TP BC : ADN recombinant BCPST1, ENCPB

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1 TP BC : principe et analyse de résultats des technologies de l ADN recombinant = clonage moléculaire = génie génétique Sources des illustrations : Analyse génétique moderne, Griffith et al., De Boeck, Biochimie, Voet et Voet, De Boeck, Sommaire I. Techniques du clonage moléculaire A. Isoler l ADN B. Couper l ADN : endonucléases de restriction C. Séparer les fragments en fonction de leur taille par électrophorèse D. Insérer la séquence dans un vecteur de clonage E. Amplifier et identifier les clones contenant l ADN recombinant : criblage F. Séquençage du fragment d ADN G. Amplification in vitro par PCR II. Utilisation des techniques de clonage A. Réalisation d une banque d ADN B. Réalisation d une carte physique d une petite région d ADN C. Utilisation de l ADN cloné comme sonde : techniques d hybridation III. Applications des technologies du clonage moléculaire A. Réalisation d un organisme génétiquement modifié B. Utilisation des RFLP C. Utilisation des microsatellites et minisatellites 1

2 Objectif: pourvoir isoler et caractériser (séquence, patron d expression ) des fragments d ADN afin d étudier leur fonction dans l organisme. Or une des difficultés majeures dans presque tous les domaines de recherche en biologie cellulaire et moléculaire est d obtenir des quantités suffisantes de la substance étudiée, ici de l ADN. Exemple : une culture de 10 litres de Eschérichia coli permet d obtenir 0,1mg de chaque kilobase d ADN chromosomique : une quantité insuffisante pour purifier un fragment précis. Il est donc nécessaire d amplifier l ADN. Les techniques de clonage moléculaire, développées depuis les années 1970 ont permis de surmonter ces difficultés : elles permettent d amplifier, d isoler et de purifier des fragments choisis d ADN. Principe de ces techniques : L idée de base de ces techniques est d insérer un segment d ADN d intérêt (qui provient d un organisme donneur) dans une molécule d ADN à réplication autonome appelé vecteur de clonage, de manière à ce que le segment d ADN soit répliqué en même temps que le vecteur. L ensemble formé par le vecteur et le segment d ADN forme l ADN recombinant. Le vecteur chimérique (de chimere, mythologie grecque) est ensuite cloné dans une cellule hôte (E. coli, levure) qui produit de grandes quantités du segment inséré un clone d ADN. Figure 1 2

3 Figure 1 : principe du clonage 3

4 I. Techniques du clonage moléculaire A. Isoler l ADN Par des techniques simples, il est possible d extraire l ADN du donneur et le vecteur ( vous avez extrait de l ADN en seconde : obtention d une pelote d ADN). Ces techniques permettent d obtenir l ADN total du donneur, sous forme de chromosomes. B. Couper l ADN : endonucléases de restriction Figure 2 Le clonage moléculaire exige que l on puisse manipuler des séquences bien précises : on utilise pour cela des enzymes de restriction ou endonucléases de restriction qui coupent la double hélice au niveau d une séquence nucléotidique spécifique. Elles existent à l'état naturel chez de nombreuses bactéries où elles servent à réduire en petits fragments les ADN étrangers (notamment l'adn des virus) qui ont pu s'introduire dans la cellule et qui ne s'intègrent pas dans le génome bactérien. Elles restreignent donc (d'où leur nom) la virulence des virus. Il existe de très nombreuses enzymes de restriction. Chaque endonucléase reconnaît de façon spécifique une courte séquence d'adn appelée site de restriction et coupe à ce niveau une liaison covalente phosphodiester précise sur chaque brin de la double hélice. Elle coupe systématiquement la molécule d ADN à chaque fois qu'elle rencontre cette séquence. Deux modes de coupure existent : - coupure franche qui génère des bouts francs : cas de EcoRV, Hae III - coupure décalée qui génère des bouts collants (EcoRI) on préfère ce type de coupure car il est plus facile de lié de brins collants que de brins à bouts simples (voir action de la ligase en ID) Figure 2 : enzymes de restriction Plus la séquence reconnue par l'enzyme est longue, plus elle est rare dans l'adn et plus les fragments d'adn après coupure sont grands. Applications : cartographie physique, RFLP et diagnostique de maladies génétiques, médecine légale 4

