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2 Pathologie Biologie 58 (2010) Évaluation de la plate-forme de PCR en temps réel LightCycler pour la mesure des charges virales CMV, EBV, HHV-6 et BKV dans le sang total Evaluation of the LightCycler real-time PCR system for the measurement of CMV, EBV, HHV-6 and BKV viral loads in whole blood D. Boutolleau a,b, *, C. Deback a,b,j.géli a,b,z.aït-arkoub b, F. Angleraud b, A. Gautheret-Dejean a,b,c, H. Agut a,b a UPMC, université Paris VI, ER1 DETIV, Paris, France b Service de virologie, groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière, AP HP, bâtiment CERVI, 83, boulevard de l Hôpital, Paris, France c UPRES EA 4065, laboratoire de microbiologie, faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques, université Paris Descartes, Paris, France INFO ARTICLE RÉSUMÉ Historique de l article : Reçu le 9 juin 2009 Accepté le 26 juin 2009 Disponible sur Internet le 4 novembre 2009 Mots clés : LightCycler Diagnostic virologique moléculaire Charge virale Sang total Infections virales opportunistes Keywords: LightCycler system Viral molecular diagnosis Viral load Whole blood specimen Opportunistic viral infections Objectif. La plate-forme de PCR en temps réel LightCycler (LC480) a été évaluée pour le diagnostic moléculaire quantitatif des infections virales opportunistes dues au cytomégalovirus humain (CMV), au virus Epstein-Barr (EBV), au sixième herpèsvirus humain (HHV-6) et au virus BK (BKV), en comparaison avec des techniques de PCR en temps réel de référence (techniques «maison»). Patients et méthodes. Un total de 253 prélèvements de sang total provenant de patients greffés a été testé. Résultats. Les méthodes de référence et LC480 étaient très bien corrélées (coefficient de corrélation de Spearman Rho 0,85 ; p < 0,0001) avec une excellente concordance d un point de vue qualitatif (90,5 %) et sans différence significative d un point de vue quantitatif pour l ensemble des quatre virus testés. L exactitude des protocoles sur le LC480 a été confirmée par les résultats obtenus avec les 44 échantillons du contrôle de qualité pour le diagnostic moléculaire 2008 (Quality Control for Molecular Diagnosis [QCMD]). Conclusion. Le système LC480 est un automate de PCR en temps réel parfaitement adapté à l activité hospitalière d un laboratoire de virologie pour le diagnostic et le suivi des infections virales opportunistes chez les patients greffés par la mesure des charges virales CMV, EBV, HHV-6 et BKV dans les prélèvements de sang total. ß 2009 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. ABSTRACT Objective. The Roche LightCycler (LC480) system was evaluated for quantitative molecular diagnosis of opportunistic viral infections caused by human cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV), human herpesvirus 6 (HHV-6), and BK virus (BKV), in comparison with in-house real-time PCR assays. Patients and methods. A total of 253 whole blood specimens obtained from transplant recipients were tested. Results. Both the in-house and the LC480 methods were highly correlated (Spearman correlation coefficient Rho 0.85; p < ) with an excellent overall qualitative agreement (90.5 %) and no significant quantitative difference between both techniques for the four viruses tested. The accuracy of the LC480 protocols were confirmed further by the results obtained with the 44 samples from the Quality Control for Molecular Diagnosis (QCMD) 2008 proficiency panel. Conclusion. The LC480 system constitutes a suitable and versatile real-time PCR platform in a routine laboratory setting for the diagnosis and monitoring of opportunistic viral infections in transplant recipients, by measuring HCMV, EBV, HHV-6, and BKV loads in whole blood samples. ß 2009 Elsevier Masson SAS. All rights reserved. * Auteur correspondant. Adresse david.boutolleau@psl.aphp.fr (D. Boutolleau) /$ see front matter ß 2009 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi: /j.patbio

