VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION

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1 VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date de la dernière adaption Recherche des Salmonella spp. dans les denrées alimentaires suivant la méthode RT-PCR iq-check Salmonella II (AFNOR BRD 07/06-07/04) LAB-21-I-MET-MIC-036d Enrichissement Détection Isolement Confirmation - Produits destinés à la consommation humaine - Produits destinés à l alimentation animale - Prélèvements de carcasses par écouvillonnage 18/09/2012

2 Résumé des critères de performance : Limite de détection : 5 ufc/25ml, /25g ou /swabs. La validation répond aux exigences de la procédure LAB 00 P180 Le laboratoire qui veut appliquer cette méthode doit démontrer que les critères ci-dessous soient remplis pour les combinaisons matrices/paramètres : Participation à un test interlaboratoire et obtention de résultats corrects. Limite de détection : 10 ufc/25ml, /25g ou /swabs. Historique de validation : Edition Révision par/date Motif de la révision Modifications 1 MC Wilem / Adaptation au nouveau template et à la nouvelle procédure de validation (P180) Adaptation au nouveau template du dossier de validation du 26/09/2008 avec annexe photos. Ajout de la limite de détection pour 3 types de matrice.

3 VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Recherche des Salmonella spp. dans les denrées alimentaires suivant la méthode RT-PCR iq-check Salmonella II (AFNOR BRD 07/06-07/04) LAB-21-I-MET-MIC-036d Enrichissement Détection Isolement Confirmation - Produits destinés à la consommation humaine - Produits destinés à l alimentation animale - Prélèvements de carcasses par écouvillonnage Totale MC Wilem Responsable section microbiologie LFSAGx MC Wilem Responsable section microbiologie Date: 18/09/2012 Handtekeningen - Signatures: Sé Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction) Collaborateurs de la section microbiologie LFSAGx A. Georges S. Petit A. Mandiki B. Polderman F. Marlier C. Schauwers M. Martin MC Wilem Periode van validatie Période de validation Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par Ce dossier de validation a été clôturé le 26/09/2008 Adaptation du template du dossier de validation : septembre 2012 Handtekeningen - Signatures: A. Dubois Responsable Qualité laboratoire Sé LFSAGx Datum: 19/09/2012 Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /15

4 Samenvatting validatiegegevens Résumé des données de validation 1. Paramètre de validation Les paramètres suivants doivent être déterminés - Limite de détection Critères - La limite de détection doit être voisine de 10 ufc. 2. Validation La validation a été effectuée sur base d échantillons artificiellement contaminés par une solution contenant des Salmonella enteritidis Matériaux utilisés - Cultiloops Salmonella enteritidis - Capsule de standard BCR (réf : 507R S. Typhimurium) - Eau peptone tamponnée - Tryptone sel - Kit iq-check Salmonella II - Bouillon MKTTn - Bouillon Rappaport Vassiliadis Soja - Gélose XLD - Gélose Brilliance Salmonella LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /15

5 2.2. Organisation La validation de la méthode a été effectuée en 3 étapes : - Etude de la répétabilité - Etude de la reproductibilité - Détermination de la limite de détection du laboratoire Répétabilité - La détermination de la concentration en microorganismes dans les différentes dilutions utilisées est détaillée dans l annexe types de matrices ont été contaminés : lait, viande hachée, aliments pour animaux et viennoiserie. Le choix des différents types a été effectué en fonction des catégories définies dans la norme ISO (Microbiologie des aliments Lignes directrices pour l estimation de l incertitude de mesure pour les déterminations quantitatives) - Pour chaque type de matrice, 5 niveaux de contamination (dont le taux de contamination 0) ont été analysés. - 8 échantillons de chaque type de matrice sont contaminés avec chaque taux de contamination. - La recherche par la méthode PCR est toujours réalisée en parallèle avec la recherche suivant la norme ISO Schéma général du mode opératoire : Exemple : matrice lait Recherche par la méthode PCR Recherche par la méthode ISO Jour 1 - Contamination de 24ml de lait avec les dilutions d-3, d-4, d-5 (8 prises d essai pour chaque dilution) - Ajout de 225ml d EPT - Incubation à 37 C ± 1 C pendant 18h ± 2h Jour 2 Extraction de l ADN Ensemencement des bouillons RVS et MKTTn Jour 3 Jour 4 Préparation et détection PCR Ensemencement des géloses XLD et Brillance Salmonella Lecture des géloses Dénombrement des salmonelles dans chaque dilution - Prélever 1ml de chacune des dilutions utilisées - Répartir ce ml sur 3 boîtes de gélose chromogène - Incuber à 37 C ± 1 C pendant 24h Lecture des géloses d0 : ufc/ml d-3 : ufc/ml d-4 : ufc/ml d-5 : ufc/ml LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /15

