Ce test n'est pas prévu pour effectuer un dépistage des donneurs. Ce test est pour usage professionnel uniquement.
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- Brigitte Lafond
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1 Simplexa BKV REF MOL2300 Rév. E Test de PCR en temps réel pour le dosage in vitro du virus BK (BKV). Pour diagnostic in vitro APPLICATION Le test Focus Diagnostics Simplexa BKV est conçu pour le dosage in vitro des acides nucléiques du virus BK (BKV) dans des échantillons d'urine et/ou de plasma à l'aide du 3M Integrated Cycler. Ce test est prévu pour être utilisé en association avec le tableau clinique et les autres marqueurs biologiques de l'évolution de la maladie pour la prise en charge clinique des patients infectés par le BKV. Ce test n'est pas prévu pour effectuer un dépistage des donneurs. Ce test est pour usage professionnel uniquement. RÉSUMÉ EXPLICATIF Le polyomavirus de type BK (BKV) est un virus non enveloppé comportant un génome d'adn double-brin circulaire de pb. Le BKV a été reconnu comme appartenant à la famille des polyomavirus à partir de 1971, après son isolement dans l'urine d'un patient ayant reçu une transplantation rénale. La séroprévalence mondiale est de 70 à 90 % 1 chez les adultes. La séroconversion se produit habituellement chez les enfants avant l'âge de quatre ans 2-7. La virémie en primo-infection entraîne un ensemencement du rein où le virus peut créer une infection cliniquement latente 8. En général, le virus reste dormant, mais une réactivation intermittente peut se produire chez certaines populations, telles que les patients immunodéprimés ou les femmes enceintes. La réactivation peut avoir une gamme de manifestations allant d'une virémie ou virurie infraclinique à la néphropathie et la sténose urétérale observée chez les patients greffés. Les affections cliniques manifestes provenant d'une infection à BKV sont peu fréquentes, mais elles sont liées au degré d'immunodépression. À l'heure actuelle, il n'existe pas d'autre méthode que la PCR pour détecter et doser le BKV de façon fiable. La culture du virus est rarement apte à fournir des informations à temps pour la prise en charge du patient, en raison de la croissance lente du virus et de la nécessité d'utiliser des lignées cellulaires spécialisées 9. Les tests sérologiques sont d'utilité négligeable, comme la majorité de la population est séropositive et que les pathologies liées au BKV sont le résultat de réactivation d'une infection latente 10. PRINCIPES DE LA PROCÉDURE Le test consiste en un système d'amplification par PCR et détection en temps réel qui utilise une sonde-amorce fluorescente bifonctionnelle pour la détection de l'adn du virus BKV dans des échantillons d'urine et de plasma. Le test comporte deux étapes principales : (1) extraction de l'adn provenant des échantillons du patient, (2) une sonde-amorce fluorescente bifonctionnelle est utilisée conjointement avec une amorce inverse pour amplifier une cible précise (pour chaque analyte et le contrôle interne). Le test fournit un résultat ; une région bien conservée du gène VP2 du génome du BKV est ciblée pour identifier l'adn viral dans l'échantillon. Un contrôle interne est utilisé pour contrôler le processus d'extraction et pour détecter une inhibition de la PCR. Le signal d'amplification obtenu pour chaque est comparé à une courbe d'étalonnage et quantifié. MATÉRIELS FOURNIS Le kit Simplexa TM BKV de Focus Diagnostics contient suffisamment de réactifs pour 100 réactions. Libellé du kit Nom du composant RÉF SYMBOLES CE SUR L'ÉTIQUETTE Nom abrégé Couleur du bouchon Nombre de flacons Réactions par flacon/kit Volume par flacon Simplexa BKV Primer Mix MOL2301 REAG A PM Brun 2 50/ µl Simplexa Master Mix MOL2000 REAG B MM Vert 2 50/ µl Simplexa Extraction & Amplification Control DNA MOL9001 CONTROL IC IC Bleu 3 50/ µl Simplexa BKV Low Positive Control MOL2302 CONTROL + LPC Blanc 6 1/6 200 µl Simplexa BKV High Positive Control MOL2303 CONTROL ++ HPC Rouge 6 1/6 200 µl
2 Simplexa BKV Page 2 Composant du kit Simplexa BKV Primer Mix (PM) (Mélange d'amorces) Description du composant Description Amorces fluorescentes marquées spécifiques pour le dosage du BKV et du contrôle interne. Cible Fluorophore de la sonde (Marqueur) Excitation Émission Gène ciblé BKV FAM 495 nm 520 nm Gène VP2 Contrôle interne Q nm 670 nm Gène de A. thaliana Simplexa Master Mix (MM) (Mélange maître) Simplexa Extraction & Amplification Control DNA (IC) (ADN de contrôle d'extraction et d'amplification) Simplexa BKV Low Positive Control (LPC) (Contrôle positif bas) Simplexa BKV High Positive Control (HPC) (Contrôle positif haut ) Simplexa BKV Barcode Card (Carte à code-barres) ADN polymérase, tampon et dntp Un fragment d'adn comportant 577 paires de bases tirées du gène codant pour la N-méthyltransférase de la grande sous-unité de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase-oxygénase de la plante Arabidopsis thaliana. Amplicon BKV dans une matrice de base humaine. Amplicon BKV dans une matrice de base humaine. Paramètres spécifiques au test. MATÉRIELS NÉCESSAIRES MAIS NON FOURNIS 1. Simplexa BKV Quantitation Standard Set (standard de dosage) ( REF MOL2310) 2. 