Les outils non génétiques de diagnostic pour les Maladies Rares

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1 Les outils non génétiques de diagnostic pour les Maladies Rares Roseline Froissart Laboratoire des Maladies Héréditaires du Métabolisme et Dépistage Néonatal Centre de Biologie Est Hospices Civils de Lyon Bron 24 Octobre 2012

2 Maladies rares Difficultés du diagnostic Extrême diversité des maladies Hétérogénéité pour une même maladie Expression à tout âge (anténatal / adulte) Complexité Approche multidisciplinaire (expertise) Clinique Anatomopathologique Biochimique Génétique

3 Réponse du biologiste Demande d analyse avec données cliniques Prélèvement (respect des conditions) Compte-rendu écrit Envoi au laboratoire (délai de transport) Interprétation Les différentes étapes d une analyse Réception et identification Recueil des résultats Préanalytique (centrifugation, isolement des leucocytes, stockage) Contrôle de qualité (interne, +/- externe) Analyse

4 Diversité des prélèvements Sang (sérum, leucocytes, lymphocytes ) Urines LCR Biopsie organe (muscle, foie..) Biopsie de peau (culture de cellules, microscopie électronique ) Villosités choriales, cellules amniotiques (diagnostic prénatal) Sang foetal Sang séché sur papier buvard (Guthrie)

5 Le prélèvement de Guthrie Prélèvement de sang déposé sur buvard: Au talon pour dépistage néonatal systématique à J3 Au bout du doigt Sang veineux (prise de sang) déposé sur papier Après séchage, transport à température ambiante Excellente conservation (métabolites, enzymes, protéines ) Utilisation d un spot de 3mm de diamètre (environ 2,5µl sang total)

6 Méthodes de diagnostic Analyses «de routine»: orientation Glycémie, corps cétoniques, ammoniémie, acide lactique, cholestérol, triglycérides, acide urique, enzymes hépatiques, CPK, LDH.. Bien réalisé peut orienter vers un type de pathologie Numération/Formule sanguine, frottis sanguin (cellules de surcharge ) Examen anatomopathologique Etude morphologique Batterie standard de colorations Techniques spéciales: enzymo-histochimiques (enzymes) et immuno-histochimique (antigènes), en fonction renseignements cliniques et hypothèses diagnostiques Orientation ou diagnostic Podocytes, HE, x600 Dr R. Bouvier, Lyon

7 Déficit enzymatique dans une voie métabolique GENES G 1 G 2 G 3 ENZYMES E 1 E 2 E 3 METABOLITES A B C D 7

8 Déficit enzymatique dans une voie métabolique GENES G 1 G 2 G 3 ENZYMES E 1 E 2 E 3 METABOLITES A B C D Accumulation Déficit 8

9 Méthodes de diagnostic Métabolites: Anomalie: reflet déficit enzymatique ou transporteur Urines, plasma, LCR Qualitatif: examen d orientation chromatographie couche mince électrophorèse

10 OLIGOSACCHARIDES (urines) Chromatographie couche mince

11 Mucopolysaccharidose type I Exploration biochimique par méthode globale : profil des mucopolysaccharides urinaires (électrophorèse, colorimétrie) Mucopolysaccharidose de type I : maladie de surcharge lysosomale liée à un déficit en -Liduronidase, transmission autosomique récessive Traitement : perfusion d enzyme produite par génie génétique KS CS DS HS Malade Malade traité MPS I Profil normal MPS III MPS IV MPS III Profil normal 11

12 Méthodes de diagnostic Métabolites: reflet déficit enzymatique ou transporteur Urines, plasma, LCR Qualitatif: examen d orientation chromatographie couche mince, électrophorèse Quantitatif: méthodes complexes Spectrométrie de masse en tandem MS/MS (acides aminés, acylcarnitines, hormones..) Spectrométrie de masse couplée à la chromatographie gazeuse : GC-MS (acides organiques ) Analyse protéique Etude génétique souvent dans un 2 temps (si test biochimique fiable)

13 Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) Implantation dans les laboratoires de diagnostic depuis environ 20 ans Séparation très fine d un grand nombre de métabolites qui peuvent être quantifiés (étalon interne du composé à doser, marqué par isotope stable) Injection directe ou étape de séparation (chromatographie liquide) Composition: source d ionisation / 2 quadripôles en série / détecteur

14 Abondance Principe MS/MS Principe: séparation des molécules (préalablement ionisées) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) Source Electrospray (ESI): ionisation à pression atmosphérique des métabolites à analyser, mode positif [M+H] + ou négatif [M-H] - Triple quadripôle Q1 détermine le poids moléculaires des ions (ions parents) Q2 est une chambre de collision : fragmentation des ions Q3 analyse les fragments produits par Q2 (ions fragments) Détecteur : multiplicateur d électrons Echantillon ES I Q 1 Q 2 Q 3 D m/z Source d ionisation Analyseur Détecteur

15 C2 déficit en MCAD (beta-oxydation des acides gras à chaîne moyenne) * C8 *Étalons internes (acylcarnitines deutérées) C0 C0 * * * * C2 C6 C10:1 * * * Control * * * C3 * C4 * * * * * C5 * * * * 15

