Depuis la mise sur le marché de la ciclosporine (CsA)

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1 Approche globale du dosage des principaux immunosuppresseurs Place de la LC-MS et de la LC- Determination of immunosuppressive drugs and analytical approaches for liquid chromatography using MS or detection Christian Lacroix, Gérard Bodin, Jean-Pierre Goullé* Résumé L immunoanalyse a représenté jusqu à aujourd hui la méthode de référence de la détermination en routine hospitalière des médicaments immunosuppresseurs. Son prix de revient, compte tenu des spécificités physico-chimiques et s de ces substances, en est coûteux. L avènement du couplage de la spectrométrie de masse en tandem à la chromatographie liquide (LC-), dans des configurations accessibles à la mise en production d analyse de routine, autorise un transfert technologique pour l ensemble de la pharmacologie-toxicologie, particulièrement efficient dans le cas des immunosuppresseurs. Mots-clés : Immunosuppresseurs Dosage Chromatographie liquide Spectrométrie de masse. S u m m a ry Over the past decades, immunoassays represented the gold standard for routine analysis of drugs such as immunosuppressants. Specific considerations regarding analytics and physico-chemical properties resulted in high costs. The access to the recent powerful LC- technology allowed a technological transfer in routine use for drug analysis, especially promising in case of immunosuppressive drugs. Keywords: Immunosuppressants Analytical determination Liquid chromatography Mass spectrometry. * Laboratoire de pharmacocinétique et de toxicologie, groupe hospitalier du Havre, Le Havre. Depuis la mise sur le marché de la ciclosporine (CsA) en 1980, le nombre des immunosuppresseurs (IS) s est étoffé avec l apparition du tacrolimus (TAC), de l acide mycophénolique (MPA), du sirolimus (SRL) et, plus récemment, de l évérolimus (EVE). Le suivi thérapeutique pharmacologique par immunoanalyse (EMIT, FPIA, MEIA, etc.) accessible pour ces différents IS implique l acquisition de multiples coffrets réactifs coûteux. De plus, actuellement, les différents dosages ne peuvent être réalisés sur le même automate et nécessitent presque tous un prétraitement de l échantillon. La conjugaison de ces différents problèmes obligera vraisemblablement un regroupement de ces analyses sur des laboratoires centraux. Envisager une nouvelle approche du dosage des IS devient possible, sous certaines conditions, par chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse tandem (LC-), entraînant : un coût identique ou inférieur à celui des techniques semiautomatiques l obligation pour les biologistes d aborder une technique récente et plus sophistiquée une remise en question partielle de l organisation du laboratoire. En effet, l utilisation de l -UV, appliquée aux IS, comporte de nombreuses difficultés : la CsA présente une faible absorption UV et nécessite une détection à une longueur d onde de 200 à 210 nm. Les extractions liquide-liquide ou liquide-solide sont délicates la phase chromatographique est souvent longue mais nécessaire afin d éviter les interférences pour le TAC, le problème se complique puisque, à ces deux inconvénients, s ajoutent des concentrations thérapeutiques très inférieures (5 à 15 ng/ml) à celles de la CsA. Deux techniques ont été décrites avec une détection à 205 nm ou 214 nm et une chromatographie de, respectivement, 32 et 44 mn. C est pourquoi l une des premières techniques ayant fait l objet d une publication a directement utilisé la LC/MS avec une interface particulebeam (1) si les concentrations thérapeutiques de SRL et de EVE avoisinent celles du TAC, ces deux composés ont l avantage de présenter une absorption à 278 nm. Cette propriété a été 16

