Immunoglobulines. A. Galmiche, octobre 2010

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1 Immunoglobulines A. Galmiche, octobre 2010

2 Généralités Glycoprotéines retrouvées dans le sangs et les fluides biologiques Les immunoglobulines sont les principaux effecteurs de l immunité humorale (par opposition à l immunité cellulaire) Dans leur forme membranaire, elles constituent également le récepteur des cellules B à l antigene (BCR, B Cell Receptor)

3 1. Structure 2. Mode d Action des Ig 3. Genèse du Répertoire Ig 4. Obtention / purification des anticorps 5. Techniques Immunochimiques

4 Structure des Immunoglobulines - 2 chaines lourdes: H - 2 chaines légères: L Associées entre elles par des ponts di-s Chaque Ig est constituée de 4 chaines (H + L) caractérisées par des domaines globulaires (superfamille des immunoglobulines)

5 Structure des Immunoglobulines Region reconnaissant Ag Organisation en domaines constants / variables Les domaines variables des chaines H et L contribuent à former la région reconnaissant l antigène

6 Plusieurs Isotypes d Immunoglobulines 5 types d anticorps chez les mammifères: IgA, IgD, IgE, IgG, et IgM. Associées à des fonctions distinctes: pour chaque isotype, une chaine lourde correspdte α, ε, γ, alors que les chaines légères κ, λ sont communes à tous les anticorps

7 Polymérisation des Immunoglobulines Chaines de jonction permettent formation de complexes dont la valence est accrue

8 IgA et pièce sécrétoire: présence des IgA dans les sécrétions Pièce sécrétoire IgA dimérique La pièce sécrétoire est reconnue par le récepteur des Ig polymériques en surface des cellules épithéliales Sa reconnaissance initie la transcytose et la sécrétion des IgA, qui passent du pôle basal au pôle apical des cellules épithéliales intestinales

9 1. Structure 2. Mode d Action des Ig 3. Genèse du Répertoire Ig 4. Obtention / purification des anticorps 5. Techniques Immunochimiques

10 Interaction anticorps - antigene Chaque anticorps reconnaît un épitope, constituant le plus petit déterminant antigénique

11 Epitopes Séquentiels / Conformationnels Les épitopes peuvent être séquentiels ou conformationnels Les épitopes séquentiels: jusqu à une dizaine d acides aminés par exemple Les épitopes conformationnels sont formés par la juxtaposition de plusieurs acides aminés dans l espace (mais non contigus dans la séquence primaire). La réactivité avec l anticorps disparaît quand la protéine est dénaturée

12 Modes d action des Immunoglobulines Neutralisation toxines, virus et bactéries Activation du complément: activation par les Ig constitue la voie dite classique d activation du complément Activation de l immunité cellulaire: opsonisation, stimulation phagocyte et chimiotactisme - récepteurs cellulaires spécifiques (FcR)

13 Neutralisation L interaction avec l anticorps prévient l interaction d un microbe avec les cellules de l hôte Par exemple, les IgA spécifiques présentes dans les sécrétions préviennent interaction virus grippal avec cellules épithéliales

14 Activation du Complément Ensemble de protéines abondant (3 g/l au total dans le plasma), environ 25% des globulines plasmatiques Approximativement une trentaine de protéines solubles et membranaires, s activant en cascade (protéolyses)

15 Activation du Complément et Immunité IgM et IgG sont les activateurs les plus puissants du complément Activation des composants C5-C9 impliqués dans la formation du complexe d attaque membranaire (CAM): un pore inséré dans la paroi des bactéries qui provoque leur lyse osmotique En même temps, l activation du complément favorise l activation et le recrutement des effecteurs de l immunité

16 Immunité cellulaire: les récepteurs au Fc des Ig

17 FcεRI et Hypersensibilité Immédiate IgE Allergène FcεR FcεR FcεR Mastocyte Histamine protéases

18 Les Immunoglobulines MW Valence Fonctions biologiques IgG 150 kda 2 reconnaissance toxines, virus, bactéries neutralisent, activent complément et immunité cellulaire (FcγR) IgM 1 Mda 10 premières Ig à apparaître, Ig «naturelles» neutralisation et activation complément IgA kda 2-4 immunité des muqueuses neutralisation des pathogènes IgE 190 kda 2 réponses immunitaires allergiques et dirigées contre les parasites, immunité cellulaire (FcεR)

19 1. Structure 2. Mode d Action des Ig 3. Genèse du Répertoire Ig 4. Obtention / purification des anticorps 5. Techniques Immunochimiques

20 Les réponses Immunoglobulines sont de nature clonale Un lymphocyte B produit une immunoglobuline unique

21 Les réponses Immunoglobulines sont de nature clonale Exposition Ag Genèse répertoire Expansion du clone réactif Maturation réponse

22 Comment produire un répertoire de plusieurs centaines de milliers de protéines à partir du génome? Origine Génétique de la diversité des Anticorps: S. Tonegawa (Prix Nobel de Médecine 1987)

23 Recombinaison génétique et genèse du repertoire des Immunoglobulines Les gènes codant les immunoglobulines ou les récepteurs des cellules T ne sont pas présents sous forme active dans ces cellules aux premiers stades du développement. Ils sont assemblés par combinaison de segments de gènes: variable (V), diversity (D), Joining (J), Constant (C).

24 Recombinaison des gènes Ig / TCR Locus IgH

25 Combinatoire et répertoire des Immunoglobulines Vκ 40 Jκ 5 Vλ 31 Jλ chaines légères VH 51 JH 25 DH chaines lourdes Soit au total spécificités immunoglobulines par combinatoire

26 Diversité Jonctionnelle et Expansion du Répertoire Insertion ou délétion de nucléotides à la jonction entre les segments de gènes par TdT: terminal nucleotidyl-transferase VH (N) DH Ce processus augmente considérablement la variabilité également processus d hypermutation somatique

27 La réponse Anticorps : étapes indépendantes / dépendantes de l exposition à l antigène indépendamment de l exposition à l Ag après exposition à l Ag Moelle osseuse Périphérie

28 Maturation de la réponse anticorps 1. Le switch d isotype 2. Ig membranaires et sécrétées

29 Switch d Isotype Changement d isotype au cours maturation de la réponse immunitaire IgM: réponses innées, précoces IgG, A, E, ultérieurement, après activation par antigène «spécialisation» de la reponse immunitaire humorale, adaptée à la confrontation de pathogènes parasitaires (IgE), présents dans le sérum (IgG), ou au contact des muqueuses (IgA) Le switch d isotype est réalisé par recombinaison dans la région constante dans chaine lourde des Ig. La région variable est conservée: l Ig conserve donc sa spécificité antigène

30 Switch d Isotype

31 Formes solubles et membranaires des Immunoglobulines Lymphocyte B: BCR Plasmocytes

32 Ig membranaires vs solubles: polya alternatifs sur gènes de la Chaine lourde (H) des IgM µm poly-a B cells Membrane Plasmocytes µs poly-a Pas de domaine d ancrage membranaire Secretion

33 1. Structure 2. Mode d Action des Ig 3. Genèse du Répertoire Ig 4. Techniques d obtention des anticorps 5. Techniques Immunochimiques

34 Les Anticorps, un réactif essentiel en biologie Du fait de leur étroite spécificité comme de leur relative simplicité d obtention, les anticorps sont utilisés largement En recherche biomédicale En laboratoire de biologie: détection des protéines et analyse de leur conformation, dosages hormonaux, etc En milieu hospitalier, ce sont aussi des molécules à usage thérapeutique

35 Obtention des Anticorps Expérimentalement, injections répétées chez l animal lapin le plus souvent L antigène est injecté avec un adjuvant: formulation qui stimule l immunité A noter que les composés de poids moléculaire inf. à 3000 (typiquement peptides peptides) ne sont généralement pas immunogènes: conjugaison avec un carrier, une protéine large qui augmente l immunogénicité Les carriers les plus utilisés sont par exemple OVA, BSA La petite molécule est appelée un haptène

36 Prélèvement et Anticorps L immunserum est obtenu en saignant l animal et en laissant procéder la coagulation Il est éventuellement possible d immunopurifier les anticorps, afin d améliorer le titre du sérum Chromatographie d affinité sur colonne avec antigène immobilisé Purification de tous les anticorps: protéine A, protéine G

37 Anticorps Monoclonaux Expérimentalement, il est possible de réaliser l isolement et l immortalisation d un clone unique de plasmocytes pour produire un anticorps de spécificité fixe et parfaitement identifiée: anticorps monoclonal Les anticorps monoclonaux sont des réactifs de laboratoire très utilisés du fait de leur spécificité étroite et parfaitement reproductible Récemment utilisation thérapeutique

38 Protocole d obtention des Anticorps Monoclonaux (1) 1. Injection de l antigène 2. Récupération de la rate 3. Splénocytes mis en culture et immortalisés par fusion avec une cellule de myélome

39 Protocole d obtention des Anticorps Monoclonaux (2) 4. Les hybridomes ainsi maintenus en culture dans milieu de sélection spécifique 5. Clonage / Sélection des clones possédant la réactivité attendue: dilution limite ou en cytométrie de flux 6. L hybridome obtenu est conservé et on peut utiliser les anticorps qu il sécrète

40 Humanisation des Anticorps Monoclonaux Clonage du gène codant un anticorps monoclonal permet de remplacer les régions constantes, qui sont différentes entre espèces. On peut alors prévenir la xénoréactivité Humanisation des anticorps monoclonaux permet l utilisation en clinique des anticorps monoclonaux

41 Utilisation clinique des Anticorps Monoclonaux + Infliximab Infliximab (Remicade ), un monoclonal anti-tnfα utilisé pour pathologies inflammatoires chroniques résistantes aux traitements «classiques»

42 1. Structure 2. Mode d Action des Ig 3. Genèse du Répertoire Ig 4. Obtention / purification des anticorps 5. Techniques Immunochimiques

43 Les principales techniques Immunochimiques Réactions d agglutination Précipitations cplxes antigènes - anticorps Immunofluorescence, anticorps couplés Western blot ELISA

44 Réaction d agglutination + sérum à tester Billes / hématies recouvertes d antigènes

45 Réaction Antigène - Anticorps et Précipitation en milieu liquide

46 Réaction Antigène - Anticorps et Précipitation en milieu liquide précipitation

47 Néphélémétrie Déviation de la lumière par une solution contenant un précipité: rayon laser traverse le tube contenant d éventuelles particules du précipité. La diffraction de la lumière est mesurée à la sortie. La néphélémétrie est adaptée au dosage rapide, automatique des complexes Ag-Ac. Utilisation en routine au laboratoire de biologie pour de nombreux dosages.

48 Systèmes de détection des anticorps Radioactivité Fluorochromes: fluorescéine, rhodamine, Texas red, phycoérythrine Enzymes: phosphatase alcaline, peroxydase Particules denses aux électrons (microscopie électronique)

49 Immunofluorescence directe / indirecte Antigène Antigène Anticorps primaire Anticorps secondaire

50 Immunofluorescence Sur tissus et cellules en culture, au moyen d un Microscope à fluorescence Marquage mitochondrial Dépots IgG glomérule rénal

51 Western Blot On détecte des protéines après électrophorèse / transfert sur une membrane (typiquement nitrocellulose)

52 Western blot gel Transfert des proteines Sur mb de nitrocellulose Ac primaire Ac secondaire -> révélation

53 Variations Western blot Le Western blot est utilisable en diagnostic sérologique, afin de mettre en évidence Ig spécifiques reconnaissant un antigène connu Cet antigène est charge sur gel, transféré sur membrane, La membrane est incubée avec le serum à tester, puis la réaction est révélée avec un anticorps secondaire spécifique d espèce / d isotype

54 ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay, c est à dire dosage immunoenzymatique sur support solide Adapté à la réalisation de sérologies / dosages rapides et à grande échelle, car ce type de test est réalisé en plaques 96 puits

55 Pratique de l ELISA L Ag contre lequel on cherche à identifier les Ig est adsorbé sur une plaque 2. Le sérum est mis en contact avec l antigène adsorbé 3. La quantité d anticorps fixé est estimée en utilisant un anticorps IIaire (couplé à un chromogène ou à un fluorophore: spectrophotomètre ou fluorescimètre)

56 Exemple d utilisation en pratique médicale: le dépistage de l infection par HIV