16 Avantages: Spécificité Grande sensibilité MS/MS Grande variété des applications (sur un même appareil) Multiplex: dosage simultané de nombreux composés Analyse de nombreuses molécules sur faible volume d échantillon (ex: quelques µl de sérum, tache de sang ) Temps d analyse court (2 au lieu de 2h pour Phénylalanine): de nombreux pays l ont adopté pour le dépistage néonatal Ex: acides aminés: 15 pour identifier 76 composés (avant: 2h30 avec moins de composés) Ex: Profil des acylcarnitines: 30 maladies testées en 3 (temps machine)

17 Limites: Composés ionisables MS/MS Séparation préalable indispensable si composés isomasses Étapes préparatives de l échantillon (extraction, purification ), assez longues Coût: investissement important > euros mais coût des réactifs faible Personnel qualifié: technicien spécialisé et interprétation des données nécessitant un niveau d expertise élevé Ingénieur nécessaire (appareillage sophistiqué)

18 Méthodes de diagnostic Métabolites: reflet déficit enzymatique ou transporteur Urines, plasma, LCR Qualitatif: examen d orientation chromatographie couche mince, électrophorèse Quantitatif: méthodes complexes Analyse protéique Cellules sanguines, cultivées, tissus, plasma Western blot: CDG, protéines musculaires Etude enzymatique (activité): MS/MS (multiplex), fluorimétrie, colorimétrie, substrat radioactif Etude génétique souvent dans un 2 temps

19 Western blot Principe: séparation des protéines par électrophorèse + Immunodétection = séparation en fonction du poids moléculaire Intérêt pour protéines non enzymatiques Analyse qualitative et quantitative Ex: CDG (Carbohydrate Deficient Glycoprotein): = anomalies de glycosylation des glycoprotéines 80 kda Western Blot (transferrine) N CDG I CDG II 77 kda 74 kda Diagnostic de certaines myopathies Ex: dystrophine (taille, quantité) Limites: peut être normal

20 Etudes enzymatiques Utilisation substrat spécifique: fluorimétrie, colorimétrie, substrat radioactif MS/MS (multiplex) Recherche déficit Activité résiduelle: seuil? Il peut être difficile de différencier un malade et un hétérozygote (non atteint): rare Enzyme non mesurable (activité trop faible) Enzyme exprimée dans un seul tissu (ex: foie, rein, cerveau ) Pseudodéficits (variants non pathologiques) Déficits multiples (sulfatases) Déficits protéines activatrices Tissu ou cellules fraîches parfois nécessaires

21 Contrôle de qualité/ Validation Interne (échantillon normal, pathologique, étalon interne) Externe (ERNDIM.) Validation de méthode Chaque labo valide sa méthode (protocole peut être variable d un labo à l autre) Valeurs usuelles (parfois fonction de l âge) Connaître les limites de chaque test (faux positifs et faux négatifs)

22 Expertise Un résultat normal exclut-il le diagnostic? Un résultat anormal affirme t il le diagnostic? Confrontation à la clinique Si conclusion impossible: Nouveau prélèvement Analyse complémentaire: autre méthode biochimique, étude génétique Pas d intérêt à multiplier les labos Surtout important pour des maladies rares! Plusieurs biologistes doivent être formés

23 Pourquoi est ce parfois si long? Sauf urgence+++ si urgence vitale et si maladie traitable (étude métabolites) Analyses très spécialisées Techniques manuelles chronophages Analyses regroupées pour raisons économiques (séries) Analyses faites à fréquence variable Faites par peu de laboratoires (ex: sulfite oxydase: 2 laboratoires dans le monde) Vérification parfois nécessaire Autre technique requise Temps de culture

24 Risques de passer à côté du diagnostic? Qualité du prélèvement Conservation (enzymes+++) Ex: urines: lactates d or bactérienne ou endogène Labilité du composé (ex: sulfocystéine, homocystéine ) Moment du prélèvement Normalisation biochimique peut exister entre les crises (AA, AO, cycle de l urée ): prélever au moment accès aigu ex: déficit beta-oxydation des acides gras, cycle de l urée (OCT) Intérêt de prélèvement avant toute mesure thérapeutique (quand une maladie métabolique est suspectée) Formes tardives et frustes: dialogue avec le clinicien +++ Ex: acidémie glutarique Déficit enzymatique partiel Profils atypiques Nécessité d une expertise pour chaque test et pour un diagnostic dans son ensemble (réseaux nationaux)

25 Conclusions Les résultats doivent être interprétés par le biologiste Garder l expertise biochimique même pour les maladies très rares Etude génétique: permet de confirmer ou est nécessaire au diagnostic Utilité des tests biochimiques +++ pour confirmer les résultats des explorations génétiques (séquençage haut débit) Techniques récentes mais coûteuses et d interprétation difficile (non disponible en labo de diagnostic): Spectro RMN in vitro (nouvelles maladies identifiées) MALDI/TOF Identification de nouveaux biomarqueurs («omique»)