produit, Gestion du risque mycotoxines En raison de la variété des métabolites issus de chaque mycotoxine et de tant qu outils diagnostiques est uniquement possible dans les é fait qu il n existe aucune recommandation concernant les niveaux de r En tenant compte de certains facteurs, dont la production de lait, on estime qu entre 1 et 6 % de l AfB 1 ingérée peut se retrouver sous forme d AfM 1 (métabolite hydroxylé) dans le lait de vache. De manière approximative, une concentration en AfM 1 de 0,05 ppb dans le lait (niveau maximum pour le lait au sein de l UE) correspondrait à une concentration en AfB 1 comprise entre 0,8 et 5 ppb dans un aliment composé (5 ppb constituant le niveau maximum pour les aliments composés destinés aux vaches laitières au sein de l UE). Cet exemple montre qu il est conseillé de rechercher la présence de mycotoxines dans les aliments afin d éviter les risques liés à la production de lait contaminé contenant de l aflatoxine à un niveau proche du niveau maximum autorisé au sein de l UE. Marqueurs biologiques des effets des mycotoxines Les marqueurs biologiques des effets des mycotoxines au sein de l organisme, également appelés marqueurs biologiques basés sur des mécanismes de base, doivent être directement associés à une étape spécifique de la perturbation Qu en est-il de la méthode ELISA? Malgré sa rapidité d exécution et son prix peu élevé, la méthode ELISA peut uniquement être utilisée avec des matières premières validées et ne constitue pas une méthode fiable pour l analyse d échantillons physiologiques non validés. Des échantillons de sérum et de lait ont été analysés dans deux laboratoires différents afin de rechercher la présence de DON. Alors que les concentrations obtenues avec la méthode ELISA dans le premier laboratoire variaient de 69,5 à 117,5 µg/l, celles mesurées par HPLC dans le deuxième laboratoire étaient inférieures au seuil de détection. Il est évident que les résultats obtenus avec la méthode ELISA étaient de faux positifs car cette méthode ne convient pas à la détection des mycotoxines dans des matrices complexes comme la nourriture, le lait et le sang. Tableau 2. Comparaison des résultats obtenus avec la méthode ELISA à ceux obtenus par HPLC lors de l analyse d échantillons physiologiques DON avec ELISA 1 DON avec HPLC 2 Aliments utilisés en <134 µg/kg 77 µg/kg période de lactation Truie : lait 75 µg/l <0,5 µg/l Truie : sérum µg/l <2,0 µg/l Porcelet : sérum 69,5 µg/l <2,0 µg/l 1 BioCheck GmbH, Leibzig, Allemagne 2 S. Dänicke (Centre fédéral de recherche en agriculture, Institut de nutrition animale, Brunswick), Allemagne des processus métaboliques et cellulaires. Par exemple, l œdème pulmonaire porcin est précédé d une perturbation du métabolisme des sphingolipides par la fumonisine B 1 (FB 1 ). Cette substance inhibe la céramide synthétase, ce qui entraîne une augmentation du rapport sphinganine-sphingosine (Sa/So). Ce rapport constitue un marqueur biologique scientifiquement reconnu des effets des fumonisines (FUM) chez le porc, mais pas chez l homme. Et en pratique? Dans le cas des FUM, le rapport Sa/So est une donnée utilisée dans les études scientifiques mais difficilement applicable au niveau de l exploitation. Il est difficile de disposer d aliments contrôlés et impossible de définir la valeur seuil pour le rapport Sa/So en raison du manque d animaux non exposés dans les élevages. En outre, pour qu un marqueur biologique puisse être utilisé de manière pertinente en pratique, une corrélation linéaire entre l exposition à la mycotoxine et son ingestion doit exister. Certaines études scientifiques publiées ont révélé l existence de ce type de corrélation pour le DON et ses métabolites quantifiés dans le sang ou l urine du porc, mais il existe toutefois des limites. Néanmoins, les différences de concentration en mycotoxines d un échantillon physiologique à l autre ne permettent pas d établir des conclusions quant à la quantité de mycotoxines ingérée et aux effets de ces substances sur la santé des animaux. Ce point explique qu il n existe aucune valeur recommandée établie concernant les concentrations critiques de DON ou d autres mycotoxines dans le sang ou d autres types d échantillons physiologiques chez les animaux, ce qui Photo: Alex Raths_iStockphoto 4

