Master de Sciences et Technologies Mention Biologie Moléculaire et Cellulaire Université Pierre et Marie Curie (Paris 6)

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1 Master de Sciences et Technologies Mention Biologie Moléculaire et Cellulaire Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) UE MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée (IF2011) 7 au 19 février 2011 Travaux Dirigés

2 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés Travaux Dirigés IF2011 TD-IF 1 : Méthode d analyse scientifique & Technologies IF2011 TD-IF 2 : Reconnaissances IF2011 TD-IF 3 : Sélections IF2011 TD-IF 4 : Migrations cellulaires IF2011 TD-IF 5 : Sujets d examen 2010 & 2009 IF2011 TD-IF 6 : Tolérance & Immunologie intégrative Université Pierre et Marie Curie

3 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF2011 TD-IF 1 : Méthode d analyse scientifique & Technologies Université Pierre et Marie Curie

4 Méthodologie d analyse scientifique: de la formulation du problème à l interprétation des résultats IF2011_TD01 Partie I : Méthodes d analyse scientifique

5 Démarche de l analyse scientifique Déterminer l état des connaissances dans le domaine Questions posées: formuler les hypothèses de travail Mise en œuvre expérimentale Résultats expérimentaux Interprétation des résultats

6 Domaine de recherche

7 1- Déterminer l état des connaissances dans le domaine Objectifs: Définir ce qui est déjà connu, ce qui a été démontré et publié Se positionner, déterminer la pertinence de la question posée Moyens: Bibliographie (articles, revues, livres), cours, données internet, données non publiées

8 Questions posées: formuler les hypothèses de travail Objectifs: Définir très précisément les questions scientifiques posées Formuler les hypothèses de travail

9 Mise en œuvre expérimentale Objectifs: Trouver les moyens expérimentaux les plus adéquats pour répondre aux questions posées - Choix des modèles expérimentaux: modèle animal, expérimentation in vivo, in vitro, cellules friches, lignées cellulaires - En général, plusieurs types d expériences possibles et nécessaires Durée de l expérience Sécurité choix Savoir-faire Coûts Equipement Disponibilité des réactifs

10 Résultats expérimentaux - Obtention des données expérimentales brutes - Validation des contrôles positifs et négatifs - Reproductibilité de l expérience - Mise en forme des données: représentation graphique (tableau, graphes ) - Analyse des résultats et interprétation - Statistiques, significativité

11 Interprétation des résultats La lecture des résultats: - Les résultats obtenus sont-ils interprétables? - Permettent-ils de répondre à la question posée? oui Etape suivante: Que conclure des résultats obtenus? Perspectives de travail: définir les manipes suivantes à réaliser pour répondre à des questions complémentaires non Pourquoi? Problème expérimental technique? Problème avec les contrôles? Hypothèse de départ fausse?

12 Et pour les TD Enoncé: - Lire l énoncé dans son intégralité avant de commencer - Déterminer la problématique principale de l exercice Expériences: - A partir de l énoncé et de la légende de la figure présentée, réaliser un schéma expérimental - Bien comprendre l expérience réalisée et la méthodologie mise en oeuvre - Quelle technique a été utilisée? - Connaissez-vous le principe de cette technique?

13 Et pour les TD Lecture des figures: - Bien comprendre la figure, ce qu elle représente - Bien lire les axes, échelles - Regarder en premier les résultats obtenus avec les contrôles - Visualiser les résultats obtenus avec les échantillons d intérêt Conclusions: - Que peut-on conclure de l expérience? - Les résultats sont-ils interprétables? - Sont-ils significatifs?

14 Techniques d étude des réponses immunitaires IF2011_TD01 Partie II : Techniques d étude des réponses immunitaires

15 Techniques de phénotypage Détection de marqueurs Isolation de populations cellulaires Analyse des répertoires Caractérisation / Identification Analyse des voies de signalisation Analyse prolifération / cycle cellulaire / Apoptose Production cytokines / facteurs solubles Analyse des fonctions effectrices Utilisation de modèles de souris Activation / Fonction Contexte physiopathologique

16 Caractérisation / Identification cellules et populations cellulaires Cytométrie en flux: marquages extracellulaires / intracellulaires Tri magnétique ou par cytométrie en flux de populations cellulaires Immunohistochimie Microscopie à fluorescence Analyse des répertoires: immunoscope

17 Cytométrie en flux : marquages extracellulaires et intracellulaires

18 Cytométrie en flux : marquages extracellulaires et intracellulaires Protéines intracellulaires (cytokines, enzymes ) Structures intracellulaires (cytosquelette, ADN ) Récepteurs, protéines membranaires, protéines d adhésion Produits du métabolisme cellulaires (NO, Ca 2+ ) Molécules solubles

19 Cytométrie en flux : marquages extracellulaires et intracellulaires

20 Cytométrie en flux : technique des tétramères Version soluble de la chaîne lourde du CMH I synthétisée dans E.Coli Addition de la chaîne légère β2 microglobuline et du peptide synthétique conformation appropriée Couplage avec la biotine par l enzyme BirA (reconnaît un site spécifique introduit dans la partie C-term de la chaîne lourde) 4 complexes CMHI/biotine sont liés à la streptavidine La streptavidine est taggée à un fuorochrome

21 Cytométrie en flux : technique des tétramères

22 Pro5 MHC Pentamers ProImmune

23 Cytométrie en flux : Tri cellulaire

24 Tri cellulaire par tri magnétique

25 Immunohistochimie

26 Immunohistochimie Méthodes de conservation: avantages et inconvénients état du tissu morphologie système de stockage antigènes traitement du spécimen paraffine fixation du tissu dans un agent fixateur très bien conservée à température pièce donc aucun équipement spécial certains sont détruits et la majorité demande un démasquage à température ambiante Résine OCT nécessite un tissu frais moins bien conservée à -80 o C donc demande un équipement spécial aucune destruction des antigènes à -20 o C (cryostat)

27 Immunohistochimie Adenocarcinome rénal Carcinome sein (anti-her2/erbb2)

28 Immunohistochimie Immunohistochimie à «haut débit» : les Tissue Micro Array Fragments de tissus d environ 0,6 mm de diamètre obtenus de régions d intérêt de tissus inclus en paraffine (biopsies, échantillons de tumeurs) Ces fragments sont insérés et espacés de façon précise dans un bloc de paraffine selon un pattern de spots particulier Des sections de ce bloc sont coupées grâce à un microtome puis montées sur lame pour analyse

29 Immunohistochimie et immunofluorescence

30 Analyse des répertoires: Immunoscope

31 Analyse des voies de signalisation Cytométrie / Imagerie Electrophorèse/ Western blot (immunoprécipitations) Génomique / Protéomique Activation / Fonction Production de cytokines Détection de cytokines grâce à l analyse de la prolifération cellulaire ELISA / RIA ELISPOT Facs intracellulaire Prolifération/Division cellulaire/apoptose Cytométrie de flux : BrdU, EdU, CFSE, Annexin V Imagerie : DAPI Thymidine tritiée Cytotoxicité: 51Cr, FACS, LDH Fonctions effectrices Réponse anticorps: ELISPOT B, ELISA immunoglobulines sériques, tests hémaglutination

32 Le Western Blot

33 L immunoprécipitation

34 Analyse de la transduction du signal par cytométrie en flux LT 0 CD3+CD28 CD3 Lysat cellulaire + billes GST-cjun => activité JNK Marquage intracellulaire avec un Ac α jun-phosphorylé CD3+CD28 Possibilité de combiner le marquage intracellulaire avec un marquage de surface Zell, T. et al Proc Natl Acad Sci U S A 98:10805.

