STANDARDISATION DE LA VITAMINE D : LA FIN DU PROBLÈME? DR PATRICIA PANAÏA-FERRARI, CHU DE NICE FORUM IMMUNOANALYSE SIEMENS PARIS, 30 MAI 2013

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1 STANDARDISATION DE LA VITAMINE D : LA FIN DU PROBLÈME? DR PATRICIA PANAÏA-FERRARI, CHU DE NICE FORUM IMMUNOANALYSE SIEMENS PARIS, 30 MAI 2013

2 ETAT DES LIEUX Il est largement connu que la 25-OHD est un analyte difficile, à cause de : sa nature hydrophobe ses différentes formes moléculaires, sa liaison étroite à sa protéine porteuse, la vitamin D-binding protein (VDBP) Et l absence de matériel de référence, et/ou d une méthode de référence qui permettrait aux autres techniques de s y comparer

3 Oxygène Hydrogène Carbone LA VITAMINE D EST HAUTEMENT HYDROPHOBE

4 CHOLÉCALCIFÉROL ET ERGOCALCIFÉROL!

5 LA VITAMINE D EST ENCAPSULÉE ET ÉTROITEMENT LIÉE A LA VDBP 25(OH)D 3 Sillon hydrophobe OH en C25 * Interprétation artistique basée sur Verboven et al. Nat Struc Biol. 2002;9(2):131-6

6 MAIS QU EST-CE QUE LE 3-ÉPI-25(OH)D 3? Jusqu à 61 % de la VitD totale de 100 % des enfants < 1 an (moyenne = 11,1 27,8 %) a, b, c Jusqu à 20 % de la VitD totale de 100 % des enfants < 18 ans (moyenne = 6,2 %) b Jusqu à 17 % de la VitD totale de 100 % des adultes (moyenne = 3,5 %) b, c, d 3-épi-25(OH) vitamine D 3 a. Singh, et al. J Clin Endo Metab. 2006;91: b. Van den Ouweland, et al. Clin chem. 2011;57(11): c. Stepman, et al. Clin ChemLab Med. 2011; 49(2): d. Lensmeyer, et al. J Clin Endo Metab. 2012;97(1):163-8.

7 UN PEU D HISTOIRE 4 types de méthodes sont couramment utilisées pour mesurer la 25-OHD. 2 sont immunologiques La pionnière, en 1970, par compétition dans laquelle la VDBP sert d agent de capture après extraction par un solvant organique Haddad JG, Chyu KJ. Competitive protein-binding radioassay for 25- hydroxycholecalciferol. J Clin Endocrinol Metab 1971;33: En 1985, par compétition dans laquelle un anticorps spécifique anti 25-OHD sert d agent de capture (RIA, puis EIA et CLIA)

8 UN PEU D HISTOIRE 2 sont des méthodes physiques : L HPLC (high pressure liquid chromatography) En 2004, la LC-MS/MS (liquid chromatography-tandem mass spectrometry) 2 procédures de mesure en LC-MS/MS ont été reconnues récemment comme technique de référence par le Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM) Tai SS, Bedner M, Phinney KW. Development of a candidate reference measurement procedure for the determination of 25-hydroxyvitamin D3 and 25- hydroxyvitamin D2 in human serum using isotope-dilution liquid chromatographytandem mass spectrometry. Anal Chem 2010;82: Stepman HC, Vanderroost A, Van Uytfanghe K, Thienpont LM. Candidate reference measurement procedures for serum 25-hydroxyvitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D2 by using isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrome- try. Clin Chem 2011;57:441 8.

9 LA RMP Stepman HC, Vanderroost A, Van Uytfanghe K, Thienpont LM. Candidate reference measurement procedures for serum 25-hydroxyvitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D2 by using isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chem 2011;57:441 8.

10 MAIS AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS Les techniques automatisées qui ont forcément abandonné la phase d extraction par solvant organique ou la précipitation des protéines pour libérer la 25 OH D de la VDBP sont : Largement utilisées (LIAISON ) Techniquement faciles Mais Plus sensibles aux variations de concentration de la VDBP Plus sensibles à l effet matrice Réactions croisées avec les métabolites? Le 3-épi-25-OHD3 ou la 24,25-(OH)2D (> 12 nmol/l!)