3 D. Boutolleau et al. / Pathologie Biologie 58 (2010) Tableau 1 Amorces et sondes d hydrolyse utilisées pour les techniques de PCR en temps réel sur l automate LC480. Virus Gène cible Nature Séquence (5 3 ) Référence CMV US8 Amorce sens ACCAACATAAGGACTTTTCACACTTTT Deback et al. [4] Amorce antisens GAATACAGACACTTAGAGCTCGGGGT FAM-CTGGCCAGCACGTATCCCAACAGCA-TAMRA EBV BXLF1 Amorce sens GGGGCAAAATACTGTGTTAG Brengel-Pesce et al. [7] Amorce antisens CGGGGGACACCATAGT FAM-CGGCGCATGTTCTCCTCCAC-TAMRA HHV-6 U65-U66 Amorce sens GACAATCACATGCCTGGATAATG Gautheret-Dejean et al. [5] Amorce antisens TGTAAGCGTGTGGTAATGGACTAA FAM-AGCAGCTGGCGAAAAGTGCTGTGC-TAMRA BKV LT-ag Amorce sens AAGTCTTTAGGGTCTTCTAC Si-Mohamed et al. [6] Amorce antisens GAGTCCTGGTGGAGTTCC FAM-AGAATCTGCTGTTGCTTCTTCATCACTGGC-TAMRA 1. Introduction Le cytomégalovirus humain (CMV), le virus Epstein-Barr (EBV), le sixième herpèsvirus humain (HHV-6) et le virus BK (BKV) sont des virus largement répandus dans la population générale et constituent une cause majeure de morbidité et de mortalité chez les patients recevant une greffe d organe solide ou de cellules souches hématopoïétiques [1 3]. Dans les laboratoires de virologie, des méthodes de diagnostic à la fois rapides, sensibles et spécifiques sont nécessaires pour la mesure des charges virales sanguines chez les patients afin de détecter précocement les infections virales opportunistes et de prévenir efficacement les maladies associées à ces virus. Le but de cette étude était de développer de nouveaux protocoles de PCR en temps réel pour le CMV, l EBV, le HHV-6 et le BKV sur le LightCycler (LC480), la nouvelle plate-forme de PCR en temps réel récemment commercialisée par Roche Diagnostics (Meylan, France) et d évaluer les performances de ce nouveau système par comparaison à des techniques de PCR en temps réel de référence (techniques «maison»), en utilisant des prélèvements de sang total et des panels de contrôle de qualité. d une minute à 40 8C. Les techniques de PCR en temps réel ont été effectuées en parallèle sur le LC480, après des adaptations mineures des protocoles initiaux. L amplification a été réalisée dans un volume final de 25 ml comprenant le tampon LC480 Probes Master (1X), les amorces sens et antisens (200 nm chacune), la sonde d hydrolyse (100 nm), l uracil-n-glycosylase (0,38 unité ; Invitrogen, Cergy- Pontoise, France) et 10 ml d extrait d ADN. À noter que pour la technique BKV sur LC480, les concentrations d amorces et de sonde étaient 500 nm. Pour la technique EBV sur LC480, la sonde d hybridation marquée au LC-Red 640 (appelée sonde EBV-LC2 dans la méthode initiale décrite par Brengel-Pesce et al. [7]) a été utilisée en tant que sonde d hydrolyse doublement marquée FAM - TAMRA. Les séquences des amorces et des sondes utilisées dans les protocoles pour le LC480 sont indiquées dans le Tableau 1. Pour l ensemble des virus testés, le programme d amplification sur LC480 était le suivant : deux minutes à 50 8C etdix minutes à 95 8C, puis 45 cycles comprenant chacun 15 secondes à 95 8C et 40 secondes à 60 8C et une étape finale de refroidissement de 30 secondes à 40 8C. Pour le CMV, l EBV et le HHV-6, la quantification du génome viral était effectuée grâce à une courbe de calibration générée à partir de dilutions successives de raison 10 d ADN viral obtenu par extraction de cellules infectées et quantifié par rapport à un plasmide (gracieusement fourni par les Pr Bruno Lina, Pr Jean-Marie Seigneurin et Dr Agnès Gautheret-Dejean, respectivement). Pour le BKV, un standard quantifié du commerce a été utilisé (BK Human Polyomavirus quantitated viral DNA, Tebu-Bio, Perray-en-Yvelines, France). Afin de détecter la présence potentielle d inhibiteurs de PCR dans les extraits d ADN, tous les extraits ont été testés purs et à la dilution 1:10. Les résultats des charges virales ont été exprimésen log (nombre de copies/ml). Le seuil de sensibilité de toutes les techniques de PCR était 1,4 log (25 copies/ml). 