5 C. Séparer les fragments en fonction de leur taille par électrophorèse : L action d une enzyme de restriction sur une molécule d ADN génère des fragments de restriction. Ces fragments d ADN peuvent être séparés les uns des autres en fonction de leur taille en utilisant une électrophorèse sur gel d agarose ou d acrylamide. L'électrophorèse sur gel est une technique capable de séparer des fragments d'adn de quelques centaines de nucléotides dont les longueurs ne diffèrent que d'un seul nucléotide. Afin de visualiser l ADN, du BET (bromure d éthidium) est incorporé au gel. Formule du BET Cette molécule s intercale entre les bases azotées et a la propriété d émettre de la fluorescence lorsqu elle est excitée par des U.V. Le gel est alors observé sous une lampe à U.V. et les fragments d ADN deviennent visibles (ils sont fluorescents). figure 3 (gel personnel) La distance de migration est proportionnelle au logarithme (décimal) du nombre de paires de bases (pb). Il est possible de déterminer la taille des fragments de restriction obtenus en comparant leur mobilité électrophorétique à celle de fragments d ADN de taille déterminée appelés marqueur de poids moléculaire (ici, le marqueur utilisé est le phage lambda digéré par Hind III). Figure 3 : gel d électrophorèse d ADN Les échantillons sont déposés dans des puits. Après migration de l ADN, la taille des fragments est déterminée par comparaison de la distance de migration de chaque fragment avec celle des fragments de taille connue (marqueur de poids moléculaire puit 1, même marqueur que figure 3) A l aide des marqueurs de poids moléculaire (piste 1), tracer la courbe d étalonnage log (nombre de bases) = f (distance de migration) sur papier semi-log page suivante. Estimer la longueur des fragments des pistes 2, 3, 4 et 5. D après «Principes des techniques de biologie moléculaire» D.Tagu, INRA Editions 5

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7 D. Insérer la séquence dans un vecteur de clonage 1. Les vecteurs utilisés Le vecteur doit être une molécule relativement petite pour permettre des manipulations faciles. D autre part, leur réplication au sein d une cellule doit être efficace pour permettre l amplification de l ADN à cloner. Ils doivent également contenir des sites de restriction permettant d insérer un fragment d ADN et de l en extraire ensuite : leur localisation est connue au nucléotide près. Les sites uniques sont les plus pratiques : ils permettent par action de l enzyme d ouvrir le vecteur en un seul point. On utilise des plasmides, des virus et des chromosomes artificiels. a. Plasmides Ce sont des molécules circulaires d ADN de 1 à 200 kb qui contiennent une origine de réplication (les plasmides existent naturellement chez les bactéries) : cette dernière permet leur réplication dans la cellule hôte et donc la multiplication au cours des divisions cellulaires. On utilise des plasmides qui sont présents en grand nombre de copies dans chaque cellule (10 à 700 copies). Les plasmides utilisés en clonage présentent en général un gène de résistance à une substance chimique (en général un antibiotique : tétracycline, ampicilline etc), ce qui permet de sélectionner les cellules contenant le vecteur. Les vecteurs couramment utilisés sont par exemple pbr322 et puc Figure 4. Noter la présence des nombreux sites de restriction. Figure 4 : Deux plasmides utilisés pour le clonage 7

8 Remarques : - comment le plasmide pénètre-t-il dans la bactérie? on réalise une électroporation (=application d un champ électrique) qui permet au plasmide de rentrer dans la bactérie. - le plasmide puc possède un polylinker = une séquence de 100pb environ, riche en sites de restriction. b. Virus : phages On utilise le phage lambda : l avantage est que l on peut cloner des fragments de grande taille ( 16 kb). Voir cours sur les bactériophages. c. Chromosomes artificiels de levure : YAC YAC : Yeast Artificial Chromosomes Ce chromosome artificiel permet de cloner des fragments beaucoup plus longs : plusieurs centaines de kb. Le YAC est un segment linéaire d ADN, qui possède tous les éléments nécessaires à sa réplication (séquence ori, centromère et télomères). 2. Insertion de l ADN dans le vecteur Le plus souvent, on digère le vecteur et l ADN à insérer par une enzyme qui forme des bouts collants : les extrémités du segment à insérer sont ainsi complémentaires de celles du vecteur ouvert. Il suffit donc de mélanger le vecteur et le fragment d ADN en présence d une ligase pour insérer l ADN dans le vecteur. Représenter cette étape en prenant un fragment avec des bouts BamHI et le vecteur pbr322 (figure 4) ouvert par BamHI. E. Amplifier et identifier les clones contenant l ADN recombinant : criblage Au cours de la ligation, le vecteur peut se fermer sur lui-même sans intégrer la séquence d intérêt. Il faudra donc pouvoir discriminer les vecteurs seuls des vecteurs ayant inséré le fragments = vecteurs recombinants. On utilise un double criblage avec des antibiotiques et (ou) des substrats colorés (le gène lacz permet la production de la ß-galacosidase, une enzyme qui hydrolyse son substratx-gal en un produit bleu). Figure 4 à compléter: - dessiner les vecteurs obtenus en cas d insertion d un fragment au niveau du site BamH1 pour pbr322, dans le polylinker pour puc 18r - expliquer comment les deux plasmides permettent de discriminer les cellules non transformées des cellules transformées avec un vecteur nu = sans fragment inséré, avec un vecteur contenant l ADN à cloner. On vérifie ensuite par Southern (voir plus loin) que le clone contient effectivement l insert. Les cellules sélectionnées sont cultivées et le vecteur est amplifié. Figure 5 8