3M Integrated Cycler avec le logiciel Integrated Cycler Studio version 3.0 ou plus récente 3. Universal Discs utilisables sur l'integrated Cycler 4. Laminage de couverture d'un Universal Disc 5. a Système Roche MagNA Pure LC et consommables associés. 6. a Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche, num. cat ) 7. b Appareil biomérieux NucliSENS easymag avec consommables et réactifs associés 8. b Pipette multicanaux Biohit/bioMérieux 9. b Plaque de micropuits ELISA 10. Micropipette(s) monocanal, multicanaux et/ou à répétition ayant une plage de précision de 1 à 10 µl, 10 à 100 µl et 100 à µl 11. Congélateur (dégivrage manuel) à -10 C à -30 C (pour stockage des composants congelés du kit) 12. Congélateur (dégivrage manuel) à -10 C à -30 C (pour stockage des échantillons congelés) 13. Réfrigérateur à 2-8 C (pour échantillons et composants du kit décongelés) 14. Enceinte de sécurité (hotte à flux laminaire) pour les extractions 15. Microcentrifugeuse 16. Vortex 17. Embouts antiaérosols, stériles, jetables, sans ARNase/ADNase de micropipetteur. 18. Tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml en polypropylène et portoirs (des tubes sans ARNase/ADNase sont recommandés mais non exigés). 19. Gants à usage unique, non poudrés. 20. Eau sans nucléase (utilisée au cours de l'extraction et comme Contrôle sans matrice [NTC]) 21. Portoirs de glacière pour tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml a À utiliser avec la méthode d'extraction Roche MagNA Pure LC b À utiliser avec la méthode d'extraction biomérieux easymag DURÉE DE CONSERVATION ET MANIPULATION 1. Conserver les réactifs à une température comprise entre -10 et -30 C (ne pas utiliser de congélateur sans givre). 2. Laisser les réactifs décongeler à température ambiante (entre environ 18 et 25 C) avant utilisation. 3. Ne pas utiliser les kits ou les réactifs au-delà de leur date limite d'utilisation. 4. Après addition du Mélange maître, utiliser le mélange réactif dans l'heure qui suit. Conserver le Mélange réactif à une température comprise entre 2 et 8 C jusqu au moment de poursuivre par le réglage de la PCR. 5. Une fois décongelés, conserver le mélange d amorces, le mélange maître et l ADN de contrôle d extraction et d amplification à une température de 2 C à 8 C pendant un maximum de 30 jours. Simplexa BKV Page 2
3 Simplexa BKV Page 3 6. Ne pas recongeler le mélange d'amorces, le mélange maître, l'adn de contrôle d'extraction et d'amplification ou les contrôles positifs. 7. Ne pas combiner des réactifs provenant de différents lots de kits. MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONS 1. Pour diagnostic in vitro. 2. Tous les matériaux d'origine humaine doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Les matériaux sources d'où proviennent ce produit (y compris les contrôles) ont été testés à la recherche de l'antigène de surface de l'hépatite B, des anticorps anti-hépatite C et anti-vih-1/2 (SIDA) avec des méthodes homologuées par la FDA et sont apparus négatifs. Cependant, comme aucune méthode de test connue ne peut offrir une garantie à 100 % que des produits dérivés du sang humain ne transmettront pas ces agents infectieux (ou d'autres), tous les contrôles, échantillons de sérum et équipements rentrant en contact avec ces échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux et décontaminés ou éliminés en utilisant les précautions concernant les risques biologiques. Les CDC et les National Institutes of Health préconisent que les agents potentiellement pathogènes soient manipulés au niveau de biosécurité 2 11, Portez un équipement individuel de protection comme (mais non limité à) des gants et une blouse de laboratoire lors de la manipulation des réactifs du kit. Lavez-vous soigneusement les mains quand vous avez fini le test. 4. Ne pas pipeter à la bouche. 5. Ne pas fumer, boire, manger, manipuler des lentilles de contact ou se maquiller dans les zones où des réactifs de kits et/ou des échantillons d'origine humaine sont utilisés. 6. Éliminez les réactifs de kits non utilisés ainsi que les échantillons d'origine humaine conformément aux règlements locaux, nationaux et fédéraux. 7. Dans le laboratoire, le flux de travail doit progresser dans une seule direction en commençant dans les zones de préamplification et en allant vers la zone d'amplification/détection : vous trouverez ci-dessous la séquence des événements qui se déroulent depuis l'extraction de l'échantillon jusqu'à l'amplification par PCR en temps réel : Commencez par l'extraction de l'échantillon, suivie par le réglage de l'appareil de PCR en temps réel, la préparation des réactifs et, finalement, l'amplification par PCR en temps réel. N utilisez pas de fournitures et d'équipement indifféremment dans les zones dédiées à l'extraction des échantillons et à leur préparation. Il n'est pas recommandé de faire des déplacements croisés entre les différentes zones. Les fournitures et l'équipement utilisés pour la préparation de l'échantillon ne doivent pas servir aux activités de préparation du réactif, ni au traitement de l'adn amplifié ou d'autres sources d'acide nucléique cible. Toutes les fournitures et l'équipement d'amplification doivent être conservés en permanence dans la zone de l'appareil de PCR en temps réel. L'équipement individuel de protection, comme les blouses de laboratoire et les gants jetables, doit être réservés à la zone de travail. 