2 mise à profit pour le dosage UV du SRL (2), mais toujours au prix de longues phases d extraction et de chromatographie (environ 30 mn) compte tenu de la récente apparition du EVE, dont la concentration cible thérapeutique est encore plus faible, et des progrès s, la plupart des techniques de dosage de ce composé font appel à la LC/MS (3) et plus récemment à la LC- (4) les concentrations sanguines du MPA sont de plusieurs milligrammes par litre et les techniques LC/UV s avèrent suffisantes après une simple déprotéinisation, même si certains auteurs utilisent une extraction liquide-liquide ou par SPE. Immunosuppresseur et LC-MS La LC/MS a donc représenté une évolution notable par sa spécificité et une meilleure limite de quantification. Toutefois, le gain de temps appréciable de la partie chromatographique n écarte pas totalement la phase d extraction, qu elle soit liquide-liquide ou liquide-solide. À titre d exemple, les différentes étapes de la technique d extraction du SRL et du TAC développée dans notre laboratoire sont les suivantes : hémolyse du sang total par de l eau extraction par un mélange de solvants du méthyl-ter-butyléther/chlorobutane/méthanol agitation centrifugation évaporation de la phase organique reprise du résidu sec par la phase mobile injection de 10 µl de la phase aqueuse sur une Hypersil BDS-C18 (100 x 2,1 mm, 5 µm) en électrospray mode positif, un débit de 250 µl/mn et un split de 1/5 à l entrée du détecteur les temps de rétention sont de 7,2 mn pour le TAC, de 8,5 mn pour le SRL, de 9,3 mn pour l étalon interne (desméthoxyrapamycine) après 13 mn, augmentation du gradient en méthanol jusqu à 95 % pendant 3 mn en fin d analyse afin d éluer les substances parasites et d effectuer le retour aux conditions initiales. L injection d un échantillon nécessite donc 16 mn de chromatographie, soit le tiers environ d une chromatographie avec détection UV, mais sans pour autant raccourcir la phase préchromatographique de façon significative. Immunosuppresseur et LC- La LC- représente une avancée plus intéressante encore par la simplification des protocoles d extraction et la quasiabsence de chromatographie. Plusieurs solutions peuvent être envisagées : l extraction liquide, décrite précédemment, avec une prise d essai réduite à 50 ou 100 µl, et la diminution du volume de la phase organique d extraction permettent d écourter les étapes d agitation et d évaporation une déprotéinisation de l échantillon (sulfate de zinc et méthanol) suivie de l injection directe du surnageant (5) simplifie également cette première phase. Dans ces conditions, la limite de quantification est de l ordre de 1 ng/ml. Toutefois, cette concentration représente la limite de cette méthode, car toute injection d un plus grand volume se traduit par l augmentation concomitante du bruit de fond et une diminution de la durée de vie de la. Cette solution doit néanmoins être prise en compte du fait de son extrême simplicité le procédé qui tend à se développer actuellement combine déprotéinisation et concentration-purification de l échantillon en ligne. Cette technique nécessite des vannes de commutation et apparaît dans les articles scientifiques sous différentes dénominations : Quantification of IS by turbulent flow chromatography combined with MS-MS (quantification par après chromatographie en flot turbulent) ou Quantification by means of high-speed and robust on-line solid phase extraction (quantification en ligne en phase solide robuste et à haute vitesse) ou high-throughput analysis of IS (analyse à haute cadence). L injection des échantillons biologiques (éventuellement déprotéinisés lorsqu il s agit de sérum, de plasma ou de sang total ou simplement dilués pour des échantillons urinaires) et la concentration-purification se font sur une de nature variable, souvent un copolymère macroporeux de dérivé du poly-divinylbenzène, d une granulométrie importante (25 à 50 µm). Ces s présentent une forte rétention des substances hydrophiles et lipophiles et supportent parfaitement les ph acides et basiques. Cette granulométrie, alliée à une phase mobile aqueuse circulant à débit élevé (2 à 5 ml/mn), permet l élution des grosses biomolécules, des minéraux et la rétention des substances à quantifier. Après une phase de purification de l échantillon, la vanne de commutation permet d éluer les IS (ou autres composés) à contre-courant (back-flush) et de les quantifier en. Il peut s agir d une élution ou en mode gradient si une chromatographie s avère nécessaire. Dans le cas des IS, l élution est obtenue après un rapide gradient de 5 % à 95 % de méthanol et d acétate d ammonium qui améliore la focalisation des composés sur la. Ce gradient est suivi d un plateau de 2 mn à 95 % de méthanol-acétate d ammonium. La déprotéinisation préalable de l échantillon sanguin par du sulfate de zinc et du méthanol peut entraîner un phénomène de suppression d ions d environ 30 % pour les différents IS si le surnageant est injecté directement. En revanche, l utilisation d une concentration-purification en ligne et d une chromatographie même réduite évite ce phénomène et donne un recouvrement voisin de 100 % pour l ensemble de ces composés. Dans ces conditions, la présence d un étalon interne (32-desméthoxyrapamycine) ne revêt pas un caractère indispensable dans la quantification mais constitue un marqueur du bon enchaînement des différentes étapes. Différentes configurations sont possibles en fonction du matériel et des évolutions futures de la préparation en ligne : 17