2. Patients et méthodes Au total, 253 prélèvements de sang total (prélevés sur anticoagulant EDTA) provenant de patients greffés d organe solide ou de cellules souches hématopoïétiques ont été analysés pour le CMV (n = 62), l EBV (n = 104), le HHV-6 (n = 53) et le BKV (n = 34). Ces prélèvements biologiques ont été sélectionnésrétrospectivement afin d obtenir un large éventail de valeurs de charges virales pour chacun des virus étudiés. De plus, 44 échantillons du contrôle de qualité pour le diagnostic moléculaire 2008 (Quality Control for Molecular Diagnosis [QCMD]) ont été testés : dix pour le CMV, dix pour l EBV, 12 pour le HHV-6 et 12 pour le BKV. Les prélèvements sanguins ont été conservés à 80 8C avant d être testés et les échantillons du QCMD ont été reconstitués avec de l eau stérile pour biologie moléculaire au moment des tests, selon les recommandations du fournisseur. L ADN aété extrait à partir de 400 ml d échantillon (sang total ou contrôle de qualité) à l aide de la trousse MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation kit I sur l automate MagNA Pure Compact (Roche Diagnostics). Le volume d élution était de 100 ml. Les ADN viraux ont ensuite été amplifiés àl aide des techniques de PCR en temps réel de référence (techniques «maison») mises en œuvre dans le laboratoire pour notre activité de diagnostic virologique. Pour le CMV, le HHV-6 et le BKV, les techniques de PCR en temps réel utilisant la technologie de sonde d hydrolyse (TaqMan 1 ) ont été utilisées comme décrit précédemment [4 6]. Pour l EBV, la technique de PCR en temps réel utilisant la technologie des sondes d hybridation a été effectuée comme décrit précédemment [7]. Les PCR CMV et HHV-6 ont été réalisées sur l automate ABI PRISM (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France) en utilisant le programme d amplification suivant : deux minutes à 50 8C et dix minutes à 95 8C, puis 45 cycles comprenant chacun 15 secondes à 95 8C et une minute à 60 8C (mode émulation 9600). Les PCR EBV et BKV ont été effectuées sur le LightCycler (LC1.5 ; Roche Diagnostics). Pour la technique BKV, le programme d amplification était le suivant : une minute à 50 8C et huit minutes à 95 8C, puis 45 cycles comprenant chacun cinq secondes à 95 8C et 20 secondes à 60 8C, et une étape finale de refroidissement d une minute à 40 8C. Les paramètres du programme d amplification pour la technique EBV étaient les suivants : une minute à 50 8C et huit minutes à 95 8C, puis 45 cycles comprenant chacun dix secondes à 95 8C, 15 secondes à 58 8C et 15 secondes à 72 8C, et une étape finale de refroidissement 3. Résultats Parmi les 253 prélèvements de sang total testés à l aide des techniques de PCR en temps réel de référence et des techniques LC480, 174 étaient positifs dans les deux techniques et 55 étaient négatifs, ce qui correspond à une concordance globale de 90,5 % entre les deux techniques. Les concordances respectives pour les techniques CMV, EBV, HHV-6 et BKV étaient 93,5, 87,5, 87 et 100 % (Tableau 2). Les 24 (9,5 %) résultats discordants correspondaient à des prélèvements comportant de faibles charges virales, Tableau 2 Comparaison des méthodes de PCR en temps réel de référence et LC480 pour la détection des génomes du CMV, de l EBV, du HHV-6 et du BKV dans les prélèvements de sang total. Virus Méthode de référence Méthode LC480 Total Positif Négatif CMV Positif (85 %) Négatif (15 %) Total 53 (85 %) 9 (15 %) 62 (100 %) EBV Positif (67 %) Négatif (33 %) Total 63 (61 %) 41 (39 %) 104 (100 %) HHV-6 Positif (83 %) Négatif (17 %) Total 37 (70 %) 16 (30 %) 53 (100 %) BKV Positif (76 %) Négatif (24 %) Total 26 (76 %) 8 (24 %) 34 (100 %)

