Web 6 Fiche 6.1 TECHNIQUE DE SÉQUENÇAGE SANGER. J. Bodilis

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1 Web 6 Fiche 6.1 TECHNIQUE DE SÉQUENÇAGE SANGER La technique de séquençage Sanger consiste à réaliser in vitro une synthèse d ADN, en constituant un milieu réactionnel contenant l ADN matrice à séquencer, dénaturé, une ADN polymérase (dérivée de l ADN polymérase I), une amorce (ADN simple brin) et les quatre dntp (datp, dctp, dgtp et dctp) en excès. Un di-déoxynucléotide (ddntp) est ajouté en condition limitante au mélange réactionnel. Historiquement, quatre milieux réactionnels indépendants étaient réalisés, avec chacun un ddntp différent. Les ddntps peuvent s incorporer normalement dans la chaîne d ADN en cours de synthèse par leur extrémité 5. Mais ils n ont de groupement hydroxyle libre ni en 2 ni en 3 du pentose, ce qui stoppe la synthèse par impossibilité d'incorporation du dntp suivant. Par exemple, le mélange réactionnel contenant du ddatp donne une série de fragments de différentes tailles se terminant tous par une adénine. La détermination de la taille des différents fragments, qui renseigne sur la position relative des différents nucléotides, était ensuite réalisée par séparation électrophorétique dans un gel de polyacrylamide, après dénaturation de l ADN, la visualisation étant effectuée grâce à un marquage radioactif. Deux améliorations techniques ont été introduites au cours des années La première a consisté à remplacer le marquage radioactif par des marquages fluorescents. Outre le fait de s affranchir de la radioactivité, cette innovation permet de ne réaliser plus qu un milieu réactionnel par réaction de séquençage, en introduisant les quatre ddntps marqués chacun avec un fluorochrome différent. La deuxième amélioration consiste à utiliser une électrophorèse capillaire à la place du gel de polyacrylamide pour séparer les fragments d ADN, ce qui permet de gagner à la fois en précision et en rapidité. Aujourd hui, le séquençage Sanger peut être réalisé par des séquenceurs automatiques à partir d une microplaque contenant jusqu à 384 échantillons. Les séquences obtenues (lectures ou reads) ont en moyenne une taille de 700 bases (jusqu à bases dans certains cas). Elles se présentent sous forme de chromatogrammes, une couleur différente étant associée à chaque nucléotide, eux-mêmes transformés en un fichier numérique que les ordinateurs pourront traiter. 1

2 Web 6 Fiche 6.2 Description de quelques génomes procaryotes BACTERIA Chromosomes nombre, structures et tailles Plasmides nombre, structures et tailles Agrobacterium tumefaciens 1 C + 1L (2,0 + 3,0 Mpb) 2 C ( kpb) Bacillus subtilis 1 C (4,2 Mpb) Bacillus thuringiensis 1 L (5,7 Mpb) 6 C (tous > 50 kpb) Borrelia 1 L (0,91 Mpb) Multiples C + l L (5-200 kpb) Bradyrhizobium japonicum Brucella melitensis Brucella suis biovars 1, 2, 4 Brucella suis biovar 3 1 C (8,7 Mpb) 2 C (2,1 + 1,2 Mpb) 2 C (1,0 + 2,0 Mpb) 1 C (3,1 Mpb) Buchnera sp 1 C (640 kpb) 2 C (< 7,8 kpb chacun) Deinococcus radiodurans 2 C (2,6 + 0,4 Mpb) 2 C ( kpb) Escherichia coli K12 Leptospira interrogans Paracoccus denitrificans Pseudomonas aeruginosa 1 C (4,6 Mpb) 2 C (4,7 + 0,35 Mpb) 3 C (2,0 + 1,1 + 0,64 Mpb) 1 C (6,3 Mpb) Rhizobacterium meliloti 2 C (3,4 + 1,7 Mpb) 1 C (mégaplasmide, 1400 kpb) 2

3 Rhodobacter sphaeroides Ureoplasma urealyticum Vibrio cholerea Vibrio parahaemolyticus 2 C (3,0 + 0,3 Mpb) 1 C (0,75 Mpb) 2 C (2,9 + 1,1 Mpb) 2 C (3,2 + 1, 9 Mpb) Xylella fastisiosa 1 C (2,7 Mpb) 2 C (51 + 1,3 kpb) ARCHAEA T optimale de croissance ( C) Pyrobaculum aerophilum 2,22 Mpb 100 Methanopyrus kandleri 1,69 Mpb 98 Pyrococcus furiosus 1,91 Mpb 98 Pyrococcus abyssi 1,77 Mpb 95 Nanoarchaem equitans 0,49 Mpb 89 Methanocaldococcus jannaschi 1,66 Mpb 88 Sulfolobus solfataricus 2,99 Mpb 85 Thermoplasma acidophilum 1,56 Mpb 65 Methanobacter thermautotrophicus 1,75 Mpb 55 Thermoplasma volcanium 1,58 Mpb 65 Halobacterium sp 2,01 Mpb 45 Methanosarcina mazei 4,10 Mpb 37 C : molécule circulaire ; L : molécule linéaire 3