5 Marqueurs biologiques liés aux mycotoxines Avantages et inconvénients s différences de toxicité, l utilisation des marqueurs biologiques en tudes scientifiques. Il convient également de tenir compte du isque dans les échantillons physiologiques. rend l interprétation des résultats impossible. Le fait de devoir réaliser les prélèvements destinés à une analyse censée être représentative à un moment bien précis vient encore compliquer la situation. En effet, la concentration sanguine en DON et ses métabolites atteint sa valeur maximale deux heures après l ingestion et baisse rapidement ensuite. La concentration en ZEN diminue moins vite en raison de la circulation entéro-hépatique (absorption sanguine, excrétion via la bile et réabsorption sanguine). Il est difficile de déterminer le moment opportun pour effectuer un prélèvement dans une exploitation en raison des systèmes d alimentation ad libitum généralement utilisés ; les résultats obtenus ne sont par conséquent pas représentatifs de la réalité. Il convient également de tenir compte du fait que le DON, à l instar d autres mycotoxines, se transforme en métabolites comme le DON-glucuronide et le dé-époxy- DON, ainsi qu en autres métabolites inconnus. La proportion de DON dépend de l espèce animale, de son cycle de vie, du microbiote intestinal et de l état de santé de l animal exposé. En outre, la toxicité des métabolites du DON peut varier de celle du DON comme c est par exemple le cas avec le dé-époxy-don qui n est pas toxique. Le ZEN peut se retrouver sous forme d alpha et bêta-zéaralénol, d alpha et bêta-zéaralanol, et de leurs formes glucuronées dans les échantillons physiologiques. La transformation du ZEN en alpha-zéaralénol augmente l œstrogénicité. Par conséquent, il n est pas suffisant de rechercher une seule mycotoxine de manière isolée. Analyse des marqueurs biologiques Au cours des dernières années, des méthodes d analyse basées sur la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse, ou uniquement sur la spectrométrie de masse (LC-MS/MS), ont vu le jour. Il s agit de méthodes extrêmement sélectives et suffisamment sensibles pour détecter la présence de mycotoxines à des concentrations très faibles. Ces méthodes permettent en outre de quantifier simultanément plusieurs métabolites. La méthode ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) permet uniquement un dépistage approximatif car les effets de matrice liés aux fluides organiques altèrent les résultats. Les anticorps utilisés pour réaliser les tests ELISA de quantification des mycotoxines présentent une large réactivité croisée vis-à-vis des métabolites associés. Par exemple, la plupart des kits de tests ELISA destinés au dépistage du ZEN permettent également de détecter l alpha-zéaralénol, mais ne permettent pas de distinguer les différents métabolites. Bien souvent, la réactivité croisée vis-à-vis des différents métabolites Voie métabolique du DON chez le porc En fonction du microbiote intestinal disponible, le DON ingéré est métabolisé en de-époxy-don non toxique (DOM-1). Le DON et le DOM- 1 sont ensuite partiellement absorbés dans la circulation sanguine et transformés en DON-glucuronide (DON-GlcA) et DOM-1-glucoronide (DOM-1-GlcA) dans le foie. Après leur passage dans la circulation générale, les métabolites sont excrétés dans l urine (30 à 93 % du DON ingéré) ; les matières fécales n en contiennent qu une faible quantité (1 à 3 %). Le reste se compose de métabolites non identifiés et de DON qui sera encore dégradé par la suite. La quantification du DON dans les échantillons physiologiques est uniquement possible si tous les métabolites sont analysés, ce qui reste impossible à réaliser en pratique. DON DOM-1 Excrétion fécale 1 à 3 % DON DON-GlcA DOM-1 DOM-1-GlcA n est ni évaluée ni clairement spécifiée dans le manuel d utilisation des kits. Alors que nous disposons de méthodes validées pour l analyse des mycotoxines dans les aliments, il n en existe presque aucune pour l analyse des marqueurs biologiques. Il convient désormais d établir des mesures de contrôle qualité pour les laboratoires commerciaux concernant l analyse des mycotoxines dans les échantillons physiologiques, mesures déjà existantes lors d analyse dans les aliments. Même si les marqueurs biologiques constituent de précieux outils pour les études scientifiques, il est nécessaire de mieux connaître les facteurs intervenant sur la biodisponibilité, la cinétique et le profil métabolique des mycotoxines chez l animal avant de pouvoir utiliser ces marqueurs en pratique, dans les exploitations. Il manque encore une corrélation linéaire pour les marqueurs biologiques. En outre, il est indispensable d utiliser des groupes témoins et des méthodes de prélèvement complexes, ce qui rend les procédures très onéreuses. L analyse des mycotoxines dans les aliments est une approche fiable bien établie pour évaluer les risques éventuels et constitue par conséquent la méthode de choix. Les références bibliographiques sont disponibles sur demande. Circulation générale Excrétion urinaire ~50% 5

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8 BIOMIN Holding GmbH Industriestrasse 21, A-3130 Herzogenburg, AUSTRIA Tel: , Fax: , BIOMIN Holding GmbH ART_Nr144_MYC_EN_0914_CSH_#12

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