9 Figure 5 : amplification du vecteur A RETENIR : les plasmides sont: Des molécules qui se répliquent amplification de l ADN Des molécules qui permettent de cribler les cellules ayant le fragment d ADN résistances à des antibiotiques, réaction colorée etc 9

10 F. Séquençage du fragment d ADN Le clonage d un gène donné est une première étape avant un deuxième niveau d analyse dont le but est de caractériser la séquence du gène (qui n est qu une approche parmi d autres pour comprendre sa fonction autres approches : voir plus loin par exemple l hybridation in situ). 1. Principe des méthodes - toutes les méthodes de séquençage utilisent une population( = un grand nombre) d un fragment défini d ADN, marqué à l une de ses extrémités. - à partir de cette population, on produit des groupes de molécules dont la taille diffère d une seule base au niveau de l extrémité non marquée - les molécules produites sont séparées par une électrophorèse sur gel de molécules simple brin : la résolution permet de séparer des brins différant d un nucléotide. 2. Exemple : la méthode de Fred Sanger figure 6 METHODE A CONNAITRE! Cette méthode repose sur l utilisation de nucléotides terminateurs de chaîne : des didésoxynucléotides (absence de groupement OH en 3 ). Ces didésoxynucléotides peuvent s incorporer comme les désoxynucléotides, mais leur insertion provoque un arrêt immédiat de la polymérisation : figure ci-dessous 10

11 On mélange donc dans 4 tubes : - l ADN à séquencer - de l ADN polymérase - des désoxynucléotides «normaux» - une petite quantité de l un des didésoxynucléotides Dans chaque tube (par exemple celui qui contient ddatp), les nucléotides normaux sont en excès mais parfois, un nucléotide terminateur de chaîne vient se mettre en place et la synthèse du nouveau brin s arrête. En statistique, comme dans le tube on met de nombreuses copies du brin monocaténaire à séquencer, on obtient différentes longueurs de nouveaux brins. La plupart ont une longueur normale : ils n ont intégré aucun nucléoside terminateur de chaîne. Mais pour ceux qui sont plus courts, on sait qu ils se terminent tous dans ce tube par A : le nucléotide avec adénine. Les nouveaux brins sont séparés par électrophorèse. Le contenu de chaque tube migre dans une piste différente du gel. L emplacement des nouveaux brins est rendue visible par autoradiographie : les nucléosides terminateurs de chaînes sont radioactifs ce qui permet de visualiser les fragments. L enchaînement des bandes permet de lire la séquence. Pour le concours vous devez être capable de lire un gel de séquence. Figure 6 : méthode de Sanger 11

12 Remarque : dans le cas des séquenceurs automatiques, les didésoxynucléotides sont associés à un colorant fluorescent, différent pour chaque didésoxynucléotide : le séquenceur détecte directement la fluorescence et fournit le résultat sous forme d un graphe ou chaque nucléotide est représenté par un pic, avec sa couleur. figure 7 Figure 7 : résultat de séquençage automatique Exercice : Un fragment d ADN a été cloné et séquencé par la méthode des didésoxynucléotides. Une partie de l autoradiogramme du gel de séquençage est représentée ci-dessous : déduire la séquence de la chaîne nucléotidique et noter les extrémités 5 et 3. déduire la séquence du fragment utilisé comme brin matrice en notant les extrémités 5 et 3 12