11 MAIS AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS Heijboer A. et al, Clinical Chem 58:3, (2012)

12 MAIS AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS DiaSorin LIAISON Vitamine D Totale

13 Equimolarité et réactions croisées du test ADVIA Centaur Vitamin D Total (VitD)

14 MAIS AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS Les techniques physiques qui ont une phase d extraction, peuvent : Etre semi ou complètement automatisées Séparer 25 OH D2 et 25 OH D3 Mais Équipement et équipe hyper spécialisés Techniquement plus longues Réaction croisée avec le 3-épi-25-OHD3 sauf si étape préalable mais encore plus long et plus lourd!

15 Résultats des DEQAS 404 et 405 (405 = épi-25OHD3) Source : DEQAS REVIEW 2012 Vitamin D External Quality Assessment Scheme (DEQAS).

16 Chromatogramme de la VD et analogues Shah et al. Chemistry Central Journal 2012, 6:112

17 ENFIN Les habitudes de prescription sont très différentes d un continent à l autre, d un pays à l autre : Aux Etats-Unis, seule la 25 OH VD 2 est prescrite Alors qu'en Allemagne, c est uniquement de la 25 OH VD3 Et en France, on a les 2! Donc que faut-il doser et comment?

18 LE NIST

19 LE NIST Le National Institutes of Health Office of Dietary Supplements (ODS) et le Department of Commerce National Institute of Standards and Technology (NIST) annonce la disponibilité d un standard de référence pour le dosage de la vitamine D, le SRM 972 et le SRM pools de sérums humains (niveaux 1 à 4) avec des taux variables de 25(OH)D Le SRM 972 certifie des valeurs pour la 25(OH)D2, la 25(OH)D3 et le 3-épi-25(OH)D3

20 LE SRM 972 Niveau 1 : sérum humain normal, non dénaturé Niveau 2 : obtenu en diluant le Niveau 1 avec du sérum de cheval pour obtenir une concentration basse en 25(OH)D Niveau 3 : sérum humain normal, surchargé avec de la 25- OH D2 Et le Niveau 4 : sérum humain normal, surchargé avec du 3- épi-25-hydroxyvitamine D3

21 LE SRM 2972 LE CALIBRANT Validation of two candidate reference measurement procedures based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry for separate measurement of 25- hydroxyvitamin D 3 and D 2 in human serum. An VANDERROOST,Master of Industrial Pharmacy Promoter: Prof. Dr. L. Thienpont

22 LE SRM 972 Validation of two candidate reference measurement procedures based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry for separate measurement of 25- hydroxyvitamin D 3 and D 2 in human serum. An VANDERROOST,Master of Industrial Pharmacy Promoter: Prof. Dr. L. Thienpont

23 LE SRM 972 OUPS! 3 sur 4 SRM 972 sont, soit surchargés en substances exogènes, soit dilués avec du sérum équin, donc non utilisables comme standards de référence par la plupart des techniques immunologiques automatisées : Effet matrice Pas de dosage du 3-épi-25-OH D3 pour la plupart Nivaux de valeurs? => ce n est pas un vrai étalon au regard des critères de l OMS

24 MAIS AUSSI 2 procédures de mesure en LC-MS/MS ont été reconnues récemment comme technique de référence par le Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM) Tai SS, Bedner M, Phinney KW. Development of a candidate reference measurement procedure for the determination of 25-hydroxyvitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D2 in human serum using isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Chem 2010;82: Stepman HC, Vanderroost A, Van Uytfanghe K, Thienpont LM. Candidate reference measurement procedures for serum 25-hydroxyvitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D2 by using isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chem 2011;57:441 8.

25 MAIS LE VDSP ARRIVE! Le Vitamin D Standardization Program (VDSP) novembre 2010 : Sous l égide de l US Office of Dietary Supplements, du National Institutes of Health (NIH) en collaboration avec les US Centers for Disease Control and Prevention (CDC), le National Center for Environmental Health (NCEH), l US National Institute of Standards and Technology (NIST) et la Belgian Laboratory for Analytical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Ghent university Federal Register/Vol. 76, No. 41/Wednesday, March 2, 2011/Notices Sont inclus dans cette enquête : le Canada, l Australie, les USA, le Mexique, l Allemagne, l Irlande, la Corée du Sud et le Royaume-Uni Les sociétés DiaSorin, IDS et des LC-MS/MS Le CAP (College of American Pathologist) et le DEQAS LA RMP = isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry (L. Thienpont, Clin Chem 2011;57:441 8)

26 MAIS LE VDSP ARRIVE! Standardiser le dosage de la 25(OH)D à partir d enquêtes de santé publique en utilisant la nouvelle technique de référence développée par le NIST et l Université de Gand et évaluer les différences obtenues Associer à ces enquêtes les fabricants de réactifs, les cliniciens et les chercheurs Promouvoir la standardisation et le dosage des nouveaux métabolites pour évaluer le statut en vitamine D Et donner la possibilité d utiliser ces nouvelles valeurs de référence pour la prise en charge des patients et les programmes de santé publique

27 LE VDSP 2 étapes : calibration et validation/certification étape 1: 40 sera avec des valeurs établies Vérification de la corrélation et de la précision de la technique et ajustement de la calibration si nécessaire étape 2 : la calibration établie est vérifiée par l envoi de 10 échantillons de sérum en aveugle tous les 3 mois La comparaison de méthode et l estimation du biais sont étudiées selon les procédures décrites dans le CLSI EP9-A2 "Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples." Le laboratoire est standardisé si le biais observé est de +/-5,0 % et l imprécision 10,0 %, après les 4 campagnes 15 participants

28 Des premiers résultats Evaluation of Vitamin D Standardization Program protocols for standardizing serum 25-hydroxyvitamin D data: a case study of the program's potential for national nutrition and health surveys. Cashman et all, Am J Clin Nutr 2013 Jun;97(6): The VDSP reference system and protocols were applied to ELISA-based serum 25(OH)D data from the representative NANS sample (n = 1118). RESULTS: Year-round prevalence rates for serum 25(OH)D concentrations <30, <40, and <50 nmol/l were 6.5%, 21.9%, and 40.0%, respectively, via original ELISA measurements and 11.4%, 25.3%, and 43.7%, respectively, when VDSP protocols were applied. Differences in estimates at <30- and <40-nmol/L thresholds, but not at the <50-nmol/L threshold, were significant (P < 0.05). A reanalysis of all serums by using LC-tandem MS confirmed prevalence estimates as 11.2%, 27.2%, and 45.0%, respectively. Prevalences of serum 25(OH)D concentrations >125 nmol/l were 1.2%, 0.3%, and 0.6% by means of ELISA, VDSP protocols, and LC-tandem MS, respectively.

29 Du nouveau avec le DEQAS participants dans 52 pays (en janvier 2013) A compter d avril 2013 : Les valeurs de chaque échantillon sont obtenues après mesure avec la NIST RPM En plus du résultat Total 25-OHD (25-OHD OHD2) chaque participant reçoit les valeurs du NIST pour chaque métabolite séparément 25-OHD3, 25-OHD2 et 3-épi-25-OHD3 Les échantillons sont des sera natifs non dénaturés et sans surcharge afin de ne pas «léser» les méthodes automatisées

30 Messages clés La dispersion relevée entre les fabricants peut être due aux différences dans la façon dont les systèmes des fabricants dosent la vitamine D, tels que les différents procédés utilisés pour libérer la vitamine D de sa protéine de transport ainsi que les interférences hétérophiles Puisqu il n existe pas de matériel reconnu au niveau international comme un matériel de référence, des biais au niveau des pentes peuvent être observés selon les différents fabricants et méthodes Le matériel du NIST n est pas un "standard" et les utilisateurs de LC- MS/MS peuvent s y être standardisés de manière différente Le VDSP est une étape importante pour tenter d harmoniser les résultats de vitamine D quelque soit les fabricants et les méthodes

31 EN CONCLUSION Un nouveau standard, une nouvelle technique de référence mais : Doit on doser le 3-épi-25 OH D3? De 3 à 5 %, voire 50 % Importance en pédiatrie et chez l adulte? Rôle physiologique? Nouvelles valeurs de référence? Nouvelles pratiques thérapeutiques?

32 Principales caractéristiques du test ADVIA Centaur Vitamin D Total (VitD) Dosage «total» (D 2 + D 3 ) et équimolaire Utilisation d un Ac monoclonal «maison» anti-25(oh)d Dosage par compétition en 18 mn Sensibilité fonctionnelle à 3,33 ng/ml Standardisé sur une LC/MS/MS américaine, indépendante Corrélé à la RIA et au LIAISON (DiaSorin) Réajustement de la standardisation opéré en septembre 2012 Impliqué dans le Vitamin D Standardization Program (VDSP) mené par le CDC