4 168 D. Boutolleau et al. / Pathologie Biologie 58 (2010) Fig. 1. Comparaison des charges virales dans le sang total obtenues avec les techniques de référence et LC480. Les données correspondent aux prélèvements pour lesquels les résultats étaient positifs avec les deux techniques. A. Corrélation entre les charges virales CMV, EBV, HHV-6 et BKV obtenues par quantification des génomes viraux avec les techniques de référence et les techniques LC480. B. Représentations de Bland-Altman pour les techniques de PCR en temps réel CMV, EBV, HHV-6 et BKV. Pour chaque graphique, l axe des abscisses (x) représente la moyenne des valeurs (log copies/ml de sang total) obtenues avec la technique de référence et la technique LC480 pour chaque prélèvement et l axe des ordonnées (y) représente la différence entre les valeurs (log copies/ml de sang total) obtenues avec les deux techniques. Les lignes horizontales représentent la différence moyenne (ligne pleine) plus ou moins 1,96 déviation standard (pointillés).

5 D. Boutolleau et al. / Pathologie Biologie 58 (2010) inférieures à 2,7 log (500 copies/ml), quel que soit le virus étudié. Pour chaque virus, les résultats quantitatifs obtenus par les deux techniques (référence et LC480) ont été comparés à l aide du test de corrélation de Spearman. Une corrélation statistiquement significative a été mise en évidence, avec des coefficients de corrélation (Rho) de 0,98, 0,85, 0,92 et 0,87 pour le CMV, l EBV, le HHV-6 et le BKV, respectivement (p < 0,0001) (Fig. 1A). Les représentations de Bland-Altman n ont pas mis en évidence de différence significative entre les deux techniques pour chaque virus étudié. En effet, les moyennes des différences des charges virales (Dlog [technique LC480/technique de référence]) étaient globalement comprises entre 0,07 et 0,19 : 0,07 (1,96 déviation standard [DS] : 0,45 à 0,31) pour le CMV ; 0,15 (1,96 DS : 0,90 à 1,19) pour l EBV ; 0,06 (1,96 DS : 0,86 à 0,98) pour le HHV-6 ; 0,19 (1,96 DS : 0,74 à 1,11) pour le BKV (Fig. 1B). L exactitude de ces nouveaux protocoles de PCR en temps réel sur LC480 a été confirmée grâce à l analyse des échantillons du QCMD Pour chaque panel de virus, la concordance entre les résultats qualitatifs obtenus avec les techniques de référence et les techniques LC480 était de 100 %. En ce qui concerne les résultats quantitatifs, les moyennes des différences des charges virales (Dlog [technique LC480/technique de référence]) étaient 0,11, 0,04, 0,04 et 0,33 pour le CMV, l EBV, le HHV-6 et le BKV, respectivement. De plus, les moyennes des différences des charges virales (Dlog) entre les résultats obtenus avec la technique LC480 et les résultats attendus par l organisme fournissant le QCMD (c est-à-dire la moyenne des résultats de l ensemble des participants) étaient comprises entre 0,41 (HHV-6) et 0,61 (EBV). La composition détaillée de chacun des panels du QCMD inclus dans cette étude est disponible sur le site officiel du QCMD : 4. Discussion À ce jour, seulement quelques applications du LC480 dans le domaine du diagnostic virologique moléculaire, concernant notamment les papillomavirus ou les virus respiratoires, ont été décrites [8 10].Notre étude avait pour but d évaluer les performances de la plate-forme de PCR en temps réel LC480 dans le contexte de l activité de routine d un laboratoire de