3 2 ml/mn 1 canal 95 % H 2 O 5 % MeOH 1 mn Figure 1. Version n 1 : pompe 1 canal. mel-s5-t5-c150-ev5 Préparation on-line avec une étape de lavage. Chargement et purification de l échantillon à 4 ml/mn (95 % d eau-5 % MeOH). Évérolimus 5 ng/ml Tacrolimus 5 ng/ml Sirolimus 5 ng/ml Ciclosporine 150 ng/ml 4 ml/mn 2 canaux 100 % H 2 O 1 mn 95 % H 2 O 5 % MeOH 1 mn (- vol. morts) Figure 3. Version n 3 : pompe 2 canaux. 2 ml/mn 100 % H 2 O vanne 2 Figure 2. Version n 2 : 2 pompes. recyclage permanent 95 % H 2 O-5 % MeOH 975,5 > 90 1,39 821,63 > 768 2,39 931,5 > 86 1, > 12 2,30 Figure 4. Exemple de chromatogramme des 4 immunosuppresseurs. 18

4 Réponse Figure 5. Chromatogramme d extraits sanguins déprotéinisés surchargés en évérolimus. Évérolimus avec étalon interne Figure 6. Blancs correspondants. Évérolimus 2,23 ng/ml Blanc sang total Nom de substance : évérolimus Coefficient de corrélation = 0,998487, 2 = 0, Courbe de calibration : 0, , Type de réponse : étalon interne (ref1), surface* (I8 Conc. / I8 Area) Type de courbe : linéaire zéro : non, pondération 1/x. ng/ml 975,5 > 908,5 1,50e3 975,5 > 908,5 1,50e3 Temps version n 1 : Version la plus simple (figure 1) : une pompe débite une phase mobile composée d eau et de méthanol (5 %) qui assure la concentration et la purification de l échantillon sur la préparative. Après une minute, la rotation de la vanne permet l élution des composés vers la. La purification de l échantillon biologique est fonction de la concentration en méthanol, mais cette concentration ne peut être indéfiniment augmentée sous peine d entraîner des précipitations lors de l injection de l échantillon. 19

5 version n 2 : Cet inconvénient peut être surmonté par l utilisation de deux pompes séparées de purification (figure 2), mais cela nécessite alors deux vannes de commutation. Dans ce cas, la concentration en méthanol du solvant délivré par la deuxième pompe peut être augmentée (mais sans pour autant éluer les composés à doser), puisque la première phase aqueuse a éliminé la plupart des biomolécules et des minéraux. Ces deux versions ne nécessitent pas de connexion entre les pompes annexes et la LC-. version n 3 : Cette version (figure 3) utilise les différents canaux d une pompe connectée à la LC- (synchronisation du départ). Le changement des phases mobiles de purification est géré par le programmateur de cette pompe annexe. Les temps de passage des différentes phases devront être corrigés du volume mort, et l amortisseur de pulsation shunté (source importante de volume mort). L appareil comporte une vanne de communication supplémentaire (10 voies) gérées par la LC- dont le rôle est de mettre l en série avec les pompes préparatives ou la pompe de la LC-. Il est alors possible d enchaîner des préparations en ligne et des injections conventionnelles. Les figures 4, 5 et 6 représentent les chromatogrammes des quatre immunosuppresseurs (les deux inhibiteurs de la calcineurine CsA et TAC et les deux rapamycines SRL et EVE) sur des prélèvements sanguins déprotéinisés, la réponse obtenue en fonction des concentrations de EVE (2 à 36 ng/ml) et un exemple de EVE (2,23 ng/ml) avec le blanc correspondant. La préparation en ligne des échantillons permet un rythme élevé d analyse. Cette grande rapidité est rendue possible par la puissance d acquisition et la spécificité de la. Celle-ci autorise en outre le développement ou l adaptation très rapide de nombreuses applications, ce qui est attesté par le nombre croissant des travaux publiés dans ce domaine. R é f é r e n c e s b i b l i o g r a p h i q u e s 1. Gonschior AK, Christians U, Winkler M et al. Simplified high-performance liquid chromatography-mass spectrometry assay for measurement of tacrolimus and its metabolites and cross-validation with microparticle enzyme immunoassay. Ther Drug Monit : Holt DW, Lee T, Johnston A. Measurement of sirolimus in whole blood using high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection. Clin Ther (Suppl.B):B Segarra I, Brazelton TR, Guterman N et al. Development of a high-performance liquid chromatographic-electrospray mass spectrometric assay for the specific and sensitive quantification of the novel immunosuppressive macrolide 40-O-(2- hydroxyethyl) rapamycin. J Chromatogr B Biomed Sci Appl : Salm P, Taylor PJ, Lynch SV et al. Quantification and stability of everolimus (SDZ RAD) in human blood by high-performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl : Keevil BG, McCann SJ, Cooper DJ, Morris MR. Evaluation of a rapid micro-scale assay for tacrolimus by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Ann Clin Biochem : BANDO FMC REVUE-L-pant.indd 1 19/03/08 17:07:29