4 Web 6 Fiche 6.3 LE GÉNOME DES CHLOROPLASTES Les chloroplastes sont des organites présents chez les plantes et les algues, qui permettent de capter l énergie lumineuse et de fixer le carbone inorganique (CO 2 ), en réalisant la photosynthèse oxygénique (Chap. 2). Les chloroplastes dérivent de cyanobactéries qui ont été les premiers organismes vivants à réaliser la photosynthèse oxygénique, il y a plus de trois milliards d années. Ce trait métabolique (photo-autotrophie) est responsable du succès écologique majeur des cyanobactéries, très tôt au cours de l évolution, et en conséquence de l accumulation de dioxygène atmosphérique (significative depuis deux milliards d années), qui a probablement permis l émergence des eucaryotes. Plusieurs hypothèses ont été proposées pour décrire la formation des chloroplastes, nous décrirons ici seulement l hypothèse la plus consensuelle. Il y a environ un milliard d années, un ancêtre d une micro-algue verte aurait conservé dans son cytoplasme, après phagocytose, une cyanobactérie. Au lieu d'une digestion de cette bactérie, il se serait progressivement mis en place une relation symbiotique entre la cyanobactérie et son hôte eucaryote, comme cela peut encore être observé avec d autres micro-organismes symbiotiques intracellulaires. La cyanobactérie et futur chloroplaste apportait à la micro-algue de l énergie (sous forme d ATP) et une source de carbone organique (fixation du CO 2 ) en échange d un apport constant d'autres nutriments et d'une protection contre la prédation (broutage par les protozoaires par exemple). Progressivement, le génome du symbionte s est simplifié, la sélection naturelle favorisant l élimination des gènes redondants avec ceux de l hôte et/ou devenus inutiles (gènes impliqués dans la mobilité ou la formation de la paroi, par exemple). Enfin, quelques gènes du futur chloroplaste ont «migré» vers les chromosomes nucléaires de la micro-algue, poursuivant ainsi la réduction de la taille du génome chloroplastique. Le nouvel organite est devenu totalement dépendant de son hôte pour sa survie et sa reproduction. Nonobstant leur origine endosymbiotique maintenant clairement démontrée, certains chloroplastes résultent probablement d une endosymbiose secondaire (voire tertiaire), une micro-algue verte ayant elle- 4

5 même été phagocytée par une deuxième cellule eucaryote, puis éventuellement une troisième. Ajoutant à cela que certaines cellules eucaryotes ont secondairement perdu leurs chloroplastes (et donc leur capacité de photosynthèse) au cours de l évolution, les organismes photosynthétiques sont donc fortement polyphylétiques, c est-à-dire dispersés dans les différentes lignées eucaryotes. Bibliographie Zablen L.B., Kissil M.S., Woese C.R., Buetow D.E Phylogenetic Origin of the Chloroplast and Prokaryotic Nature of its Ribosomal RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72(6):