33 Principales caractéristiques du test ADVIA Centaur Vitamin D Total (VitD) Type d échantillons Prise d essai échantillon Domaine de mesure Limite du blanc (LdB) Sensibilité fonctionnelle Durée du test Stabilité à bord Fréquence de calibration en 2 points Conditionnement Sérum, plasma (héparine, EDTA) 20 µl 3,7 150 ng/ml 1,60 ng/ml 3,33 ng/ml 18 mn 28 jours / 100 tests 28 jours 100 / 5 x 100 tests

34 Format du test ADVIA Centaur Vitamin D Total (VitD) 4,5 mn 2,75 min 6,5 mn 4,0 mn 20 µl d échantillon µl d agent de relargage PMPα- FITC Lavage EA C22 VD + Fl Acide/Base Résultat 25(OH) vitamine D 2 C22 VD 25(OH) vitamine D 3

35 DOSAGE DE LA 25(OH) VITAMINE D RÉSULTATS DU DEQAS, AVRIL 2012 DEQAS April OHD Method Means (+/- 1SD) for Major Method Groups Hydroxyvitamin D nmol/l Sample 411 Sample 412 Sample 413 Sample 414 (excluded) Sample 415 Abbott (n=51) DiaSorin Liaison (n=366) DiaSorin RIA (n=24) IDS auto EIA (n=95) IDS EIA (n=118) IDS isys (n=139) IDS RIA (n=11) Roche Total (n=81) Siemens (n=57) HPLC (n=30) LC-MS (n=134) ALTM (n=1119)

36 DOSAGE DE LA 25(OH) VITAMINE D RÉSULTATS DU DEQAS, OCTOBRE 2012 DEQAS October OHD Method Means (+/- 1SD) for Major Method Groups Hydroxyvitamin D nmol/l Sample 421 Sample 422 Sample 423 Sample 424 Sample 425 Abbott Architect (n=73) DiaSorin Liaison (n=340) DiaSorin RIA (n=18) IDS auto EIA (n=61) IDS EIA (n=97) IDS isys (n=145) IDS RIA (n=8) Roche Total (n=110) Siemens (n=55) HPLC (n=28) LC-MS/MS (n=141) ALTM (n=1086)

37 DOSAGE DE LA 25(OH) VITAMINE D RÉSULTATS DU DEQAS, JANVIER 2013 DEQAS January OHD Method Means (+/- 1SD) for Major Method Groups Hydroxyvitamin D nmol/l Sample 426 Sample 427 Sample 428 Sample 429 Sample 430 Abbott Architect (n=75) DiaSorin Liaison (n=332) DiaSorin RIA (n=17) IDS Auto EIA (n=58) IDS EIA (n=83) IDS isys (n=136) IDS RIA (n=8) Roche Total (n=117) Siemens (n=56) HPLC (n=30) LC-MS/MS (n=139) ALTM 9n=1064)

38 Evaluating the ADVIA Centaur Vitamin D Total Assay Traceable to the 25(OH)Vitamin D RMP* Study Design: 200 remnant serum samples collected from Hôpital Saint Roch, Nice, France in March Samples contained DiaSorin LIAISON values Samples were sent to Siemens Healthcare Diagnostics (Tarrytown, New York, USA) for measurement on ADVIA Centaur Vitamin D Total assay with the current standardization and the traceability to the 25(OH)vitamin D Reference Method Procedure (RMP)* *Traceable to the ID-LC/MS/MS Reference Method Procedure (RMP). The ID-LC/MS/MS is traceable to the NIST SRM 2972 This assay is in development and not available for sale. Sempos CT, et al. Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation, 2012; 72(Suppl 243): Thienpont L, et al. Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation, 2012; 72(Suppl 243): 41 49

39 Comparison of Current Standardization and 25(OH)Vitamin D RMP* Traceability Versus DiaSorin LIAISON R=0.94 R=0.92 *This assay is in development and not available for sale.

40 25(OH)Vitamin D RMP* Non-Linear Standardization Decreases Values at Low & High Ends *This assay is in development and not available for sale.

41 ADVIA Centaur Vitamin D Total Traceable to 25(OH)Vitamin D RMP ADVIA Centaur Vitamin D Total Traceable to 25(OH)vitamin D RMP ID-LC/MS/MS 25(OH)vitamin D RMP (NIST SRM 2972) R=0.96 *Traceable to the ID-LC/MS/MS Reference Method Procedure (RMP). The ID-LC/MS/MS is traceable to the NIST SRM 2972 *This assay is in development and not available for sale. Sempos CT, et al. Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation, 2012; 72(Suppl 243): Thienpont L, et al. Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation, 2012; 72(Suppl 243): 41 49

42 Merci de votre attention!