35 Analyse de la transduction du signal par cytométrie en flux Variation du Ca 2+ intracellulaire Mesure du Flux calcique : Sonde Fluo-3 Mesure quantitative du Calcium : Sondes excitables dans l UV - Indo-1 : modification du spectre d émission Fluorochrome libre : émission 475 nm Fluorochrome lié : émission 400 nm Mesure du ratio sonde liée / sonde libre

36 Analyse de la transduction du signal par cytométrie en flux Variation du Ca 2+ intracellulaire Ratio of Ca++: Bound Indo-1 at 390 nm Free Indo-1 at 495 nm Molecule-probe Excitation Emission Calcium - Indo nm 405, >460 nm Calcium- Fluo nm 525 nm Calcium - Fura nm >500 nm Calcium - Calcium Green 488 nm 515 nm Magnesium - Mag-Indo nm 405, >460 nm Phospholipase A- Acyl Pyrene 351 nm 405, >460 nm

37 Analyse de la transduction du signal par cytométrie en flux Fluorescent Cell Bar Coding Krutzik P et al Nat Meth :361

38 Analyse de la transduction du signal par cytométrie en flux Fluorescent Cell Bar Coding Fluorescent Cell Bar Coding Krutzik P et al Nat Meth :361

39 Analyse de la transduction du signal par cytométrie en flux Fluorescent Cell Bar Coding Krutzik P et al Nat Meth :361

40 Analyse de la transduction du signal par cytométrie en flux Fluorescent Cell Bar Coding Fluorescent Cell Bar Coding Krutzik P et al Nat Meth :361

41 Analyse de la transduction du signal par cytométrie en flux Fluorescent Cell Bar Coding Krutzik P et al Nat Meth :361

42 Imaging des cellules en flux Amnis ImageStream x

43 Imaging des cellules en flux

44 Imaging des cellules en flux Amnis IDEAS Software

45 Imaging des cellules en flux Amnis IDEAS Software

46 Les Puces à ADN

47 Analyse des voies de signalisation Cytométrie / Imagerie Electrophorèse/ Western blot (immunoprécipitations) Protéomique Génomique Activation / Fonction Production de cytokines ELISA / RIA ELISPOT Facs intracellulaire Prolifération/Division cellulaire/apoptose Cytométrie de flux : BrdU, EdU, CFSE, Annexin V Imagerie : DAPI Thymidine tritiée Cytotoxicité: 51Cr, FACS, LDH Fonctions effectrices Réponse anticorps: ELISPOT B, ELISA immunoglobulines sériques, tests hémaglutination

48 Elisa: Enzyme-linked immunosorbent assay

49 Elisa Sandwich

50 ELISPOT

51 RIA (Radio Immunoassay)

52 Cytométrie en flux pour la détection de cytokines intracellulaires

53 Cytométrie en flux pour la détection de cytokines dans le CBA surnageant (BD Biosciences) (Cytometric : Principe Beads Array) Formation permanente 2007 Y Y YYYYYYYY Anti -IL2 YYY Y YYYYY YY Anti -IL4 YYYYYYYYYYYYYYYY Anti -IL6 YYYYY YYY Anti -IL12p70 YYYYYY Y YYYYYYYYY YY YYYYYYYYY YY YYY Anti -IFNγ YYYYYYYYYYYYYYYY Anti -TNFα Y + Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Ac de DETECTION (coupl és PE) LAVAGE Y Y Y Y YYYYYYYY YYYYYYYY Y Y Y Y Y Y YYYYYYYY YYYYYYYY Y Y Y Y Anti -IL10 YYYYYYYYYYYYYYYY Anti -GM -SCF YYYYYYYYYYYYYYYY Y YYYYYYYYYYYYYYYY Y Y Y YYYYYYYY Y BILLES avec Ac de Capture :. 1 taille (7µm). 2 fluorescences FL-3 et FL -4. plusieurs intensit és par fluorescences LYSAT, SERUM ou SURNAGEANT Y Y Y Y Y Y YYYYYYYY Y Y LECTURE par Cytométrie de Flux

54 Formation permanente 2007 Cytométrie en flux pour la détection de cytokines dans le CBA surnageant (BD Biosciences) (Cytometric : Beads Principe Array) Codification des billes par clustering : Une seule taille de billes 99% de singlets (7µm) 2 couleurs de billes Matrice de billes 1 à 9 SSC FSC Fl-3 A B C D E F G H I Fl-4 IFNγ IL6 IL10 IL2 IL4 GM -CSF TNF α IL12p70 Détection de la positivit é en PE

55 Formation permanente 2007 Cytometric Bead Array (FCAP) Gammes étalons (cytokines humaines) : IL2, IL4, IL6, IL10, TNFα, IFNγ 0 pg/ml 20 pg/ml 40 pg/ml 80 pg/ml 156 pg/ml 312,5 pg/ml 625 pg/ml 1250 pg/ml 2500 pg/ml 5000 pg/ml hu IL2 hu IL4 hu IL6 hu IL10 hu TNF α hu IFN γ

56 Cytométrie en flux pour la détection de cytokines dans le surnageant (Cytometric Beads Array)

57 Analyse des voies de signalisation Cytométrie / Imagerie Electrophorèse/ Western blot (immunoprécipitations) Protéomique Génomique Activation / Fonction Production de cytokines ELISA / RIA ELISPOT Facs intracellulaire Prolifération/Division cellulaire/apoptose Cytométrie en flux : BrdU, EdU, CFSE, Annexin V Thymidine tritiée Cytotoxicité: 51Cr Fonctions effectrices Réponse anticorps: ELISPOT B, ELISA immunoglobulines sériques