6 Web 6 Fiche 6.4 LE GÉNOME DES MITOCHONDRIES Les mitochondries sont les usines à ATP de la cellule eucaryote. Elles permettent de réaliser la respiration aérobie, en consommant du dioxygène, ce qui représente un double avantage écologique. D une part, le dioxygène, qui a commencé à s accumuler significativement dans l atmosphère terrestre (et les océans) il y a environ deux milliards d années (Web 6 Fiche 6.3), est toxique pour les organismes vivants, en favorisant la formation de radicaux libres (Chap. 10). D autre part le dioxygène est un très bon accepteur d électrons (puissant oxydant), permettant de réaliser un métabolisme énergétique très rentable (Chap. 2). Un ancêtre des Rickettsia actuelles (classe des α-proteobacteria) aurait ainsi développé une innovation métabolique majeure avec la respiration aérobie, il y a environ deux milliards d années (Web 7, Fiche 7.9). Cette innovation représentait un avantage compétitif à la fois en augmentant la rentabilité du métabolisme et en permettant de diminuer la concentration de dioxygène intracellulaire (en le consommant). Il y a probablement 1,6 milliard d années, l une de ces Rickettsia ancestrales aurait été phagocytée par une cellule «proto-eucaryote» (qui pourrait être une Archée, voir plus loin). Tout comme dans le cas des chloroplastes (Web 6 Fiche 6.3), la future mitochondrie n aurait pas été digérée, développant progressivement une relation endosymbiotique avec sa cellule hôte. Le génome du symbionte s est ensuite simplifié, avec élimination des gènes redondants avec ceux de l hôte et/ou devenus inutiles. Enfin, quelques gènes de la future mitochondrie ont «migré» vers les chromosomes nucléaires de la cellule eucaryote, poursuivant ainsi la réduction de la taille du génome mitochondrial. L apparition des mitochondries semble étroitement liée à l histoire évolutive des eucaryotes. Quelques eucaryotes contemporains sont dépourvus de mitochondrie, mais possèdent des gènes mitochondriaux dans leur génome nucléaire, attestant d une présence ancestrale de ces organites. L endosymbiose mitochondriale pourrait ainsi avoir été un événement unique, concomitant avec l origine de la lignée des eucaryotes. Selon cette dernière hypothèse, la première cellule eucaryote serait née de la symbiose entre une Bactérie (future mitochondrie) et une Archée (ancêtre des procaryotes, selon cette hypothèse). Cette symbiose aurait abouti à la formation du génome mosaïque de la première cellule eucaryote ancestrale, les fonctions cellulaires étant codées soit par les gènes bactériens (certains lipides membranaires, par exemple), soit par les gènes archéens (fonctions informationnelles, par exemple). 6

7 Web 6 Fiche 6.5 ANALYSES PROTÉOMIQUES La séparation des protéines par électrophorèse à deux dimensions est la méthode traditionnelle d étude d'un protéome. La séparation est effectuée en fonction de la composition en acides aminés ionisables et du poids moléculaire des protéines. La première dimension de l'électrophorèse consiste à séparer les protéines en fonction de leur focalisation isoélectrique (IEF, IsoElectric Focusing) à travers un gradient de ph, par exemple de ph3 à ph10. Le mélange de protéines extraites est déposé sur une bandelette qui porte un gradient de ph immobilisé. La bandelette est ensuite soumise à un champ électrique. Chaque protéine migre pour s immobiliser lorsque le ph a atteint son point isoélectrique, c'est-à-dire lorsque sa charge devient nulle. Cette première séparation des protéines se fait donc en fonction de leur composition en acides aminés ionisables. La deuxième dimension consiste à séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire. La bandelette est mise à incuber dans du dodécyl sulfate de sodium (SDS), un détergent anionique qui va à la fois dénaturer et charger négativement les protéines, permettant leur séparation en fonction de leur masse. La bandelette est ensuite placée à l extrémité supérieure d un gel de polyacrylamide. Un voltage perpendiculaire à la bandelette permet de séparer les protéines en fonction de leur taille, la vitesse de migration étant inversement proportionnelle à la taille. Les protéines les plus petites migreront donc le plus loin. Les protéines sont ensuite visualisées à l aide d une coloration non spécifique (Bleu de Coomassie ou nitrate d argent), mettant en évidence jusqu à plusieurs milliers de protéines différentes à la fois. Les gels de polyacrylamide permettent ainsi de visualiser l apparition ou la disparition de protéines lors de modifications de conditions environnementales et/ou après mutation de la souche procaryote. Des marquages spécifiques peuvent être réalisés à l aide d anticorps ciblant une protéine particulière. De plus des protéines (ou spots) d intérêt peuvent être analysées en les excisant du gel. Après élution, cette protéine peut être identifiée par 7

8 digestion partielle par la trypsine puis identification des peptides la composant par séquençage de la partie N-terminale, en utilisant la méthode de dégradation d Edman. Une technique plus récente, qui consiste à identifier des protéines d intérêt par spectrométrie de masse (MALDI-TOF, Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time Of Flight), permet, toujours après digestion enzymatique par la trypsine, de déterminer la masse des différents peptides obtenus. Par référence avec des bases de données (idéalement issues du séquençage du génome de la souche étudiée), le nombre et la masse des peptides obtenus correspondent à des signatures spécifiques de protéines. L utilisation de la spectrométrie de masse est beaucoup plus rapide que le séquençage N-terminal de la protéine et nécessite une quantité beaucoup moindre de protéine. Enfin, lorsque le spot d intérêt n est pas référencé dans la base de données, il est possible d utiliser la spectrométrie de masse en tandem, ESI MS (Electospray Ionisation Tandem Mass Spectometry). Cette technique permet de déterminer la séquence en acides aminés de courts peptides et donc d affiner l identification, par recherche de similarité dans les banques protéiques. 8