6 Reproductibilité - La reproductibilité a été établie sur la matrice «lait». - 6 échantillons ont été contaminés avec 1 ml de la dilution d-4 d un cultiloop Salmonella enteritidis - Le mode opératoire détaillé peut être consulté en annexe 2. - Chaque échantillon a été analysé par un opérateur différent. Les personnes suivantes ont participé à cette détermination : A. Mandiki, F. Marlier, M. Martin, S. Petit, B. Polderman, MC Wilem - Les passages des 6 échantillons dans l appareil PCR ont été réalisés à des moments différents. Chaque participant a suivi le mode opératoire décrit dans l instruction «Détection des Salmonella spp. suivant la méthode PCR» Limite de détection La limite de détection du laboratoire a été établie pour chacun des 4 types de matrice définis dans la norme ISO Matrice lait (2008) - Les personnes suivantes ont participé à cette détermination : A. Mandiki, A. Georges, F. Marlier, M. Martin, S. Petit, B. Polderman, C. Schauwers, MC Wilem - 25 ml d échantillon ainsi qu une capsule de standard BCR contenant 5 bactéries (Réf. : 507R S. typhimurium) ont été placés dans 225ml d eau peptonée tamponnée (solution mère). - Incubation 18h à 37±1 C - L extraction de l ADN et l analyse par RT-PCR a été effectuée à partir de ce milieu enrichi par tous les participants Autres matrices (2012) La limite de détection du laboratoire a également été établie pour les autres types de matrices : viande hachée, fromage, légume (laitue). Pour chaque matrice, le schéma suivant a été suivi : - Prélever 4 fois 25g d échantillon - Ajouter 225ml d eau peptonée tamponnée - Contaminer 3 de ces échantillons avec une capsule de standard BCR - Le quatrième échantillon est considéré comme blanco. Les échantillons sont traités comme décrit dans l instruction I-MET-036d. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /15

7 2.3. Résultats Répétabilité Matrice Lait Concentration du ml de solution utilisé pour contaminer 25 ml de l échantillon : d0 : concentration maximale : > 300 ufc/ml d-3 : 323 ufc/ml d-4 : 45 ufc/ml d-5 : 4 ufc/ml Dilution Méthode de référence Méthode PCR d0 + + d d d Echantillons non contaminés Note : 8 échantillons pour chaque dilution Le détail des résultats peut être consulté dans l annexe Matrice Viande hachée - - Concentration du ml de solution utilisé pour contaminer 25 g de l échantillon : d0 : concentration maximale : > 300 ufc/g d-3 : 653 ufc/g d-4 : 94 ufc/g d-5 : 2 ufc/g Dilution Méthode de référence Méthode PCR d0 + + d d d Echantillons non contaminés Note : 8 échantillons pour chaque dilution Le détail des résultats peut être consulté dans l annexe LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /15

8 Matrice Aliments pour animaux Concentration du ml de solution utilisé pour contaminer 25 g de l échantillon : d0 : concentration maximale : > 300 ufc/g d-3 : 665 ufc/g d-4 : 66 ufc/g d-5 : 9 ufc/g Dilution Méthode de référence Méthode PCR d0 + + d d d Echantillons non contaminés Note : 8 échantillons pour chaque dilution Le détail des résultats peut être consulté dans l annexe Matrice Viennoiseries Concentration du ml de solution utilisé pour contaminer 25 g de l échantillon : d0 : concentration maximale : > 300 ufc/g d-3 : 757 ufc/g d-4 : 51 ufc/g d-5 : 4 ufc/g Dilution Méthode de référence Méthode PCR d0 + + d d d Echantillons non contaminés Note : 8 échantillons pour chaque dilution Le détail des résultats peut être consulté dans l annexe LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /15

9 Reproductibilité Concentration du ml de solution utilisé pour contaminer 25 g de l échantillon : d-4 : 73 ufc/ml Analyste Résultat A. Mandiki + F. Marlier + M. Martin + S. Petit + B. Polderman + MC Wilem + Le détail des résultats peut être consulté dans l annexe Limite de détection : Contamination de l échantillon : 5 ufc/25g ou ml d échantillon Matrice lait Nom Résultat attendu Résultat obtenu A. Georges Présence Présence A. Mandiki Présence Présence F. Marlier Présence Présence M. Martin Présence Présence B. Polderman Présence Présence S. Petit Présence Présence C. Schauwers Présence Présence MC Wilem Présence Présence LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /15