58 Etude du cycle cellulaire Iodure de propidium ou Hoestch DNA Analysis G 2 M G 0 G 0 G 1 s G 1 C o u n t s G 2 M N DNA content 4N

59 Détection des acides nucléiques et analyse du cycle cellulaire Iodure de propidium : agent intercalent fluorescent de l'adn (ex: 305 nm ou 538 nm/ em: 617 nm) DAPI (4',6' Di Amidino-2-Phényl Indole) : liaison a l ADN BrdU analogue du la thymidine, s incorpore dans les cellules en division S G0/G 1 G2/M

60 Analyse de la viabilité / apoptose/ nécrose Iodure de propidium : agent intercalent fluorescent de l'adn, marque le noyau des cellules ayant perdu leur intégrité membranaire (nécrose) Annevin V : protéine cellulaire conjuguée à un fluorochrome, marque les phosphatidyl serine (PS) transloquées à la mb lors des événement précoce de l apoptose 7-AAD (7-Amino-actinomycin D) agent intercalent fluorescent de l'adn, pénètre la membrane de cellules mortes ou mourantes. Hoechst, agent intercalant fluorescent de l ADN pénètre la membrane de cellules mortes ou mourantes Tunel (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling) : ADN fragmenté, détecté par réaction de la TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) pour transférer des biotin-dutp à l ADN clivé Apoptose précoce FL1-H: AV FITC Annexin V FL3-H: 7AAD 7AAD Apoptose tardive et/ou nécrose

61 Etude de la prolifération CFSE ou CFDA-SE Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester CD45R CD80 CD86 Sydecan CD23 CD16/32 (FL1 channel) Le CFSE devient fluorescent après diffusion dans la cellule où les esterases endogènes libèrent les groupements acétate. Il devient alors fluorescent et ne diffuse plus à travers la membrane. A chaque division cellulaire, le CFSE se répartit équitablement entre les cellules filles, jusqu à 10 générations discriminables Infos sur la cinétique de prolifération et de différenciation cellulaire.

62 Analyse de la prolifération cellulaire : thymidine tritiée Tritium Incorporation de thymidine radiomarquée Quantité d ADN répliqué Radioactivité incorporée Nbre de cellules s étant divisé Quantité d ADN répliqué Nbre de cellules en mesure de se diviser au début du test Nbre de cellules s étant divisé

63 Analyse des voies de signalisation Cytométrie / Imagerie Electrophorèse/ Western blot (immunoprécipitations) Protéomique Génomique Activation / Fonction Production de cytokines ELISA / RIA ELISPOT Facs intracellulaire Prolifération/Division cellulaire/apoptose Cytométrie en flux : BrdU, EdU, CFSE, Annexin V Thymidine tritiée Cytotoxicité Fonctions effectrices Réponse anticorps: ELISPOT B, ELISA immunoglobulines sériques

64 Analyse de la cytotoxicité Plusieurs ratio effecteurs/cibles Cellules cibles marquées avec du Na 2 51 CrO 4 Addition des cellules cytotoxiques (NK, NKT, CTL ) Les cibles tuées relarguent le chrome radioactif Autres techniques de l analyse de la cytotoxicité: Cytométrie en flux: CD107 / Granzyme / Perforine / marquage cellules cible au CFSE + AV + 7AAD ELISPOT: Perforine / Granzyme

65 Contexte physiopathologique Modèles de souris Les lignées de souris consanguines Les souris immunodéficientes Les transferts adoptifs Les souris humanisées Les souris transgéniques Les souris «knock-out»

66 Les lignées de souris consanguines Obtenues par > 20 croisements frère-sœur (croisements consanguins) Le génome devient peu à peu entièrement homozygote Populations génétiquement homogènes et (assez) stables dans le temps Tous les individus sont identiques (un couple suffit à définir la lignée) Pas de variance phénotypique entre individus d origine génétique (important pour la mise en évidence de l effet d un traitement) Plusieurs centaines de lignées consanguines disponibles Certaines lignées de souris consanguines ont des propriétés particulières (exemple les souris NOD)

67 Les lignées de souris consanguines Allèles H-2 Souche protoype Autres souches avec le même haplotype Haplotype K IA IE D CBA AKR, C3H, B10.BR, C57BR k k k k k DBA/2 BALB/c, NZB, SEA, YBR d d d d d C57BL/10 (B10) C57BL/6, C57L, C3H.SW, LP, 129 b b b b b A A/He, A/Sn, A/Wy, B10.A a k k k d A.SW B10.S, SJL s s s s s A.TL tl s k k d DBA/1 STOLI, B10.Q, BDP q q q q q

68 Les lignées de souris consanguines

69 Les lignées de souris immunodéficientes Souris Nude: absence de thymus, absence de LT thymodépendants Souris SCID («Severe Combined Immunodeficiency»): absence de LT et LB matures Souris NOD: diabète, anomalie IFN, anomalie activité NK Souris Beige (bg) : anomalie des macrophages et neutrophiles, anomalie NK et CTL Souris RAG -/- : absence de LT et LB matures Souris NOD-SCID-IL2Rγ -/- : absence LB, LT, NK

70 Les transferts adoptifs Irradiation Cellules spléniques ou moelle osseuse souris donneuse (souris transgénique, souris knock out, souris traitée ) Souris receveuse Analyse de la réponse immunitaire, des fonctions des cellules transférées

71 Les souris humanisées

72 Les souris transgéniques Animaux chez lesquels une partie de l ADN a été modifié physiquement (pas par élevage) Le génome de toutes les cellules de l organisme est modifié L ADN germinal est également modifié: il est transmis à la progénie selon les lois de Mendel

73 Les souris transgéniques Pre-implantation 1 cell 2 cells 4 cells 8 cells 16 cells 32 cells MITOTIC DIVISIONS Pronuclear Injection Recombinant DNA constructs Blastocyst injection Genetically modified embryonic stem cells (ES cells)

74 Injection dans le pronucleus Utilisée pour ajouter un nouvel ADN Pas de contrôle du site d insertion ni du nb de copies insérées Suffisament efficace pour être utilisée sur les embryons Peut être réalisée dans n importe n quelle espèce mammifère

75 Hormone cocktail to superovulate X 1-cell pronuclear stage mouse embryo. 2-cell stage embryo Holding Pipette Injection Pipette Oviduct Transfer Y Pregnant Foster Mother + +

76 Homologous Recombination in ES Cells ES(Embryonic Stem) cell Cultures Targeted ES Cells Pure Population of Targeted ES Cells Uterine Transfer Targeted ES cells injected into blastocyst Chimera X Breed to WT white mouse Ψ Pregnant Foster Mother wt x heterozygous Germline transmission of ES cell-derived genome Blastocyst derived from mouse with white coat heterozygous wt homozygous