13 G. Amplification in vitro par PCR (K. Mullis, 1985) : 1. Principe de la technique METHODE A CONNAITRE! PCR = Polymerase Chain Reaction = Réaction de polymérisation en chaîne Réaction totalement in vitro sans intervention de cellules A côté des techniques de clonage moléculaire qui sont indispensables dans le cadre de l étude d une séquence d ADN, la PCR est un moyen rapide et efficace d amplifier un fragment spécifique d ADN d une longueur allant jusqu à 6kb. Principe de la méthode Figure 8 Cette méthode est basée sur l activité d une ADN polymérase qui résiste à haute température (95 C) : la Taq polymérase, issue de la bactérie Thermus aquaticus. Protocole : - de l ADN est mis à incuber avec des dntp, de la Taq polymérase et deux amorces spécifiques des séquences situées de part et d autre du fragment à amplifier (à colorier en rouge) - la Taq synthétise de nouveaux brins complémentaire à partir de chacune des amorces (à colorier en vert) - une dénaturation à 95 C permet de séparer les brins formés, qui sont de longueur variable - la température diminue (70 C), les amorces se fixent, la taq forme de nouveaux brins, qui ont exactement la longueur du fragment à amplifier. On réalise de nombreux cycles ce qui permet d obtenir un très grand nombre de fragment d intérêt : 2 n molécules obtenues après n cycles soit molécules d ADN en 20 cycles!!! ( amplification exponentielle). Les tubes réactionnels sont placés dans une machine qui contrôlera la température et la durée de chaque phase. expliquer pourquoi les premiers fragments ont une longueur variable, alors que les suivants ont une longueur fixe expliquer pourquoi on utilise une polymérase résistant aux températures élevées. Figure 8 : Principe de la PCR 13

14 Remarque importante : cette technique suppose de connaître la séquence de part et d autre du fragment pour pouvoir synthétiser les amorces nécessaires à la polymérisation. 2. Applications Cette technique a aujourd hui de nombreuses applications car elle permet d amplifier de très petites quantités d ADN, mais elle est couramment utilisée au cours du clonage traditionnel, pour amplifier le fragment souhaité. 14

15 II. Utilisation des techniques de clonage A. Réalisation d une banque d ADN 1. Réalisation d une banque d ADN génomique Pour cloner un fragment particulier d ADN, il faut d abord le purifier Or, un fragment de 1kb, représente 0, % du génome humain!!! Cela revient donc à rechercher une aiguille au milieu d une botte de foin! Deux méthodes permettent de visualiser le fragment : - la technique du Southern (voir plus loin) - le criblage d une banque génomique, c est-à-dire la recherche de clones contenant le fragment dans une population de clones qui contient l ensemble du génome découpés en fragments. Dans la pratique, il est beaucoup plus facile de cloner le gène et de l identifier ensuite que l inverse. On commence donc en général par faire une banque génomique, dans laquelle on recherchera le clone intéressant. Banque génomique = une collection de clones qui possède l ensemble du génome d un organisme découpé en fragments. Principe de la méthode : - purification de l ADN génomique - découpage de l ADN par une enzyme de restriction le génome est sous forme de fragments - incubation des fragments génomiques avec un vecteur ouvert par la même enzyme et une ligase : certains vecteurs intègrent le fragments = vecteurs recombinants - pénétration de chaque vecteur dans une bactérie différente (on joue sur les concentrations pour qu il n y ait statistiquement qu un seul vecteur qui entre dans une bactérie) - sélection des bactéries possédant un vecteur recombinant (résistance à un antibiotique par exemple) Si des colonies dérivant d une seule bactérie sont isolées sur des boîtes de Pétri, chaque colonie bactérienne représente un clone contenant un fragment particulier d ADN. Une collection de plusieurs millions de colonies représente ainsi tout le génome d un organisme Les banques génomiques d ADN de nombreux organismes différents existent actuellement et sont disponibles pour les chercheurs. 15

16 2. Réalisation d une banque d ADNc Il peut être avantageux d obtenir un clone qui ne contient que la séquence codante d un gène, c est-à-dire qui est dépourvu des introns. En effet, les gènes eucaryotes sont souvent si longs, si majoritairement constitués d introns, qu ils sont difficiles à manipuler. On peut obtenir des gènes sans introns en constituant une banque d ADNc ou ADNcomplémentaire. Dans ce cas, il faut isoler les ARNm d une cellule. Grâce à une enzyme particulière, la transcriptase inverse, il est possible de synthétiser de l ADN à partir de l ARNm. Cet ADN est appelé ADNc pour ADN complémentaire. La transcriptase inverse est une enzyme découverte chez les rétrovirus qui ont la capacité de synthétiser une molécule d ADN à partir d une molécule d ARNm On obtient un hétéroduplex ARN/ ADNmonobrin. Pour intégrer cet ADNc dans un plasmide, il faut lui rajouter des extrémités cohésives c està-dire, lui attacher quelques nucléotides correspondant à un site de restriction (celui de l enzyme qui coupe le plasmide qui reçoit l ADNc). Comparaison banque d ADN génomique/ ADN complémentaire Banque d ADN génomique - la plupart des clones ne possèdent qu une partie de la séquence codante de chaque gène - on stocke aussi une grande partie de l ADN non codant (introns, séquences régulatrices ) - chez un même organisme, l ADN issu de différents types cellulaires donne la même banque génomique Banque d ADNc - les clones possèdent la séquence codante d un gène entier - on ne clone que les gènes qui sont transcrits dans une cellule donnée - chez un même organisme,comme les cellules de tissus différents produisent des ARNm différents, on obtient des banques d ADNc différentes - un clone d ADNc contient une séquence codante ininterrompue d un seul gène 3. Sélection des clones porteurs du gène d intérêt Deux techniques possibles : - détection de l ADN par hybridation in situ sur réplique de la boîte: figure 9 - détection de la protéine figure 10 16