10 Autres matrices Echantillon Résultat attendu Résultat obtenu Viande hachée 1 Présence Présence Viande hachée 2 Présence Présence Viande hachée 3 Présence Présence Viande hachée blanco Absence Absence Fromage 1 Présence Présence Fromage 2 Présence Présence Fromage 3 Présence Présence Fromage blanco Absence Absence Légume 1 Présence Présence Légume 2 Présence Présence Légume 3 Présence Présence Légume blanco Absence Absence LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /15

11 2.4 Tests interlaboratoires Les résultats des tests interlaboratoires RAEMAB poudre de lait mars 2008 et RAEMAB - viande juin 2008 ont été analysés en parallèle par la méthode PCR et par la méthode de référence ISO Le détail des résultats PCR peut être consulté dans l annexe 8 Les résultats obtenus suivant la méthode de référence peuvent être consultés dans le cahier des analyses Salmonelles. Tableaux récapitulatifs des résultats : Résultats tests interlabo RAEMAB poudre Ech Rés. attendus Résultats ISO Résultats PCR AG AM FM MM SP BP CS MCW Rem : ce test a également été utilisé pour qualifier le personnel. Résultats tests interlabo RAEMAB Viande Ech. Résultats attendus Résultats ISO Résultats PCR LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /15

12 3. Conclusions Limite de détection Les Salmonella ont été détectées par tous les participants à ces essais lorsqu elles étaient présentes à raison de 5 bactéries par 25g ou 25ml de l échantillon. Qualification du personnel Les personnes ayant participé à cette validation sont qualifiées pour la recherche des Salmonella spp. dans les denrées alimentaires et les échantillons d écouvillonnage de surface. Elles devront régulièrement participer à des analyses interlaboratoires et obtenir des résultats satisfaisants. 4. Annexes - Annexe 1 : Détermination de la concentration en microorganismes - Annexe 2 : Mode opératoire pour l étude de la reproductibilité - Annexe 3 : Détail des résultats matrice lait - Annexe 4 : Détail des résultats matrice viande hachée - Annexe 5 : Détail des résultats matrice aliments pour animaux - Annexe 6 : Détail des résultats matrice viennoiseries - Annexe 7 : Détail des résultats Reproductibilité - Annexe 8 : Détail des résultats tests interlaboratoires - Annexe photos LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /15

13 Annexe 1 Détermination de la concentration en microorganismes Matériau : Cultiloop Salmonella Enteritidis Placer l öse d un cultiloop dans 225ml d EPT (=d0) Incuber 2h à 37 C ± 1 C Effectuer des dilutions de ce bouillon Dilutions 1/10 dans du Tryptone sel Par une étude effectuée auparavant, il a été déterminé que les dilutions intéressantes sont les dilutions d-3, d-4, d-5 Lors de chaque contamination de matrice, un dénombrement des salmonelles présentes aux différentes dilutions est effectué. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /15

14 Annexe 2 Mode opératoire pour l étude de la reproductibilité Ensemencement de 225ml d eau peptonée tamponnée (lot : 8D0518) avec un cultiloop Salmonella enteritidis (lot : ) Incubation à 37 C durant 2h (incubateur 389) Entrée : 13h30 Sortie : 15h30 Dilution dans du peptone sel (lot : 7J0343) jusqu à la d-4. Etalement de 1ml de la dilution d-4 sur 3 boîtes de Brilliance Salmonella (lot : ) Ensemencement de 24ml de lait stérilisé avec 1ml de la dilution d-4 Ajouter 225ml d eau peptonée tamponnée. Cette opération est réalisée 6 fois. Incuber à 37 C durant 21h (incubateur 389) Entrée : 16h h00 : Dénombrement des salmonelles sur la gélose Brilliance Salmonella : 73 ufc/ml Extraction de l ADN Les eppendorfs sont placés dans un congélateur à 18 C en attendant la détection par PCR. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /15

15 Annexes 3 à 8 Les documents sont disponibles au laboratoire. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /15

16 Annexe photos 1- Extraction de l ADN Ajout du réactif de lyse Incubation 10 à C Centrifugation 2 à rpm LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /15

17 2- Préparation des plaques Zone réservée à la préparation du mix PCR Zone réservée à l ajout de l échantillon dans les puits 3- Appareil d analyse RT-PCR LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /15

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