Caractérisation des Salmonella : intérêt dans la filière Feed

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1 Caractérisation des Salmonella : intérêt dans la filière Feed Christelle RAFFIN, 11/09/2013

2 Sommaire Introduction Salmonella et TIAC Salmonella en alimentation animale Salmonella : principe des méthodes : Détecter la présence de salmonelles dans un produit Identifier le type de salmonelles présentes: sérotypage Retrouver l origine de la contamination: typage moléculaire Salmonella : un cas concret 2

3 Sommaire Introduction Salmonella et TIAC Salmonella en alimentation animale Salmonella : principe des méthodes : Détecter la présence de salmonelles dans un produit Identifier le type de salmonelles présentes : sérotypage Retrouver l origine de la contamination : typage moléculaire Salmonella : un cas concret 3

4 Salmonella : des chiffres Principaux agents responsables des TIACS en 2011 Unknown 36% Salmonella 27% 2011 : personnes touchées par TIACs dans l Union Européenne Yersinia 0.3% Parasites 0.5% E. coli Pathogènes 1% autres agents dont Listeria 3% ** Virus 9% Campylobacter 11% toxines bactériennes 13% * *: Bacillus, Clostridium, Staphylocoques **: toxines marines, histamine, Listeria, Shigella Salmonella: agent pathogène le plus répandu Référence : EFSA, (European Food Safety Authority), ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control), The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2011; EFSA Journal 2013;11(4):3129, 250pp. doi: /j.efsa

5 Bilan EFSA zoonoses 2011 p

6 Pourquoi analyser les produits destinés à l alimentation animale? Pour protéger les consommateurs du risque Salmonella, l'ue a adopté une approche intégrée de la sécurité alimentaire de la fourche à la fourchette " Transmission démontrée des Salmonella de l alimentation des animaux aux animaux consommant ces aliments, aux produits alimentaires dérivés de ces animaux. Salmonella spp. constitue le risque majeur de contamination microbienne des aliments pour animaux» Salmonella : danger microbiologique le plus important en Alimentation animale. 6

7 Pourquoi Salmonella spp? Source : Ge et al. Foodborne pathogens and disease, 2013 (Vol10, N 8) 7

8 Pourquoi Salmonella spp? Distribution of the 20 most common human Salmonella serotypes [7]among animals, based on US data from Salmonella Typhi was excluded from this analysis as it represents a host-restricted serotype adapted to humans and non-human primates. Hoelzer et al. Veterinary Research :34 doi: /

9 Salmonella : principaux sérotypes présents en Europe dans les aliments (rapport zoonoses 2013) Nb de sérotypes retrouvés par type d aliments (EU ) : porc Volailles et oeufs bovins S. Typhimurium S. Enteritidis S. Derby S. Infantis S. Mbandaka S. Livingstone S. Seftenberg S. Anatum S. Java

10 Salmonella : principaux sérovars présents en France en alimentation animale (2010) France (2010) Aliment pour animaux oeufs Viande Volaille Viande porc Charcuterie S. Montevideo 19.9 % 1.4 % 0.1% 0.2% S.I 1,3,19:z27: % 0.2 % S. Mbandaka 6.3 % 18.2% 0.3% 0.2% S. Seftenberg 5.0 % 0.6 % 0.1% 0.2% S. Grumpensis 3.6 % 0.4% S. Rissen 3.0 % 0.5% 2.1% 9.9% S. Typhimurium 2.9 % 9.1% 14.3% 30.9% 32.9% S. Muenster 2.9 % 0.2% S. Livingstone 2.7 % 2.3 % 1.6% 0.3% 0.2% S. cerro 2.6 % 0.1% Rapport de l ANSES-réseau salmonella

11 Pourquoi rechercher des Salmonelles dans l alimentation animale? RECHERCHER Pour éviter de contaminer les élevages Pour assurer la sécurité du consommateur Pour être en conformité avec la réglementation 11

12 Sommaire Introduction Salmonella et TIAC Salmonella en alimentation animale Salmonella : principe des méthodes : Détecter la présence de salmonelles dans un produit Identifier le type de salmonelles présentes Retrouver l origine de la contamination Salmonella : un cas concret 12

13 Quelles méthodes de recherche choisir? Salmonella spp Méthode NF EN ISO 6579 Milieux de culture Méthode Moléculaire PCR Test immuno-enzymatique Test immunologique Simple Method For Salmonella (SMS) IBISA Rapid Salmonella Salmonella PRECIS IRIS Salmonella SESAME Salmonella Test Listes des méthodes validées AFNOR Test 3M de détection moléculaire des Salmonelles NEOGEN ANSR Salmonella = 2-3 jours = 7-20 h HQS Salmonella VIDAS Up Salmonella Reveal Salmonella 2.0 ADIAFOOD Salmonella TAQMAN Salmonella MicroSEQ Salmonella spp Assurance GDS Salmonella IQ-Check Salmonella II GeneDisc Salmonella spp. Systeme BAX Salmonella QIAGEN mericon Salmonella spp Transia Plate Salmonella Gold TAG 24 Salmonella VIDAS Salmonella Xpress Vidas Salmonella double voie Vidas Salmonella simple voie Vidas ICS2-SLM Vidas ICS2-Boîte Vidas Easy Salmonella RAYAL Salmonella OPTIMA RIDASCREEN Salmonella Tecra Unique Salmonella Oxoid Salmonella rapid test (OSRT) RapidChek SELECT Salmonella = 7-48 h 13

14 les méthodes évoluent pour des délais toujours plus courts Traditionnelle (Culture) : de 2 à 7 jours 1j Enrichissement primaire 1j Enrichissement secondaire Isolement 1-2j 1-3j (Confirmation) sélectif Immuno-enzymatique : de 8h à 48h 7-24h Enrichissement primaire 18-24h (Enrichissement secondaire) 1-3h Analyse PCR : de 8h à 30h 7-24h Enrichissement primaire 1-3h ADN 1-3h Analyse La PCR permet de raccourcir les délais de réponse 14

15 Sommaire Introduction Salmonella et TIAC Salmonella en alimentation animale Salmonella : principe des méthodes : Détecter la présence de salmonelles dans un produit Identifier le type de salmonelles présentes Retrouver l origine de la contamination Salmonella : un cas concret 15

16 Pourquoi identifier les Salmonelles retrouvées dans l alimentation animale? IDENTIFIER Pour connaitre le type de salmonelles présentes et les risques associées à certains sérotypes Pour retrouver l origine de la contamination Pour mieux connaitre ses produits 16

17 Pourquoi identifier les Salmonelles retrouvées dans l alimentation animale? ciblage des 5 sérotypes du règlement CE n 1003/2005 : Salmonella enteritidis, Salmonella hadar, Salmonella infantis, Salmonella typhimurium et Salmonella virchow, pour une meilleure appréciation du risque (objectif communautaire de réduction de la prévalence de certains sérotypes de salmonelles dans les cheptels reproducteurs de Gallus gallus), détection des Salmonella mobiles et immobiles, notamment les souches monophasiques de Salmonella typhimurium de formule antigénique : [ 1,4, [5],12 :i :- ], Exigence du règlement européen 1086/2011: critère de sécurité si Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium (concerne les salmonelles dans les viandes fraîches de volaille ). 17

18 Définition et détermination d un sérovar La détermination d un sérovar de salmonelles est basée sur différentes caractéristiques antigéniques : 1- la caractérisation des antigènes de la paroi LPS (O) 2- la caractérisation des antigènes flagellaires (H) (deux phases en général), 3- la caractérisation des antigènes de l enveloppe (Vi) Sérotypage environ 1500 sérotypes S. 18

19 Définition et détermination d un sérovar Suivant schéma de Kauffmann-White-Le Minor (KW): 19

20 Salmonella Typhimurium (formule antigénique 4,[5],12:i:1,2). 20

21 Sérovars réglementés en filière avicole 21

22 Techniques de sérotypage Sérotypage par agglutination (150 sérums!) Sérotypage moléculaire Ex. : Check-Points Premi Test Salmonella > Évolution de l ISO 6579 Utilisation de marqueurs d ADN multiplex (27) choisi pour produire des profils d'hybridation de puces à ADN uniques spécificité de 100 % 22

23 Définition et détermination d un sérovar 23

24 Pourquoi caractériser les Salmonelles retrouvées dans l alimentation animale? CARACTERISER Pour connaitre le type de salmonelles présentes et les risques associées à certains sérotypes Pour trouver l origine de la contamination Pour mieux connaitre ses produits 24

25 Techniques existantes de caractérisation - typage Basée sur la restriction de l ADN : PFGE : électrophorèse en champ pulsé : cette technique constitue le «gold standard» (XbaI Pulsed-Field Gel Electrophoresis) (années 1990), Ribotypage : Analyse basé sur l ARN ribosomal RFLP par Southern-blot de l ADN (Restriction Fragment Lenght Polymorphism). Basée sur l amplification de gènes MLST (Multi locus Sequence typing) (2002) : méthode de séquençage partiel de gènes codants pour des enzymes métaboliques afin de mesurer la distance génétique MLVA (Multi locus VNTR = Variable Number Tandem Repeat analysis) : Analyse de plusieurs loci présentant des séquences répétées : amplification par PCR d'une collection de loci répétés en tandem, et mesure de la taille des fragments amplifiés, permettent d'assigner à une souche une série de nombres correspondant au nombre d'unités répétées présentes dans chaque locus (MLVA disponible pour qqs sérotypes) = outil d investigation lors d épidémie, pas pour le sérotypage 25

26 Technique standard pour le typage : la PFGE (électrophorèse en champ pulsée) Bactérie isolée Mise en suspension Intégration des bactéries dans des blocs d agarose Lyse de cellules Les profils obtenus sont comparés entre eux pour déterminer une éventuelle origine commune > arbre phylogénétique Séparation des fragments par éléctrophorèse en champ pulsé Digestion enzymatique (enzyme de restriction) de l ADN total Fragment d ADN dendrogramme pulsotype 26

27 MultiLocus Variable repeat Analysis (MLVA) Méthode permettant d appréhender la diversité génétique de souches. Chaque type MLVA est affiché sous forme de cercles qui sont reliés par des branches. La longueur et la couleur des branches représentent les distances génétiques (changements de loci) entre les deux types voisins. Les tailles des différents cercles de couleur dépendent de la taille de leur population. Les cercles indiquent la proportion d'isolats provenant de sources respectives avec un type MLVA particulier. 27

28 Cas concret : 1 er épidémie en France causée par variant immobile Salmonella 4,5,12 :- :- en 2009 CAS CLINIQUES MAI 2009 : 8 cas de salmonellose après consommation d un tiramisu «fait maison» dans le sudouest Tiramisu VETERINAIRE AVRIL 2009: contrôles officiels chez un producteur d œufs du nord de la France Laboratoires d analyses CNR : Salmonella 4,5,12 :- :- 17 isolats non motiles : 5 issus cas cliniques, 1 du Tiramisu, 11 des poules pondeuses ANSES/LNR: Salmonella 4,5,12 :- :- 28

29 ANALYSE PFGE des isolats S. 4,5,12:-:- Profils PFGE très couramment rencontrés pour Typhimurium et ses variants avec un profil indiscernable XTYM-1, multiantibio-resistant DT 104. CNR S. Le Hello, 17/09/

30 MultiLocus Variable repeat Analysis (MLVA) P1= producteur d oeufs MLVA type

31 MultiLocus Variable repeat Analysis (MLVA) Dans le rectangle noir, le complexe spécifique lié aux souches d intoxication alimentaire tiramisu et autres loci dérivés de souches pour la période

32 Typage moléculaire des souches Salmonella Typhimurium épidémiques PFGE: le «gold standard» Profils non discernables par PFGE, très couramment rencontrés pour S. typhimurium et ses variants (X1 profil). Multi Locus Sequence Typing (MLST): Toutes les souches épidémiques appartiennent au type ST 19. Gènes flagellaires flic and fljb: PCR et séquençage ont permis d identifier le gène flic codant pour l antigène «i» flagellaire et le gène fljb codant pour l antigène flagellaire «1,2» MLVA: Le MLVA a permis de distinguer les isolats de l épidémie des autres variants immobiles de Salmonella isolés auparavant (2003 to 2009). 32

33 Pourquoi caractériser les Salmonelles retrouvées dans l environnement en alimentation animale? CARACTERISER Pour connaitre le type de salmonelles présentes et les risques associées à certains sérotypes Pour retrouver l origine de la contamination Pour mieux connaitre ses produits et leur environnement microbien: cartographier la contamination en Salmonella. 33

34 PLAN DE SURVEILLANCE SALMONELLE Points de prélèvements sur site (chiffonnettes produits finis) 34

35 CARACTERISATION SALMONELLE SEROTYPAGE SALMONELLE SUITE ANALYSE POSITIVE Identification (ex.): Salmonella montevideo Réalisation d une «empreinte génétique» Réalisation d une «empreinte génétique» «CODE à BARRE» de la Salmonelle 35

36 Profils génétiques différents pour Un même sérotype Salmonella montevideo 36

37 EXPLOITATION DES RESULTATS TRI DES PROFILS Profils différents Salmonella montevideo Repositionnement des résultats dans le plan de prélèvement 37

38 CARTOGRAPHIE de la contamination à SALMONELLE 38

39 UTILITE DE CETTE CARTOGRAPHIE surveiller tracer Les pics et les tendances Les origines des contaminations (MP, environnement), cibler Les zones de contaminations pour des interventions efficaces prevenir Prouver la non implication d une usine en cas d intoxication (comparaison du cas clinique avec la banque de données usine) 39

40 JE VOUS REMERCIE DE VOTRE ATTENTION! 40