8. La contamination des échantillons de patients ou des réactifs peut aboutir à des résultats erronés. Utilisez des techniques respectant les règles d'asepsie. 9. Pipetez et manipulez les réactifs avec prudence pour éviter de mélanger les échantillons de puits contigus. 10. Utilisez des techniques de pipetage correctes et conservez le même schéma de pipetage tout au long de la procédure pour garantir l'obtention de valeurs optimales et reproductibles. 11. Ne substituez pas ou ne mélangez pas des réactifs de différents lots de kits ou avec des réactifs d'autres fabricants. 12. N'intervertissez pas les bouchons des tubes de réactifs. Cela pourrait provoquer une contamination et compromettre les résultats des tests. 13. Utilisez uniquement le protocole décrit dans cette notice. Des écarts par rapport au protocole ou l'utilisation de temps et de températures autres que ceux indiqués pourraient aboutir des résultats erronés. 14. L'organisation d'un test doit être effectuée à température ambiante (entre 18 C et 25 C, environ). Pendant le mélange des réactifs, maintenez les enzymes au froid en utilisant un bloc réfrigérant. 15. Ne réutilisez pas des Universal Disc qui ont été déjà exposés aux échantillons de patients ou à des réactifs. 16. Éliminez le disque utilisé sans détacher ou enlever l'adhésif qui le recouvre. 17. Si différents kits ou lots Simplexa sont installés sur un même disque, il est nécessaire de tester les contrôles positifs et les contrôles sans matrice de chaque kit. 18. Le Mélange maître contient plus de 1 % de glycérol, ce qui pourrait produire des irritations après inhalation ou contact avec la peau. Les mesures de premiers secours doivent être prises en cas d'inhalation ou de contact avec la peau. 19. Il n'est pas recommandé de conserver pendant une période prolongée des échantillons à une température comprise entre 2 et 8 C ; la performance du test n'a pas été déterminée dans ces conditions. 20. Si le matériau d emballage du kit semble être déchiré ou endommagé, ne pas utiliser et contacter Focus Diagnostics. Les coordonnées de contact sont indiquées à la dernière page de ce document. MODE D'EMPLOI A. PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS Les types d'échantillon acceptable sont l'urine et le plasma. Pour le plasma, n'utilisez pas de tubes de prélèvement utilisant l'héparine comme anticoagulant. L'héparine inhibe la PCR. Simplexa BKV Page 3
4 Simplexa BKV Page 4 B. ZONE D'EXTRACTION DES ÉCHANTILLONS Travaillez dans une zone dédiée à l'extraction de l'échantillon et du contrôle. La préparation des échantillons pour l'extraction doit être effectuée dans une enceinte de sécurité. Extraction selon la méthode Roche MagNA Pure LC 1. Procédez à l'extraction des échantillons du patient et des contrôles du test grâce au kit d'acide nucléique total Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid et de l'appareil d'extraction automatisé Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Reportez-vous au mode d emploi du fabricant pour l'extraction de l'acide nucléique au moyen de ce kit. 2. Dans le menu déroulant «Protocole» du système MagNA Pure LC System, sélectionner dans la liste «Total NA», puis «Total NA Variable_elution_volume.blk». Cela chargera les réglages appropriés pour le test. 3. Le protocole de l'échantillon doit être : «Total NA Variable_elution_volume». 4. Le volume de l'échantillon doit être réglé à 200 µl et le volume d'élution doit être réglé à 50 µl. 5. Le volume de dilution doit être réglé à zéro pour tous les échantillons. 6. Assurez-vous que le protocole post élution est réglé sur «None» (aucun). 7. Assurez-vous que les échantillons et les contrôles sont dans le bon emplacement de la cartouche d'échantillons. 8. Passez chaque échantillon et les contrôles positifs bas et hauts (LPC et HPC) au Vortex pendant 2 à 4 secondes et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond des tubes. 9. Pipetez 200 µl de chaque échantillon, du contrôle positif bas (LPC), du contrôle positif haut (HPC) et du contrôle sans matrice dans l'emplacement correspondant de la cartouche d'échantillons. 10. Vérifiez visuellement le niveau des échantillons et des contrôles dans la cartouche d'échantillons afin de vous assurer que les échantillons ont été ajoutés. 