77 Les souris «Knock out» Gene knockout by homologous recombination using an W or Replacement type construct A B C D E F G H I X X B C F G TK neo A B C neo F G H I

78 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF01 Méthode d analyse scientifique Méthodologie d analyse scientifique (cf. présentation) Techniques d études des réponses immunitaires I. Principes (cf. présentation) II. Applications (d après Karlsson A.C. et al. (2003) J. Immunol. Methods 283:141) L objectif de cette étude est de comparer deux techniques pour mesurer les réponses cellulaires T spécifiques d antigènes des protéines virales du VIH ou du CMV (Cytomégalovirus). L étude porte sur des patients chroniquement infectés par le VIH. Les lymphocytes de donneurs VIH+ ont été purifiés et stimulés en présence de peptides (15 acides aminés) correspondant à différentes protéines du VIH (protéines Gag, Env et Vif) ou d un peptide correspondant à la protéine pp65 du CMV. L IFN produit par les cellules a été détecté par 2 techniques (Figure 1A et B). Figure 1 Question 1. Quelles sont les deux techniques utilisées. Expliquez à l aide de schémas comment ont été réalisées les 2 expériences présentées dans la figure 1. Université Pierre et Marie Curie 1

79 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF01 Question 2. Commentez les résultats obtenus Pour comparer les résultats, les données de la technique 1 (Figure 1A) ont été exprimées en «Spot Forming Cell» SFC/10 6 lymphocytes (Figure 2A), et les données de la technique 2 (Figure 1A) en pourcentages de lymphocytes T CD3+ producteurs d IFN (Figure 2B). Figure 2 Question 3. Quelles sont les différences mises en évidence dans ces expériences? Exercice II (d après van Stipdonk M.J.B. et al. (2001) Nature Immunology 2:423) L objectif de cette étude est de déterminer le temps de stimulation antigénique nécessaire pour stimuler et permettre la prolifération et la différenciation de lymphocytes T CD8+. Les cellules T CD8+ naïves sont obtenues de souris transgéniques dont le TCR est spécifique pour le peptide OVA( ). Les cellules T CD8+ prélevées chez ces souris ont été marquées au CFSE, puis cultivées en présence de CPA (cellules présentatrices d antigènes) présentant le peptide OVA( ) sur le CMH de classe I. Après un temps de culture de 0, 2, 4, 6 et 8h, les cellules TCD8+ ont été transférées dans d autres puits de culture sans APC, et analysées en cytométrie de flux après 24 ou 48h. Les résultats sont présentés dans la Figure 3. Université Pierre et Marie Curie 2

80 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF01 Figure 3 Question 4. Quelle est la technique utilisée? Question 5. Quelles sont les différences observées aux temps 24h et 48H? Quelles conclusions tirez-vous de cette expérience? Les auteurs ont par la suite étudié la différenciation des cellules T CD8+ en cellules effectrices. Les cellules T CD8+ ont été isolés des souris transgéniques, stimulés avec les APC présentant le peptide OVA( ) sur le CMH de classe I pendant 8h, puis transférées dans des puits de culture sans APC. Après 24h (Figure 4a), 48h (Figure 4b), ou 72h (Figure 4c), les lymphocytes T ont été incubées avec des cellules cibles EL4 exprimant le peptide OVA( ), préalablement marquées au Cr51 (carrées noirs). Les pourcentages de lyse ont alors été déterminés (Figure 4). Figure 4 (a), (b) et (c) : ronds ouverts : cellules T non stimulées par les APC, carrés noirs : cellules stimulées. (d) : Cellules T stimulées pendant 0h (ronds ouverts), 2h (ronds noirs), 8h (triangles noirs) ou plus de 8h (carrés noirs) avec les APC, puis transférées dans des puits de culture sans APC. Après 72h de culture, les cellules ont été collectées et la cytotoxicité mesurée sur les cellules cibles EL-4 OVA. (E:T rapport cellules effectrices/cellules cibles). Question 6. Schématisez l expérience réalisée Question 7. Quelles informations complémentaires ces résultats apportent-ils? Université Pierre et Marie Curie 3

81 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF01 Exercice III : Un problème de casting Vous êtes Chargé de Recherche, vous disposez de trois types de souris : i) Des souris de phénotype sauvage ii) Des souris transgéniques dont le TCR des lymphocytes T CD8+ est spécifique d un peptide de la glycoprotéine du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), le GP iii) Des souris de phénotype sauvage qui ont reçu un transfert adoptif de cellules spléniques provenant des souris transgéniques décrites ci-dessus Malheureusement (suite à une étourderie!) les étiquettes sur les cages ont été mélangées. Proposez une ou (des) expériences qui vous permettrai(en)t de retrouver le phénotype de vos souris. Université Pierre et Marie Curie 4

82 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF2011 TD-IF 2 : Reconnaissances Université Pierre et Marie Curie

83 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF02 Reconnaissances I. L hybridome S1 a été obtenu en fusionnant les cellules d un myélome non sécréteur avec les cellules spléniques d une souris immunisée contre la phosphorylcholine (PC) couplé à de l hémocyanine. S1 synthétise un anticorps d isotype,. Après un nouveau clonage de l hybridome S1, clones sont obtenus, l un d eux (U4) est particulièrement étudié. Les cellules S1 ou U4 sont cultivées en présence de méthionine 35 S. Les immunoglobulines sécrétées sont précipitées par un sérum de lapin anti-, puis réduites et déposées sur un gel SDS de polyacrylamide. L autoradiographie de ce gel est présentée sur la Figure 1 : Figure 1 Question 1. Proposer au moins deux hypothèses pour expliquer ces résultats. La spécificité des immunoglobulines sécrétées par U4 est analysée par des tests d hémagglutination. Une éventuelle activité anti-pc est recherchée vis-à-vis de la phosphorylcholine couplée aux globules rouges de mouton (PC-GRM). Les titres agglutinants obtenus sont présentés dans le Tableau 1 : Tableau 1 Question 2. Ces nouvelles données permettent-elles d étayer l une des hypothèses formulées précédemment? Les cellules U4 sont cultivées en présence de méthionine 35 S, puis lysées. Les immunoglobulines ainsi synthétisées sont précipitées par un anti-, réduites et déposées sur un gel SDS de polyacrylamide. La Figure 2 ci-dessous présente l autoradiographie obtenue. Question 3. Comment expliquer la présence des deux chaînes lourdes? Est-ce compatible avec le caractère monoclonal des hybridomes? Université Pierre et Marie Curie 1

84 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF02 Figure 2 N.B. : La séquence partielle NH2-terminale des deux chaînes lourdes est identique au VH de S1. II. Une protéine de myélome, de souris BALB/c, appelée TEPC15, et qui possède une spécificité antiphosphorylcholine (PC), est injectée à une souris de souche A/He. Les splénocytes immuns sont fusionnés aux cellules d un myélome non sécréteur de souris BALB/c. La spécificité des anticorps monoclonaux anti-t15 est analysée en inhibant l interaction T15 radioactif/anticorps monoclonaux par d autres anticorps monoclonaux ou des protéines de myélomes tous d origine BALB/c (Tableau 2). Tableau 2 Question 1. Quelle peut être la spécificité de chaque anticorps monoclonal? L interaction T15 radioactif/anticorps 2E8 ou anticorps F6 est étudiée en présence de l antigène PC ou de ce dernier couplé à la sérum albumine bovine (PC 20 -SAB). La Figure 3 résume les caractéristiques de ces inhibitions. Question 2. Interpréter ces résultats. Université Pierre et Marie Curie 2

85 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF02 Figure 3 III. Une lignée de souris mutantes est obtenue à partir de souris de la lignée consanguine B10.BR (H-2 k ). L impact de cette mutation sur le système immunitaire est recherché. Les souris B10.BR et mutantes sont immunisées contre l'ovalbumine (OVA). La production d'anticorps contre l'antigène est recherchée. Les résultats sont présentés dans le Tableau ci-dessous. Souris B10.BR Souris mutante Anticorps anti-ova Question 1. Commenter. Les cellules spléniques sont isolées à partir des deux types de souris. Grâce à un trieur de cellules, les cellules marquées avec un anticorps anti-igm fluorescent sont séparées et utilisées dans les trois expériences décrites ci-dessous. Expérience n 1 : Les cellules sont marquées à l aide des anticorps monoclonaux anti-i-a k ou anti- I-E k couplés à un fluorochrome et analysées par cytofluorométrie. Les résultats sont présentés sur la Figure 4. Expérience n 2 : Les cellules sont cultivées in vitro en présence de cystéine et de méthionine 35 S puis lysées. Le lysat est incubé en présence de l anticorps monoclonal anti-i-a k insolubilisé. Les produits immunoprécipités sont ensuite chauffés à 95 C puis déposés sur un gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE). Après migration électrophorétique, le gel est séché et autoradiographié. Les résultats sont présentés sur la Figure 5. Expérience n 3 : Les cellules sont marquées à leur surface à l aide de l iode 125 puis lysées. La même expérience d'immunoprécipitation que ci-dessus est réalisée. Cependant, les échantillons immunoprécipités sont ou non chauffés à 95 C avant d être déposés sur le gel. Les résultats sont présentés sur la Figure 6. Question 2. Interpréter ces expériences en indiquant notamment pourquoi les cellules IgM + ont été sélectionnées. Université Pierre et Marie Curie 3

86 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF02 Figure 4 : Fluorescence des cellules spléniques IgM +. Les courbes présentées en trait fin correspondent à l'autofluorescence des cellules. Figure 5 : Analyse par SDS-PAGE des protéines immunoprécipitées par anti-i-a k. Figure 6 : Analyse par SDS-PAGE des protéines immunoprécipitées par anti-i-a k. Deux hybridomes T (T1 et T2) obtenus contre le lysozyme de poulet sont testés pour leur capacité à produire de l'interleukine 2 (IL-2) en réponse à l'antigène. Celui-ci est présenté par des cellules spléniques provenant des deux types de souris. Les hybridomes T1 et T2 reconnaissent respectivement les peptides L46-61 et L présentés dans un contexte I-A k. Les résultats sont résumés sur la Figure 7. Université Pierre et Marie Curie 4

87 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF02 Question 3. Décrire succinctement un test permettant de mesurer la production d IL-2. Question 4. Quelles informations supplémentaires les résultats de la Figure 7 apportentils? Figure 7 : IL-2 produite après stimulation des hybridomes T1 et T2 par des cellules spléniques de souris B10.BR ( ) ou mutantes ( ) en présence de lysozyme (en haut) ou du peptide correspondant (en bas). Afin de mieux comprendre l observation ci-dessus, les expériences suivantes sont réalisées (Figure 8) : Dans une première expérience, les cellules spléniques des souris B10.BR ou mutantes sont marquées à leur surface à l iode 125 et lysées. Avant immunoprécipitation à l'aide de l'anticorps monoclonal anti-i-a k insolubilisé, les lysats sont incubés en présence du peptide L Les échantillons sont ensuite chauffés ou non comme précédemment et déposés sur gel de polyacrylamide. Dans la seconde expérience, les cellules spléniques des souris B10.BR ou mutantes sont incubées en présence du peptide L46-61 marqué à l iode 125 puis lysées. Une immunoprécipitation à l aide de l'anticorps monoclonal anti-i-a k est effectuée. L échantillon immunoprécipité est déposé sur le gel de polyacrylamide sans chauffage. Figure 8 : Analyse en SDS-PAGE des échantillons immunoprécipités par l'anticorps anti-i-a k. Question 5. Interpréter ces résultats en les corrélant avec ceux des expériences précédentes. Université Pierre et Marie Curie 5

88 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF02 Question 6. Proposer un schéma simple rendant compte du défaut de présentation de l'antigène par les cellules de la souris mutante. IV. (d après Kunzmann, V. et al. (2000) Blood 96:384) Les cellules malignes plasmocytaires causent une maladie appelée myélome multiple. C est une maladie des os parce que les tumeurs se développent dans la moelle osseuse. Au fur et à mesure que les masses tumorales s étendent, elles entraînent des érosions locales de l os et l apparition sur les radiographies de lésions osseuses multiples. Question 1. Quelles modifications concernant l hématopoïèse et la composition sérique en immunoglobuline observe-t-on chez les patients atteints de myélome multiple? Question 2. Quelles sont les manifestations cliniques généralement observées chez ces patients? Les bisphosphonates sont un traitement de choix pour les maladies qui impliquent une résorption osseuse excessive ; ils ont été notamment montrés efficaces dans la prévention de l ostéolyse chez des patients atteints de myélome multiple. Les bisphosphonates sont des analogues synthétiques de pyrophosphates endogènes. Cependant, les mécanismes d inhibition de la résorption osseuse par les bisphosphonates ne sont pas connus. Les expériences présentées ci-dessous s attachent à préciser leur mode d action. Il existe des relations structurales entre les bisphosphonates et certains ligands identifiés des lymphocytes T. Sur la base de cette observation, la capacité de stimulation des lymphocytes T par les bisphosphonates a été évaluée. Les résultats sont présentés à la Figure 9. Question 3. Interprétez les résultats de cette expérience. On notera qu aucune autre population cellulaire parmi les PBMC ne prolifère dans les conditions de l expérience. (8 lignes maximum) Université Pierre et Marie Curie 6

89 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF02 Figure 9 A. Des PBMC de donneurs sains ont été incubés avec des concentrations croissantes de différents bisphosphonates en présence d IL-2. Après 7 jours de culture, le pourcentage de cellules T parmi les cellules CD3 + a été mesuré en cytométrie de flux par double marquage avec des anticorps anti-cd3 et anti-c couplés à des fluorochromes. Comme contrôle positif, les cellules ont été stimulées avec IPP, un stimulateur des cellules T isolés des mycobactéries. aminobisphosphonates non aminobisphosphonates B. Des PBMC de donneurs sains ont été incubés avec des concentrations croissantes de chlodronate (non aminobisphosphonate) ou de pamidronate (amino-bisphosphonate), en présence ou en absence d IL-2. Après 7 jours de culture, le nombre absolu de cellules T dans chaque culture a été mesuré. : chlodronate ; : chlodronate + IL-2 ; : pamidronate ; : pamidronate + IL-2. Dans une deuxième expérience, l expression de V 9 et V 2 à la surface de lymphocytes T activés par le pamidronate, l IPP ou la PHA a été évaluée. Les résultats sont présentés à la Figure 10. Figure 10 A. Des PBMC de donneurs sains ont été incubés en l absence (Medium) ou en présence de 4 M d IPP, 4 M de pamidronate ou 4 g/ml de PHA, en présence d IL-2. Après 4 jours, la prolifération des cellules a été déterminée par incorporation de thymidine tritiée. B. Des PBMC de donneurs sains ont été incubés en l absence (Medium) ou en présence de 4 M d IPP ou de pamidronate, en présence d IL-2. Après 7 jours, les cultures ont été analysées en cytométrie de flux par double marquage avec des anticorps anti-cd3 et anti-c (Anti- TCR), anti-v 9 ou anti-v 2. Question 4. Qu apportent les résultats de cette expérience? Université Pierre et Marie Curie 7

90 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF02 Dans une autre expérience, l activation des cellules T par le pamidronate en l absence d IL-2 a été évaluée par la mesure de l expression de CD25 et CD69, deux marqueurs d activation des lymphocytes T. Les résultats sont présentés dans la Figure 11. Question 5. Analyser ces résultats. En particulier, discutez du rôle de l IL-2 dans la prolifération ou l activation des cellules T par le pamidronate. Figure 11 Des PBMC de donneurs sains ont été incubés en présence de 4 M d IPP ou de 0,4, 4 et 40 M de pamidronate, en l absence d IL-2. L expression de CD25 (A) ou CD69 (B) a été déterminée à 0, 24, 48 et 72h de culture par double marquage avec les anticorps anti-c et anti-cd25(a) ou anti-cd69 (B). La production d IFN par les cellules T activées par le pamidronate est ensuite mesurée par ELISA ou cytométrie. Les résultats sont présentés dans la Figure 12. Figure 12 Des PBMC ont été incubés en absence (Medium) ou en présence de 40 M d IPP ou de 40 M de pamidronate, en l absence d IL-2. (A) La production d IFN a été mesurée par ELISA au cours du temps pour les cellules incubées en absence ou en présence de pamidronate. (B) L expression d IFN intracellulaire par les cellules T a été déterminée après 72h de culture par double marquage avec les anticorps anti-c et anti-ifn. Question 6. Expliquez comment le double marquage a été réalisé dans l expérience présentée à la Figure 12B. Université Pierre et Marie Curie 8

91 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF02 Question 7. Analysez ces résultats. La capacité de cytolyse in vitro d une lignée T activées par le pamidronate est ensuite mesurée vis-à-vis de différentes lignées tumorales. Les résultats sont présentés dans la Figure 13. Figure 13 La cytotoxicité d une lignée T activée par le pamidronate a été testée vis-à-vis de cellules de la lignée de lymphome DAUDI, des lignées de myélome RPMI 8826 et U266 ou de PBMC allogéniques activés par la PHA, préalablement chargés en Cr 51. La capacité de lyse a été mesurée pour différents ratios effecteur:cible. Question 8. Analysez ces résultats. En particulier, vous indiquerez de quelle(s) expérience(s) contrôle(s) vous auriez souhaitez disposer afin de préciser votre interprétation. Question 9. A l aide d un tableau comparatif vous indiquerez en quoi la reconnaissance des lymphocytes T diffère de celle des lymphocytes T. V. Les récepteurs Nod (D après Kobayashi, K.S., et al. (2005) Science 307:731) Dans cette étude, les auteurs s intéressent au rôle de Nod2, une molécule appartenant à une famille de récepteurs de l immunité innée nouvellement identifiée. Pour cela, une lignée de souris déficiente pour Nod2 (Nod2-/-) a été produite par invalidation et les auteurs étudient les conséquences de l absence de Nod2 sur le développement et le fonctionnement du système immunitaire en situation physiologique et pathologique. Question 1. Rappelez, à l aide d un tableau synthétique, les différents types et le rôle des récepteurs de l immunité innée. Dans une première expérience, les auteurs étudient la réponse in vitro et in vivo de souris de type sauvage (WT) ou déficientes pour Nod2 (Nod2-/-) après stimulation par différents stimulus mettant en jeu certains récepteurs de l immunité innée. Les résultats sont présentés sur la Figure 14. Université Pierre et Marie Curie 9

92 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF02 Figure 14 A & B : Mesure de la production par ELISA d IL-6 et d IL-12 par des macrophages de souris de type sauvage (WT) ou déficientes pour Nod2 (Nod2-/-) après stimulation in vitro pendant 24 h par du Poly(IC) ou du LPS en présence de concentrations croissantes de MDP (muramyl dipeptide). C : Mesure de la production par ELISA d IL-6 et de TNF par des macrophages de souris WT ou Nod2-/- après stimulation in vitro pendant 20 h en présence ou en absence de MDP. D : Courbes de survie de souris WT ou Nod2-/- après injection de LPS en présence ou en absence de MDP. Dans une deuxième expérience, les auteurs étudient la réponse anticorps spécifique suite à une immunisation avec la sérum albumine humaine (HSA) chez des souris de type sauvage (WT) ou déficientes pour Nod2 (Nod2-/-) en présence ou en absence de MDP (muramyl dipeptide). Les résultats sont présentés sur la Figure 15. Université Pierre et Marie Curie 10

93 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF02 Figure 15 La réponse anticorps sérique totale (A, C & E) et IgG1 (B, D & F) spécifique de HSA a été mesurée par ELISA chez des souris de type sauvage (WT) ou déficientes pour Nod2 (Nod2-/-) deux semaines après immunisation avec la sérum albumine humaine (HSA) en présence de MDP (A & B) et après un rappel trois semaines après la première immunisation (C & D). En E & F, la réponse anticorps anti-hsa a été mesurée deux semaines après immunisation avec HSA en présence de R-848, un ligand synthétique de TLR7. N.B. : Les valeurs «P<0.005» indiquent des différences statistiquement significatives entre les deux lignées de souris pour les paramètres considérés. Question 2. Analysez soigneusement des résultats présentés à la Figure 15. Dans une dernière expérience, les auteurs mesurent la charge bactérienne chez des souris de type sauvage (WT) ou déficientes pour Nod2 (Nod2-/-) après injection de Listeria monocytogenes par voies intraveineuse, intrapéritonéale ou intragastrique. Les résultats sont présentés sur la Figure 16. Question 3. Analysez soigneusement des résultats présentés à la Figure 16. Question 4. Que concluez-vous quant au rôle de Nod2 dans la protection contre des pathogènes bactériens. Université Pierre et Marie Curie 11

94 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF02 Figure 16 A : La charge bactérienne (colony forming unit) de souris de type sauvage (WT) ou déficientes pour Nod2 (Nod2-/-) est mesurée dans le foie (liver) et dans la rate (spleen) 24h et 48h après infection par Listeria monocytogenes par voie intraveineuse. B : La production d IL-6 est mesurée dans le sérum de souris WT (Nod+/+) ou Nod2-/- 12h, 24h et 48h après infection par L. monocytogenes par voie intraveineuse. C : La survie de souris WT ou Nod2-/- est mesurée après infection par L. monocytogenes par voie intrapéritonéale. D : La charge bactérienne (colony forming unit) de souris WT ou Nod2-/- est mesurée dans le foie (liver) et dans la rate (spleen) 72h après infection par Listeria monocytogenes par voie intragastrique. N.B. : Les valeurs «P<0.0005» et «P<0.01» indiquent des différences statistiquement significatives entre les deux lignées de souris pour les paramètres considérés. Université Pierre et Marie Curie 12

95 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF2011 TD-IF 3 : Sélections Université Pierre et Marie Curie

96 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF03 Sélections I. (d après Papavasiliou, F. et al. (1996) J.Exp.Med. 184:2025) Les auteurs de cette étude ont examiné le rôle de différents composants du récepteur pré-bcr dans le développement des cellules B. Ils ont introduit plusieurs transgènes d immunoglobuline (Ig) dans des souris RAG-/-, 5-/- et double mutantes (RAG-/- 5-/-). Tous les transgènes sont des gènes réarrangés sous contrôle du promoteur VH et de l enhancer IgH. Les résultats sont présentés sur les figures suivantes : Figure 1 : Analyse par FACS des cellules de la moelle osseuse de souris âgées de 6 à 8 semaines. A. Souris sauvages (WT) et mutantes (RAG-/-, 5-/- et double mutantes RAG-/- 5-/-). B. Souris chez lesquelles on a introduit un transgène codant la forme membranaire de la chaîne humaine (Ig ). Les cellules ont été marquées par des anticorps anti-b220, anti-cd43 et anti-igm humain (ne reconnaît que IgM humaine). Le pourcentage de lymphocytes présents dans chaque cadran est inscrit en haut et à droite pour les marquages B220/CD43. Question 1. Question 2. Question 3. Question 4. Quel est l effet de l introduction du transgène Ig dans les mutants RAG-/-, 5-/- et RAG-/- 5-/-? Que suggèrent ces expériences quant aux éléments nécessaires à l expression de la chaîne à la surface et quant à son effet sur le développement des cellules B? Donner les raisons qui ont conduit à l utilisation des souris mutantes RAG-/-, 5-/- et double mutantes RAG-/- 5-/-. D après les résultats présentés aux Figure 3 et Figure 4 que peut-on conclure quant au rôle des chaînes légères dans l assemblage, le transport et la fonction du récepteur pré-b? Université Pierre et Marie Curie 1

97 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF03 Figure 2 : Analyse de l expression intracellulaire du transgène Ig humain dans les cellules B220 + CD43 + de la moelle. Après marquage avec les anticorps anti-b220 et anti-cd43, les cellules des souris utilisées à la Figure 1 ont été fixées, perméabilisées et marquées avec l anticorps anti-igm humain. Figure 3 : Analyse du complexe pré-bcr par des expériences d immunoprécipitation. Des lignées de précurseurs B immortalisées par le virus d Abelson ont été obtenues à partir de la moelle de souris de type sauvage (WT), mutantes (RAG-/-), ( 5-/-) et (RAG-/- 5-/-) ainsi que de souris mutantes exprimant le transgène Ig humain : (m RAG-/-), (m 5-/-) et (m RAG-/- 5-/-). Les complexes Ig ont été immunoprécipités avec un immunsérum anti-igm humain et analysés par la technique de Westen blot. Les protéines ont été révélées avec des anticorps anti-igm humain (higm) ; anti-ig (Ig ) et anti-ig (Ig ). s.f. : forme membranaire ; c.f. : forme cytoplasmique. Après surexposition, on voit apparaître sur un blot une bande correspondant à la forme membranaire (s.f.) de la protéine Ig dans la 1 ère piste (m 5-/-). Figure 4 : Analyse par FACS des cellules de la moelle provenant de souris mutantes dans lesquelles on a introduit soit le transgène Ig comme précédemment, soit un transgène YS:VV Ig :Ig codant pour une protéine chimérique Ig - Ig, soit un transgène IgM codant pour une immunoglobuline complète (Ig /Ig ). Voir la légende de la figure 1 pour les détails expérimentaux. N.B. : après introduction des transgènes YS:VV Ig :Ig et IgM, on observe la présence de chaîne transgénique dans le cytoplasme des précurseurs de la moelle. Question 5. Donner un titre qui résume les points essentiels de ces expériences. Université Pierre et Marie Curie 2

98 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF03 II. Rôle de Notch1 dans le développement T (d après Wolfer, A. et al. (2002) Immunity 16:869) Les protéines Notch sont des récepteurs transmembranaires intervenant dans les choix de différenciation cellulaire chez plusieurs organismes. Leurs domaines extracellulaires contiennent des motifs de type EGF (epidermal growth factor) impliqués dans des interactions avec leurs ligands. Le domaine intracellulaire est clivé lors de la reconnaissance du ligand et transféré dans le noyau où son hétérodimérisation avec RBP-J (recombinaison signal sequence binding protein pour J ) convertit RBP-J de sa forme répresseur en activateur de transcription ; ceci conduit à la transcription des gènes cibles. Notch1, Notch2 et Notch3, comme les ligands Jagged1, Jagged2 et -like-4, sont exprimés sur les thymocytes et l'épithélium thymique. Pendant le développement lymphoïde, la signalisation par Notch1 est essentielle pour le choix de différenciation d un précurseur bipotent T/B vers le lignage T ; son rôle dans les étapes postérieures du développement T ( vs. ; CD4 vs. CD8) reste controversé. Les expériences présentées ci-dessous apportent des précisions quant au rôle de Notch1 aux différentes étapes du développement thymique. Une souris Notch1 lox/lox, obtenue précédemment a été croisée avec des souris trangéniques pour la recombinase Cre sous le contrôle des promoteurs de CD4 ou de p56 lck. Les constructions utilisées sont schématisées sur la Figure 5. L inactivation de Notch1 chez ces souris est étudiée par PCR dans différentes sous-populations thymiques comme montré sur la Figure 6. Figure 5 : Constructions utilisées pour obtenir l inactivation conditionnelle de Notch1 Des souris Notch1 lox/lox ont été croisées avec des souris transgéniques exprimant la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur de CD4 (CD4-Cre) ou de p56 lck (lck- Cre) (à droite). L organisation génomique schématique du locus Notch1 lox/lox est montré à gauche ; l exon codant pour le peptide leader (rectangle noir) est flanqué de deux séquences loxp (triangles gris) suivies des exons codant pour les motifs EGF (rectangle gris). Les flèches indiquent la position des amorces utilisées pour détecter la délétion de la région de 3.5 kb contenue entre les deux sites loxp. Question 6. Expliquer pour quelle(s) raison(s) ces différentes constructions ont été utilisées. Question 7. Analyser et interpréter les résultats présentés à la Figure 6. Université Pierre et Marie Curie 3

99 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF03 Figure 6 : Inactivation conditionnelle de Notch1 au cours du développement thymique La délétion de la région de 3.5 kb contenue entre les deux sites loxp a été déterminée par PCR (cf. position des amorces sur la Figure 5) pour les sous-populations thymiques indiquées (DN1 DN4 et DP), isolées chez des souris Notch1 lox/lox (control), Notch1 lox/lox x CD4-Cre (CD4-Cre), ou Notch1 lox/lox x lck-cre (Lck-Cre) souris. L'amplification de l allèle Notch1 lox/lox aboutit à un fragment de 350 bp (lox), tandis que l allèle délété donne une bande de 470 bp (ko). Les thymocytes DN3 ont été triés en deux sous-populations précoces et tardives selon l expression cytoplasmique pour la chaîne TCR (ictcr - ou ictcr + ). L influence de Notch1 sur la différenciation thymique est ensuite étudiée chez les souris Notch1 lox/lox x lck-cre (dénommée Notch1 -/- dans la suite de l exercice) par comparaison aux souris Notch1 lox/lox (control). Les résultats de l analyse des sous-populations thymiques par cytométrie en flux chez ces souris sont présentés à la Figure 7. Question 8. Analyser et interpréter les résultats présentés à la Figure 7. Question 9. Quelle(s) sous-population(s) sont-elles affectées par l invalidation de Notch1 chez les souris Notch1 -/-? Figure 7 : Sous-populations thymiques chez les souris Notch1 -/- et control (A) Une analyse de cytométrie en flux des thymocytes des souris Control (à gauche) ou Notch1 -/- (à droite) est présentée pour les marqueurs CD4 et CD8. Les pourcentages de cellules CD4 SP, CD4 + CD8 + (DP), CD8 SP, et CD4 - CD8 - (DN) sont indiqués dans chaque cadran. (B) Les nombres absolus de cellules ont été déterminés pour les thymocytes totaux et les différentes sous-populations de thymocytes décrites en (A), en plus des cellules ISP (CD4 - CD8 + CD3 - ) et les cellules T matures. Les écarts-types sont indiqués (n=20 pour chaque groupe). Afin de préciser le point de blocage du développement thymique observé chez les souris Notch1 -/-, la sous-population CD4 - CD8 - (DN) est plus particulièrement étudiée chez ces souris par comparaison aux souris Control et à des souris déficientes pour pt (pt -/- ) ou TCR (TCR -/- ). Les résultats sont présentés à la Figure 8 : Université Pierre et Marie Curie 4

100 MV423 Immunologie Fondamentale & Intégrée 2011 Travaux Dirigés IF03 Figure 8 : Analyse phénotypique des cellules CD4 - CD8 - (DN) chez les souris Notch1 -/- (A) Analyse en cytométrie en flux des thymocytes DN pour les marqueurs CD44 et CD25 chez les souris Control, Notch1 -/-, pt -/- et TCR -/-. La fenêtre dessinée met en évidence l accumulation de thymocytes DN3 CD44 int CD25 bright. (B) Histogrammes des profils d expression de CD25 pour la sous-population de thymocytes DN totale chez les souris Control (ligne pleine), Notch1 -/- (en grisé), et pt -/- (pointillé). (C) Nombres absolus de thymocytes CD44 int CD25 bright chez les souris Control (gris clair) et Notch1 -/- (gris foncé). Les écarts-types sont indiqués pour les souris Control (n=10) et Notch1 -/- (n=13). Question 10. Analyser et interpréter les résultats présentés à la Figure 8. Question 11. A quel stade le blocage de la différenciation des thymocytes a-t-il lieu? La fréquence des réarrangements au niveau du locus TCR est étudiée au niveau de l ADN génomique. Les résultats sont présentés sur la Figure 9 : Figure 9 : Analyse des réarrangements TCR (A) L ADN génomique de thymocytes DN3 triés de souris Control (C.) ou Notch1 -/- (N1 -/- ) a été analysé par PCR pour la présence de réarrangements D -J, V 5.1-J et V 8.2-J. Les produits d amplification ont été révélés par la technique de Southern blot à l aide d une sonde D 2-J 2.6. Le gène témoin Thy1 est révélé après PCR et hybridation avec une sonde Thy1. (B) Les thymocytes DN4 de souris Control ou Notch1 -/- ont été triés pour l expression cytoplasmique de la chaîne TCR (ictcr ). Les réarrangements TCR ont été analysés comme précédemment pour les cellules DN4 des souris Control ictcr + (C.TCR +), Notch1 -/- ictcr + (N1 -/- TCR +) ou Notch1 -/- ictcr - (N1 -/- TCR - ). Question 12. Analyser et interpréter les résultats présentés à la Figure 9. Question 13. Quel serait l effet de l introduction d un transgène codant une chaîne TCR réarrangée chez les souris Notch1 -/-? Université Pierre et Marie Curie 5