virologie pour le diagnostic et le suivi des infections virales opportunistes fréquemment rencontrés chez les patients au cours de la période post-greffe d organe solide ou de cellules souches hématopoïétiques et ce en utilisant à la fois des prélèvements de sang total et des contrôles de qualité (QCMD). Dans un premier temps, de nouveaux protocoles de PCR en temps réel pour le CMV, l EBV, HHV-6 et le BKV ont été adaptés sur le LC480 à partir de techniques précédemment décrites dans la littérature [4 7]. La composition du mélange réactionnel ainsi que le programme d amplification sur le LC480 étaient identiques pour chacun des protocoles, ce qui permet la détection et la quantification moléculaire des quatre virus au cours de la même technique, ce qui constitue un très grand avantage pour l activité diagnostique de routine d un laboratoire de virologie. De plus, tous les protocoles utilisaient la technologie de sonde d hydrolyse (TaqMan 1 ) qui constitue une méthode particulièrement bien adaptée à la quantification des génomes viraux. Le LC480 offre de nombreux avantages par rapport aux automates d amplification utilisés pour les techniques de référence : l utilisation de microplaques réactionnelles de 96 puits à la place des carrousels comprenant 32 capillaires sur les LC1.5 (Roche Diagnostics) permet d analyser simultanément un plus grand nombre d échantillons, et le temps total d amplification de 80 minutes au lieu de 120 minutes avec l ABI PRISM (Applied Biosystems) permet de réduire le délai d obtention des résultats. En comparaison avec les techniques de référence du laboratoire, la concordance des résultats obtenus sur les prélèvements de sang total avec les protocoles mis en place sur le LC480 était très bonne (90,5 %). En termes de charges virales, quel que soit le virus étudié, une forte corrélation a été observée entre les deux techniques, le coefficient de corrélation de Spearman étant compris entre 0,85 et 0,98, sans décalage significatif au regard des représentations de Bland-Altman. Les quelques résultats discordants correspondaient à de faibles charges virales, inférieures à 2,7 log (soit 500 copies/ml), sans conséquence significative en termes de diagnostic virologique ou de prise en charge thérapeutique des patients [4,11 13]. Les données obtenues pour les 44 échantillons du QCMD 2008 ont confirmé ces résultats avec une concordance de 100 % pour la détection des génomes viraux et des moyennes des différences des charges virales obtenues avec les techniques de référence et LC480 comprises entre 0,11 et 0,33. De plus, les résultats obtenus avec les protocoles LC480 étaient similaires à ceux attendus par l organisme du QCMD. En conclusion, la plate-forme de PCR en temps réel LC480, couplée à l automate MagNA Pure Compact pour l extraction de l ADN, constitue un système parfaitement adapté à l activité hospitalière d un laboratoire de virologie pour le diagnostic et le suivi des infections virales opportunistes chez les patients greffés par la mesure des charges virales CMV, EBV, HHV-6 et BKV dans les prélèvements de sang total. 5. Conflits d intérêts Les auteurs de ce manuscrit n ont aucun conflits d intérêts. Remerciements Nous remercions Nicolas Brunet et Florence Corne de la société Roche Diagnostics pour leur aide et leur assistance. Références [1] Razonable RR, Paya CV. Herpesvirus infections in transplant recipients: current challenges in the clinical management of cytomegalovirus and Epstein-Barr virus infections. Herpes 2003;10:60 5. [2] De Bolle L, Naesens L, De Clercq E. Update on human herpesvirus 6 biology, clinical features, and therapy. Clin Microbiol Rev 2005;18: [3] Randhawa P, Brennan DC. 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