11. Passez 2 fois au Vortex à pulsations l'adn de contrôle d'extraction et d'amplification (contrôle interne : IC) et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 12. Pour chaque ensemble de 16 échantillons (de 1 à 16 échantillons), dispensez à l aide d une pipette 100 µl de l'ic dans un tube conique contenant 6 ml de tampon de lyse. Mélangez brièvement au vortex. Ajoutez le plateau adéquat à l'appareil d'extraction MagNA Pure. 13. Si, par exemple, plus de 16 échantillons (17-32 échantillons) sont extraits, dispensez à l'aide d'une pipette 200 µl d'icdans un tube conique contenant 12 ml de tampon de lyse. Mélangez brièvement au vortex. Ajoutez le plateau adéquat à l'appareil d'extraction MagNA Pure. 14. Transférez la cartouche d'échantillons dans l'extracteur automatisé d'acides nucléiques MagNA Pure LC et commencez la procédure d'extraction. 15. Lorsque l'extraction de l'acide nucléique est terminée, la cartouche contenant les contrôles et échantillons de patients extraits peut être retirée de l'appareil MagNA Pure et scellée. Conservez l'adn à une température de 2 à 8 C avant utilisation. Une conservation prolongée à cette température des échantillons extraits n'est pas recommandée. Gardez les échantillons d'adn extrait sur un bloc réfrigérant pendant le chargement du disque. Extraction par la méthode d'extraction biomérieux NucliSENS easymag 1. Se reporter au Manuel de l'utilisateur NucliSENS easymag pour le fonctionnement de l'appareil et du logiciel. 2. Choisissez la Generic template [Matrice générique] dans le logiciel NucliSENS easymag avec le paramétrage suivant : Default Request [Demande par défaut] : Generic (ou équivalent) Run Name Prefix [Préfixe du nom de la série] : (selon les besoins) Sample ID prefix [Préfixe ID d'échantillon] : (selon les besoins) Sample Type [Type d échantillon] : Primary [Primaire] Workflow Defaults [Paramètres par défaut du flux de travail] : On-board lysis Incubation [Incubation de lyse dans l'instrument] On-board Silica Incubation [Incubation de silice dans l'instrument] Sample Addition Guidance Off [Traçabilité échantillons désactivée] Reagent Tracking (Traçabilité réactif) : Lysis, Silica, Internal Control reagent tracking disabled [Lyse, Silice, Traçabilité du réactif de contrôle interne désactivée] 3. Saisissez les renseignements pour chaque échantillon dans l'écran de Demande d extraction comme ci-dessous. ID échantillon : (Saisir le nom de l'échantillon) Request (Demande) : Generic (ou équivalent) Volume (ml) : 0,200 Eluate (Éluat) (µl) : 50 Type : Primary [Primaire] Priorité : Normal Matrice : Other [Autre] 4. Créez la série d'extraction dans le logiciel NucliSENS easymag conformément au manuel de l'utilisateur. 5. Passez chaque échantillon et les contrôles positifs bas et hauts (LPC et HPC) au Vortex pendant 2 à 4 secondes et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond des tubes. 6. Pipetez 200 µl de l'échantillon, du LPC, du HPC ou du contrôle sans matrice dans le(s) tube(s) d'échantillon(s). Simplexa BKV Page 4
5 Simplexa BKV Page 5 7. Passez 2 fois au Vortex à pulsations le contrôle interne et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 8. Pipetez 5 µl d'ic vers chaque échantillon et tous les puits de contrôles (Control Wells). Changez d'embout entre les puits. 9. Chargez le(s) puits d'échantillons, les nouveaux matériels jetables d'aspiration et réactifs dans l'appareil easymag conformément aux instructions du manuel de l'utilisateur. 10. Démarrez la lyse intégrée et incubez les échantillons lysés pendant 10 minutes avant d'ajouter le mélange de silice magnétique. 11. Au cours de la période d'incubation de la lyse, préparez le mélange de silice magnétique. Mélangez la silice et diluez dans de l'eau sans nucléase en ajoutant 1 partie de silice magnétique à 3 parties d'eau sans nucléase (par exemple, 270 µl de silice magnétique µl d'eau sans nucléase). Préparez à peine 135 µl de mélange de silice magnétique par échantillon. 12. Pour transférer le mélange de silice dans les plaques de puits ELISA, mélangez la silice magnétique et utilisez 1 embout ainsi que le mode de fonctionnement P2 de la pipette Biohit. Appuyez sur Start [Démarrer] pour aspirer µl du mélange de silice magnétique et appuyez de nouveau sur Start [Démarrer] pour renvoyer le premier tirage dans le tube de mélange de la silice. Appuyez sur Start [Démarrer] pour distribuer 125 µl du mélange de silice magnétique dans les 8 puits individuels de la plaque ELISA. Répétez selon le besoin pour des plaques ELISA supplémentaires. 13. Après les 10 minutes d'incubation de la lyse, utilisez 8 embouts (par plaque ELISA) et le mode de fonctionnement P3 de la pipette Biohit pour transférer 100 µl du mélange de silice magnétique avec chaque échantillon dans le puits d'échantillon. Placez les embouts dans les puits des plaques ELISA et appuyez sur Start [Démarrer] pour mélanger et aspirer le mélange de silice magnétique. 14. Transférez le mélange de silice magnétique dans le puits d'échantillon approprié et placez les embouts de pipette dans les échantillons, en dessous du niveau liquide. Appuyez sur Start [Démarrer] pour aspirer, distribuer et mélanger (x3) la silice magnétique et les échantillons. Assurez-vous que les embouts de pipette restent en dessous du niveau liquide afin d'assurer un mélange correct. 15. Répétez les étapes 13 et 14 pour des puits d'échantillons supplémentaires. 16. Après avoir ajouté le mélange de silice magnétique dans tous les échantillons, commencez la série d'extraction. 17. Lorsque la série est terminée, retirez le(s) puits d'échantillon(s) de l'appareil. Si les échantillons ne sont pas destinés à une utilisation immédiate, transférez-les dans des tubes individuels pour limiter au minimum le risque de voir retomber la silice magnétique dans l'échantillon. Conservez l'adn à une température de 2 à 8 C avant utilisation. Une conservation prolongée à cette température des échantillons extraits n'est pas recommandée. Gardez les échantillons d'adn extrait sur un bloc réfrigérant pendant le chargement du disque. C. CONFIGURATION DE L'APPAREIL DE PCR TEMPS-RÉEL 1. Reportez-vous au Guide de l'utilisateur de l'integrated Cycler pour plus de détails sur la façon de configurer le logiciel Integrated Cycler Studio pour ajouter une définition de tests, régler une série de tests et analyser les séries sur l'integrated Cycler. Remarque : Une courbe de référence valide (série de tests de calibrage) doit être définie avant d'effectuer une série de tests de prédiction. D. ZONE DE PRÉPARATION DU RÉACTIF Zone dédiée à la préparation du mélange réactif du test Simplexa TM BKV. 1. Décongelez le mélange d'amorces et le mélange maître à température ambiante (entre environ 18 C et 25 C). Chaque flacon de composant du kit contient suffisamment de réactifs pour 50 réactions. Avant chaque utilisation, mélangez doucement les composants du kit mélange d'amorces et mélange maître par inversion (6 à 8 fois) puis centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 2. Préparez le volume requis du mélange réactif dans un tube de microcentrifugeuse en polypropylène de taille appropriée par pipetage du volume de chaque composant comme indiqué dans le tableau ci-dessous. Volumes de mélange réactif Réactif Mélange réactif Mélange réactif Volume / 1 réaction Volume / 10 réactions Simplexa Master Mix 4,0 µl 40 µl Simplexa BKV Primer Mix 1,0 µl 10 µl Volume total 5,0 µl 50 µl 3. Mélangez doucement le mélange réactif par inversion ou par pipetage (8 à 10 fois). 4. Centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 5. Poursuivez avec le paramétrage de la PCR. 6. Utilisez le mélange réactif dans l'heure qui suit sa préparation. Conservez le mélange réactif à une température de 2 à 8 C si le paramétrage de la PCR ne doit pas être réalisé immédiatement après la préparation du mélange réactif. Simplexa BKV Page 5
6 Simplexa BKV Page 6 E. ZONE D'AMPLIFICATION PAR PCR EN TEMPS RÉEL Effectuer dans une zone dédiée à la préparation du Disque universel à 96 puits pour le test Simplexa BKV. Reportez-vous au modèle de disposition du disque, à la section C, tout en effectuant la préparation suivante : 1. Ajoutez 5,0 µl du mélange réactif à chacun des puits. 2. Ajoutez 5,0 µl des contrôles positifs extraits dans les puits «HPC» et «LPC» du disque. 3. Ajoutez 5,0 µl de l'extrait de l'échantillon de patient dans le puits «S» approprié du disque. 4. Ajoutez 5,0 µl du contrôle sans matrice extrait dans le puits «NTC». 5. Recouvrez le disque avec l'adhésif (laminage) de couverture pour disque universel. 6. Ouvrez le couvercle de l'integrated Cycler. 7. Placez le Universal Disc (disque universel) scellé sur la platine. 8. Fermez délicatement le couvercle. 9. Cliquez sur Run (Exécuter). 10. Cliquez sur Start [Démarrer]. F. ANALYSE DES DONNÉES : 1. Quand la série est terminée, cliquez sur Analyze [Analyser]. 2. Vérifiez chaque marqueur un par un, ou sélectionnez tous les marqueurs (canaux) en cochant la case située à côté de chaque marqueur. 3. Appuyez sur le bouton Print Preview [Aperçu avant impression], en bas à droite, pour revoir un résumé des valeurs prédictives. Cochez la case Include Graphs [Inclure des graphiques] pour revoir les points d'amplification. Pour inclure un rapport de calibrage associé à la série de tests de prédiction, sélectionnez la case Include Calibration Result [Inclure le résultat de l'étalonnage]. Faites défiler les pages en utilisant les flèches situées dans le coin supérieur gauche de la fenêtre d'aperçu avant impression. 4. Imprimez ou enregistrez le rapport si besoin. 5. Exportez les valeurs théoriques (prédites) si besoin. CONTRÔLE DE QUALITÉ Chaque laboratoire doit définir ses propres plages de contrôle de la qualité et la périodicité des tests de CQ en fonction des lois locales, règlements et bonnes pratiques de laboratoire standards applicables. COMPTES-RENDUS DES RÉSULTATS 1. Validité de la série de tests Déterminez si la série de tests est valide en passant en revue les résultats du contrôle interne (IC) et du BKV en examinant le contrôle positif bas (LPC), le contrôle positif haut (HPC), et le contrôle sans matrice (NTC). Ces trois contrôles doivent répondre aux critères d'acceptation pour qu'une série soit valide. Si une série de tests n'est pas valide, tous les échantillons de patients doivent alors être à nouveau testés. Critères d'acceptation Contrôle BKV ADN de contrôle d extraction et d amplification (IC) No-Template Control (NTC) Non détectés Détectés Low Positive Control (LPC) À l'intérieur de la valeur de tolérance sur l'étiquette de lot spécifique Sans objet High Positive Control (HPC) À l'intérieur de la valeur de tolérance sur l'étiquette de lot spécifique Sans objet Le contrôle sans matrice (NTC) satisfait les critères d'acceptation si le BKV n'est «Pas détecté» alors que l'ic est «Détecté». La détection du BKV dans le contrôle sans matrice indique que les échantillons peuvent avoir été contaminés au cours de leur traitement. Le contrôle positif bas (LPC) satisfait les critères d'acceptation si le BKV est «Détecté» dans le LPC à l'intérieur des limites de tolérance (comme indiqué sur l'étiquette spécifique du lot) et l'ic devrait être «Détecté», mais cela n'est pas exigé. Le contrôle positif haut (HPC) satisfait les critères d'acceptation si le BKV est «Détecté» dans le HPC à l'intérieur des limites de tolérance (comme indiqué sur l'étiquette spécifique du lot) et l'ic devrait être «Détecté», mais cela n'est pas exigé. Simplexa BKV Page 6
7 2. Interprétation des résultats Interprétation des résultats Simplexa BKV Page 7 Exemple Valeur BKV Valeur IC Interprétation 1 Non détectés Détectés BKV non détecté 2 < 510 copies/ml S/O BKV détecté, en dessous du seuil inférieur de mesure (LLoQ : Lower Limit of Quantitation). 3 X copies/ml S/O BKV détecté à une concentration spécifique. 4 > 1 x 10 8 copies/ml S/O BKV détecté, au-dessus de la limite supérieure de dosage (ULoQ : Upper Limit of Quantitation). 5 Non détectés Non détectés Non valide, recommencer l'extraction et le test. 3. Validité du résultat de l'échantillon Un échantillon est valide si l'une de ces conditions est satisfaite 1. BKV n'est pas Détecté et l'ic est Détecté. 2. BKV est détecté. Il n'est pas nécessaire que l'ic soit détecté pour que les résultats du BKV soient positifs. 3. Les courbes d'amplification seront revues pour chaque résultat, en particulier quand un message «Data Quality» (Qualité des données) est transmis. Une courbe d'amplification valide présente une augmentation lisse et exponentielle. Se reporter au Manuel de l opérateur pour les actions recommandées. LIMITES 1. Les techniciens doivent être formés et avoir l'habitude des procédures de tests et de l'interprétation des résultats avant d'effectuer le test. 2. L'Integrated Cycler Studio de 3M conserve le dernier fichier valide d'étalonnage pour quantifier les échantillons inconnus de patients. Les standards de dosage et les échantillons de patients doivent être extraits en utilisant la même méthodologie d'extraction, faute de quoi vos résultats pourraient être erronés. 3. Lors du suivi d'un patient, la méthode d'extraction utilisée pour préparer la détermination de l'échantillon initial doit être utilisée pour tous les tests ultérieurs. 4. Tous les résultats de ce test et des autres tests doivent être corrélés aux antécédents cliniques, aux données épidémiologiques et aux autres données à la disposition du clinicien évaluant le patient. 5. La prévalence de l infection aura un impact sur la valeur prédictive du test. 6. Comme pour d'autres tests, des résultats négatifs n'éliminent pas la possibilité d'une infection par BKV. 7. Il peut y avoir des résultats faux négatifs lorsque l'organisme infectant présente des mutations, des insertions, des délétions ou des réarrangements de son génome ou lorsque le test est réalisé très tôt au cours de la maladie. 8. Des résultats faux négatifs peuvent survenir si la quantité d'organismes présents dans l'échantillon est insuffisante en raison d'un prélèvement, transport ou manipulation inadéquats. 9. Comme avec d'autres tests, des résultats faux positifs peuvent survenir. Dans certains cas, une répétition du test, ou le renouvellement du test avec un autre appareil peut être indiqué. 10. Ce test ne peut pas exclure la présence de maladies provoquées par d'autres agents pathogènes bactériens ou viraux. 11. Les performances de ce test n'ont pas été établies pour le dépistage du BKV dans l'urine ou le plasma. 12. Ce test n'est pas conçu pour être utilisé comme test de dépistage ou de diagnostic du BKV dans l'urine ou le plasma. 13. La performance de ce test n'a pas été évaluée avec des substances endogènes ou exogènes potentiellement interférentes. CARACTÉRISTIQUES DES PERFORMANCES COMPARAISON DE LA MÉTHODE Un site d'étude interne a participé à l'étude de concordance clinique. Les résultats de référence ont été générés en utilisant un test développé en laboratoire (LDT) de haute performance. Cent cinquante (150) échantillons de plasma et 125 échantillons d'urine soumis pour la détection ou le dosage du BKV ont été testés au cours de cette étude. Les échantillons ont été extraits en utilisant la méthode d'extraction MagNA Pure. Les échantillons inclus dans l'analyse (75 de plasma et 55 d'urine) se situaient dans la plage combinée de résultats publiables du test «LDT» et du test Simplexa BKV. L'analyse de régression Passing-Bablock a fourni une pente de 1,05 et une intersection de -0,83 pour le plasma et une pente de 1,05 et une intersection de -0,82 pour l'urine. Simplexa BKV Page 7
8 Simplexa BKV Page 8 Des échantillons cliniques présentant des résultats dans la plage linéaire du test Simplexa BKV ont aussi été testés avec l'extraction easymag. Ces échantillons se sont comportés de manière équivalente aux échantillons extraits selon la méthode MagNA Pure (pente de 0,98 et intersection de -0,03 pour le plasma, pente de 1,06 et intersection de -0,4 pour l'urine). SENSIBILITÉ ANALYTIQUE/LIMITE DE DÉTECTION Le seuil de détection (LoD, «Limit of Detection») a été calculé en créant artificiellement des échantillons en ajoutant des quantités connues d'une souche de BKV à des matrices de plasma et d'urine négatives, recueillies en clinique. Le panel comportait des échantillons négatifs (matrices d'urine et de plasma non enrichies) et des échantillons avec différentes concentrations, dilués en série, autour du seuil de détection approximatif (obtenus à une phase précédente de la procédure de test). Pour chaque combinaison de système d'extraction (easymag, MagNA Pure) et de type d'échantillon (plasma, urine), vingt-quatre (24) réplicats provenant de trois (3) séries différentes d'extraction et PCR pour chaque niveau ont été analysés avec l'analyse Probit pour déterminer quelle était la plus faible concentration pouvant être exactement détectée avec une probabilité de 95 %. Le protocole pour déterminer le LoD a été exécuté pour chaque type d'échantillon préparé en utilisant chacune des deux méthodes d'extraction. Les valeurs individuelles de LoD sont indiquées dans le tableau ci-dessous. Sur la base du LoD le plus élevé mesuré parmi tous les types d'échantillons et méthodes d'extraction, le LoD a été mesuré à 510 copies/ml. Simplexa BKV Page 8
9 Simplexa BKV Page 9 Plasma Urine MagNA Pure easymag MagNA Pure easymag Copies/ml RÉACTIVITÉ ANALYTIQUE / RÉACTIVITÉ CROISÉE Les études ont indiqué que les amorces étaient spécifiques du BKV et qu'il n'y avait pas de réaction croisée avec d'autres microorganismes, y compris HIV-1, HIV-2, HSV-1, HSV-2, HHV-6, JCV, VZV, EBV, CMV, Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus, Candida, Enterobacter, Citrobacter, E.coli, Klebsiella et Proteus mirabilis. En outre, les bases de données de séquences d'acide nucléique ont indiqué que les amorces étaient spécifiques du BKV et ne présentaient pas d'homologie significative avec d'autres agents pathogènes ou de l'adn humain. INTERFÉRENCE La performance de ce test n'a pas été évaluée avec des substances potentiellement interférentes. Le processus d'extraction automatisée de l'acide nucléique, au moyen du système MagNA Pure ou du NucliSENS easymag, élimine efficacement les impuretés des échantillons pendant l'isolement et les lavages des acides nucléiques au cours du processus d'extraction. Les contrôles internes alertent l opérateur d'une possible inhibition de la PCR ; si la cible et le contrôle interne ne sont pas détectés, le test n'est pas valide. REPRODUCTIBILITÉ L'étude de reproductibilité a été effectuée par deux opérateurs sur deux appareils Integrated Cycler (un opérateur par appareil), effectuant deux séries par jour pendant cinq jours. Le panel de reproductibilité comprenait des contrôles (NTC, HPC et LPC), des standards de dosage (QS-1 à QS-5), des lots négatifs (matrices d'urine et de plasma non enrichies) et des lots positifs de virus BKV dans des matrices d'urine et de plasma à trois concentrations différentes, à savoir un un lot faiblement additionné (à une concentration d'environ 2 à 4 fois le seuil de détection [LoD]), un lot intermédiaire (environ 8 à 10 fois le LoD) et un un lot fortement additionné (plage supérieure du test). Quatre réplicats de chaque échantillon de panel ont été exécutés, pour un total de 80 déterminations pour chaque membre du panel de l'étude. Les résultats de reproductibilité pour chaque échantillon du panel sont présentés dans le tableau ci-dessous. Nom de l'échantill on Concentration attendue (copies/ml) Moyenne géométrique (copies/ml) Reproductibilité du test Simplexa BKV Valeur log moyenne (copies/ml) Nb. de résultats mesurables * Entre instruments Entre jours Écart type Entre séries NTC 0 Non détectés Non détectés 0 Sans objet (S/O) À l'intérieur d'une série HPC 5,08 x ,81 x , ,026 0,026 0,026 0,026 0,026 LPC 6,32 x ,44 x , ,014 0,014 0,014 0,014 0,014 QS-1 4,70 x 10 8 > 1 x 10 8 S/O 0 S/O QS-2 5,29 x ,35 x , ,016 0,016 0,016 0,016 0,016 QS-3 2,74 x ,56 x , ,000 0,000 0,000 0,000 0,000 QS-4 5,83 x ,89 x , ,005 0,005 0,005 0,005 0,005 QS-5 1,05 x ,02 x , ,008 0,008 0,008 0,008 0,008 Total Simplexa BKV Page 9
10 Simplexa BKV Page 10 Lot fortement additionné Plasma 1,00 x ,11 x , ,016 0,009 0,026 0,019 0,037 Lot moyen 5,00 x ,71 x , ,022 0,050 0,025 0,048 0,076 Lot faiblement additionné 2,00 x ,44 x , ,063 0,050 0,000 0,098 0,126 Lot négatif 0 Non détectés Non détectés 0 S/O Lot fortement additionné Urine 1,00 x ,75 x , ,000 0,104 0,014 0,013 0,105 Lot moyen 5,00 x ,87 x , ,000 0,061 0,022 0,081 0,104 Lot faiblement additionné 2,00 x ,12 x , ,088 0,049 0,000 0,090 0,135 Lot négatif 0 Non détectés Non détectés 0 S/O * Nombre de résultats dans la plage linéaire du test Simplexa BKV. LINÉARITÉ La linéarité a été déterminée en utilisant des échantillons composés par l ajout de quantités connues d'une souche de BKV à des matrices de plasma et d'urine négatives, recueillies en clinique. Le panel comprenait 10 lots contenant un nombre connu de copies, couvrant la plage linéaire attendue. Parmi ces lots, au moins 3 concentrations étaient proches de la limite inférieure de quantification (LLOQ), 2 proches de la limite supérieure de quantification (ULOQ) et les lots restants étaient répartis à peu près équitablement entre la LLOQ et la ULOQ. Chaque échantillon a été analysé de façon aléatoire, avec au moins 3 réplicats. Le protocole pour déterminer la linéarité a été exécuté pour chaque type d'échantillon préparé en utilisant chacune des deux méthodes d'extraction. Les valeurs individuelles de plages linéaires mesurées sont indiquées dans le tableau ci-dessous. Plasma Urine MagNA Pure easymag MagNA Pure easymag copies/ml 250 à 1, à 1, à 1, à 1, Simplexa BKV Page 10
11 Simplexa BKV Page 11 Simplexa BKV Page 11
12 Simplexa BKV Page 12 ZONE DE VALEURS REPORTABLES Tous les types d'échantillons préparés par chacune des méthodes d'extraction étaient linéaires jusqu'à copies/ml. La plage rapportable du test était basée sur le LoD puisqu il était supérieur à la linéarité, Cette plage allait de > 510 copies/ml à < copies/ml. Les échantillons supérieurs à la plage linéaire seront rapportés comme ayant > copies/ml et les échantillons inférieurs à la plage linéaire seront rapportés comme ayant < 510. CONTAMINATION PAR TRANSFERT L'amplification d'une contamination par transfert a été évaluée pour l'instrument et l'universal Disc au moyen d'autres tests. Les études ont recherché la présence de contamination dans des échantillons négatifs hauts. L'étude a été conçue en plaçant l'un à côté de l'autre, en alternance, un échantillon fortement positif et un échantillon fortement négatif sur chaque disque. L'effet de contamination par transfert a été évalué en comparant le taux observé de négatifs pour les échantillons hauts négatifs avec le taux théorique attendu dans les conditions de reproductibilité normale. Aucun effet de contamination par transfert n'a été observé au cours des tests précédents. Simplexa BKV Page 12
13 Simplexa BKV Page 13 RÉFÉRENCES 1. Padgett, B.L. and Walker, D.L. (1973). "Prevalence of antibodies in human sera against JC virus, an isolate from a case of progressive multifocal leukoencephalopathy". J. Infect. Dis. 127 (4): Shah KV, Daniel RW, Warszawski RM. High prevalence of antibodies to BK virus, an SV40-related papovavirus, in residents of Maryland. J Infect Dis 1973; 128: Gardner SD. Prevalence in England of antibody to human polyomavirus (B.K.). BMJ 1973; 1: Mantyjarvi RA, Meurman OH, Vihma L, Berglund B. A human papovavirus (BK), biological properties and seroepidemiology. Ann Clin Res 1973; 5: Flaegstad T, Ronne K, Filipe AR, Traavik T. Prevalence of anti BK virus antibody in Portugal and Norway. Scand J Infect Dis 1989;21(2): Rziha HJ; Bornkamm GW; zur Hausen H. BK virus: I. Seroepidemiologic studies and serologic response to viral infection. Med Microbiol Immunol (Berl) 1978 Jul 4;165(2): AU Dei R; Marmo F; Corte D; Sampietro MG; Franceschini E; Urbano P 7. Age-related changes in the prevalence of precipitating antibodies to BK virus in infants and children. J Med Microbiol 1982 Aug;15(3): Arthur RR, Shah KV. Occurrence and significance of papovaviruses BK and JC in the urine. Prog Med Virol 1989; 36: Shah, KV. Polyomaviruses. IN: Virlogy (3 rd Ed), Fields, BN, Knope, DM, Howley, PM (Eds), Lipincott-Raven Publishers, Philadelphia p Gillespie, SM, Chang, Y, Lemkp, G, et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy in persons infected with human immunodeficiency virus, San Francisco, Ann Neurol 1991; 30: NCCLS H18-A2. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline. 2nd Ed. (1999). 12. CDC-NIH Manual. (1999) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4th ed. And National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A). L'utilisation des sondes Scorpions dans un but de diagnostic in vitro chez l'homme est couverte par une licence accordée à Focus Diagnostics, Inc. par DxS, Ltd. Les marqueurs Black Hole Quencher, CAL Fluor, marqueurs Quasar sont des marques de commerce de Biosearch Technologies, Inc. («BTI»). La technologie des marqueurs Black Hole Quencher, CAL Fluor et Quasar fait l'objet d'une licence aux termes d'un accord avec BTI et ces produits sont vendus exclusivement dans un but clinique, diagnostique ou de recherche-développement. Simplexa BKV Page 13
14 Simplexa BKV Page 14 REPRÉSENTANT AUTORISÉ mdi Europa GmbH, Langenhagener Str , Langenhagen-Hannover, Allemagne RENSEIGNEMENTS POUR LES COMMANDES Téléphone : Télécopie : (800) (États-Unis uniquement) (562) (562) (International) PI.MOL2300.OUS.FR Rév. E Date de rédaction : 10-novembre-2014 ASSISTANCE TECHNIQUE Téléphone : Télécopie : (800) (États-Unis uniquement) (562) (562) (International) Consultez notre site internet à l'adresse Cypress, Californie États-Unis Simplexa BKV Page 14
PRINCIPES DE LA PROCÉDURE
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