17 Figure 9 : criblage d une banque en cherchant l ADN Figure 10 : criblage d une banque en cherchant la protéine expliquer comment est réalisée la réplique et pourquoi l hybridation se fait sur une réplique à partir des figures 9 et 10, expliquer comment les deux techniques permettent d identifier les clones porteurs du fragment d intérêt. 17

18 B. Réalisation de la carte physique d une petite région d ADN Principe La construction de la carte physique de petites régions d ADN a été une des premières applications de la coupure par des enzymes de restriction suivie de la séparation de fragments d ADN par électrophorèse. Une carte physique de l ADN caractérise un segment d ADN sur lequel on représente la position de divers repères (notamment les sites de coupure des nucléases de restriction). Pour cela, on traite une même région d ADN par différentes enzymes de restriction et on compare la taille des fragments obtenus pour déterminer la localisation des sites de restriction. Exercices : pour réaliser les exercices ci-dessous, commencer par dessiner un fragment d ADN (linéaire ou circulaire dans le cas d un plasmide), positionner les sites de restriction sur le fragment en fonction des tailles obtenues...ce n est qu un exercice de logique! Ne pas confondre!!! - la carte physique de l ADN dans laquelle la molécule d ADN est jalonnée de marqueurs moléculaires (sites de restriction, séquences particulières) où les distances sont exprimées en nombre de paires de bases avec - la carte génétique qui est une représentation simplifiée du génome qui consiste à indiquer l emplacement des gènes. Les distances sont exprimées en centimorgan (cm) calculées à partir de la fréquence de recombinaison entre locus de gènes pris deux à deux (voir cours de terminale). Applications : RFLP (voir III, C) 18

19 C. Utilisation de l ADN cloné comme sonde : techniques d hybridation Les techniques d hybridation reposent sur la complémentarité des bases et sur la réversibilité du processus de séparation des deux brins d une molécule d ADN (dénaturation) et de la réassociation des deux brins (renaturation). Le terme d hybridation désigne l étape de renaturation. Les techniques d hybridation reposent sur l utilisation d une sonde, un fragment simple brin d ADN ou d ARN marqué au 32 P, ou couplée à une molécule colorée (cas des hybridation in situ) 1. Technique du Southern blotting Figure 11 Figure 11 : Southern blotting Technique fondamentale, à connaître parfaitement (méthode inventée par Edwin Southern) Exercice 1: Expliquer le principe de la technique Southern blot 19

20 Exercice 2 : 2. Technique du Northern blotting Technique fondamentale, à connaître parfaitement Nom lié à un jeu de mot sur les points cardinaux par rapport au Southern La sonde est de l ADN monocaténaire, mais la cible est un ARN (les fragments qui ont migré sont donc des ARN). On procède de la même façon que précédemment. 3. Hybridation in situ Technique fondamentale, à connaître parfaitement Principe : utilisation d une sonde ARN antisens Cette méthode permet de déterminer dans quelles cellules s exprime (= est transcrit) un gène donné. Pour cela, on utilise une sonde ARN, complémentaire de l ARNm (ARN antisens) qui se fixera donc à cet ARNm exprimé dans la cellule. Cette hybridation in situ est réalisée sur des organismes entiers comme des embryons ( voir cours sur le développement embryonnaire) ou sur des coupes. Comment localise-t-on la sonde??? Différentes méthodes sont utilisées : - sonde marquée avec un antigène la présence de la sonde sera mise en évidence par immunocytochimie - sonde contenant le gène lacz en présence de X-gal, une coloration bleue apparaît. 20

21 Exemple d hybridation in situ sur embryon totaux ou en coupe. Détection de l expression de Xnr-4 chez le Xénope. in Joseph et Melton, Developmental Biology 184, