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1 1. Détection de virus entériques Détection de bactéries coliformes Bibliographie Page 1

2 3.2. Détection de microorganismes pathogènes dans les eaux estuariennes de la Seine Nathalie Castignolles 1, P. Servais 3, André Ficht 2, Claudine Buffet-Janvresse 1, 1 Laboratoire de Virologie Centre Hospitalier Universitaire de Rouen 1, rue de Germont F Rouen Cedex 2 Service de navigation et de lutte contre la pollution Ile Lacroix avenue Chastellain Rouen 3 Groupe de Microbiologie des Milieux aquatiques Université Libre de Bruxelles Campus de la Plaine, CP 221 B-1050 Bruxelles 1. Détection de virus entériques Au cours des différents exercices, l'étude de la contamination virale des eaux de Seine par des méthodes moléculaires a été possible grâce: 1) au développement d'une procédure d'extraction permettant l'obtention d'acides nucléiques à partir d'un grand volume d'eau de Seine caractérisée par un taux élevé de polluants, d'inhibiteurs et de matières en suspension (Petit, 1999) 2) au développement de protocoles d'analyse de ces extraits d'acides nucléiques. Les protocoles mis en œuvre sont des réactions de RT-PCR (détection virus ARN) ou PCR (détection virus ADN). Plusieurs techniques établies initiallement pour l'analyse d'échantillons cliniques ont étét adaptées pour l'analyse de préparations d'acides nucléiques extraits d'eau de Seine. Il a été ainsi d'abord développé pour la détection d'entérovirus une réaction de RT PCR (Petit-Jean, 1992; Zoll, 1992). Au cours du dernier exercice, la détection des entérovirus a été rendue plus sensible par la mise en œuvre d'un protocole permettant une deuxième amplification après la RT-PCR (RT-nested PCR) (Puig, 1994; Pina, 1998). De même, pour la détection des adénovirus, une réaction de PCR a été adaptée puis rendue plus sensible après une deuxième amplification (Allard,1990; Puig 1994, Castignolles, 1998). Par ailleurs, plus récemment, les techniques de biologie moléculaire ont permis de faire progresser la détection des Astrovirus et Calicivirus (dont le virus de Norwalk), virus entériques également impliqués dans les gastroentérites mais jusqu'à présent peu étudiés en raison de leur difficile identification. Ces avancées récentes ont permis d'étudier l'incidence de ces virus en santé publique et de faire évoluer leur classification, notamment celle des calicivirus. Les protocoles de RT-PCR disponibles pour la détection des astrovirus et calicivirus ont été mis en œuvre au cours du dernier exercice pour l'analyse de nos échantillons (Noel, 1995, Belliot, 1997). Depuis, la sensibilité de ces techniques a pu être augmentée par l'établissement de protocoles permettant une deuxième amplification après la RT-PCR (Green, 1998) mais qui restent encore à adapter pour l'analyse de nos échantillons. Ainsi, au cours des différents exercices, le nombre de virus entériques recherchés dans les eaux de Seine a augmenté jusqu'à quatre virus durant l'exercice 98. Ces quatres virus entériques ont été recherchés dans les prélévements d'eaux collectées lors de la campagne Mars 98. Page 65

3 Les résultats reportés dans le Tableau 1 montrent que parmi les virus étudiés, les adénovirus sont détectés dans le plus grand nombre de sites (12/19 prélévements de la campagne Mars 98). La prévalence des adénovirus déjà observée lors de précédentes campagnes est encore confortée par les récentes analyses de la campagne de Sept 98: parmi 12 extraits testés pour la détection d'adénovirus, 9 sont positifs dont 5 dans la partie aval. Les adénovirus sont donc détectés en un grand nombre de sites et ce à des périodes différentes de l'année (Mars et Septembre). Ceci ne semble pas être le cas des entérovirus qui sont détectés en nombre variable d'une période à l'autre: les résultats préliminaires montrent en effet que le nombre de sites positifs pour la détection d'entérovirus est supérieur en Sept 98 qu'en Mars 98. L'utilisation de méthodes moléculaires suffisamment sensibles et spécifiques a apporté de nouvelles données quant à la présence dans les eaux estuariennes de la Seine. La recherche de virus entériques jusque là peu ou pas étudiés pour cause de limitations méthodologiques a pu être réalisée. Des informations ont été obtenues notamment sur la distribution géographique de ces virus avec la mise en évidence de sites régulièrment contaminés et de sites moins fréquemment contaminés. Par ailleurs, la prévalence des adénovirus observée à différentes périodes de l'année ainsi que leur stabilité en font par conséquent un indicateur de choix pour l'étude de la contamination virale des eaux de Seine. Page 66

4 2. Détection de bactéries coliformes La numération des bactéries coliformes (indicateur de contamination fécale) a été envisagée en collaboration avec l'équipe de P. Servais. Parralléllement au dénombrement sur gélose, nous avons quantifié le nombre de copies du gène lac Z spécifique de ces bactéries à l'aide d'une PCR compétitive. D'un point de vue méthodologique, le nombre de copies du gène Lac Z contenu dans nos échantillons a été calculé par rapport à une quantité connue de plasmides bactériens cible porteur du gène recherché. Il s'agit donc d'un nombre equivalent de copies du gène Lac Z et non d'une numération bactérienne au sens strict. Ce nombre de copies est ensuite rapporté au volume d'échantillonage (100 ml). Les résultats (numération classique et numération PCR) obtenus lors de l'analyse des prélévements collectés en Mars 98 sont reportés sur le Tableau 2 et visualisés sur les Figure 1 (échelle décimale) et Figure 2 (échelle logarithmique) (Fichier associé CR 9899 Fig.xls). Pour certains échantillons, la numération PCR a été répétée (analyse 1, 2 ou 3). Exprimées en log, les variations intra-analyse demeurent tout à fait acceptables, ce qui met en évidence la répétabilité de la mesure. Par ailleurs, les résultats visualisés sur les Figures 1 et 2 montrent que les profils obtenus selon les deux méthodes sont parallèles avec un maximum situé en amont de l'estuaire (entre pk 67 et pk 102). Une différence de niveau entre les deux profils est toutefois observée. Cette différence peut s'expliquer en partie par la sensibilité de détection de l'adn bactérien selon le type de bactérie reconnue (bactérie vivantes, mortes, reviviscentes). L'ensemble de ces résultats confirment l'intérêt de la technique moléculaire mise en œuvre pour la quantification du gène Lac Z comme moyen d'apprécier la quantité de bactéries coliformes, tout état bactérien confondu. Page 67

5 1.E+14 1.E+13 1.E+12 1.E+11 N pour 100 ml 1.E+10 1.E+09 1.E+08 1.E+07 1.E+06 1.E+05 1.E+04 1.E+03 1.E Numération PCR Lac Z Numération gelose coli Numeration PCR LacZ Numeration PCR Lac Z l 3 Kilomètres Echelle N= Nombre de colonies (numération ou N= Nombre de copies equivalent gène Lac Z (numération Figure 1. Numération des coliformes totaux par la méthode classique sur gélose et par numération PCR quantitative du gène Lac Z. Campagne Seine Aval de Mars Bibliographie Abad, F.X., Pinto, R.M., Villena, C., Gajardo, R, and Bosch, A. (1997).Astrovirus Survival in Drinking Water. Applied And Environmental Microbiology. 63 (8) : Allard, A., Girones, R., Juto, and Wadell, G. (1990). Polymérase chain reaction for detection of adenoviruses in stool samples. Journal of Clinical Microbiology. 28, Allard, A., Albinsson, B. and Wadell, G. (1992). Detection of adenovirus in stools from healthy persons and patients with diarrhea by two-step polymérase chain reaction. Journal of Medical Virology. 37, Belliot, G., Laveran, H., Monroe, S.S. (1997). Detection and genetic differentiation of human astroviruses : phylogenetic grouping varies by coding region. Archives of Virology. 142, N. Castignolles, F. Petit, I. Mendel, L. Simon, L. Cattolico and C. Buffet-Janvresse (1998) Detection of adenovirus in the waters of the Seine estuary by nested-pcr. Molecular and Cellular Probes (12) Green, J., Hensshilwood, K., Gallimore, C. I., Brown, D. W. G., Lees (D. N.) (1998) A nested reverse transcriptase PCR assay for detection of small round structured viruses in environmentally contamined molluscan shellfish Applied Env. Microbiol. (1998) 64 (3) Noel, J., Lee, T. W., Kurtz, J. B., Glass, R. I., Monroe, S. S. (1995) Typing of human astroviruses from clinical isolates by enzymes immunoassay and nucleotide sequencing J. Clin. Microbiol. 33 (4), Petit-Jean J., Kopecka, H., Freymuth, F., Langlard, J. M., Scanu, P., Galanteau, F., Bouhour, J. B., Ferrière, M., Charbonneau, P. Komajda, M. (1992) Detection of enterovirus in endomyocardial biopsy by molecular approach J. Med. Virol, 37, Page 68

6 Petit, F., Mendel, I., Garnier, J., Ficht, A. & Buffet-Janvresse, C. (1996) Détection moléculaire des virus et bactéries présents dans les eaux estuariennes de la Seine. Bull. Soc. Fr. Microbiol. 11 (HS) : Puig, M., Jofre, J., Lucena, F., Allard, A., Wadell, G. & Girones, R. (1994) Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied & Environmental Microbiology. 60 (8) : Zoll, G., Melchers, W., Kopecka, H., Jambroes, G., van der Poel G., Galma, J. M. D., (1992) General primer mediated polymerase chain reaction for detection of enterovirus: application for diagnosis routine and persistent infections J. Clin. Microbiol. 30 (1) Page 69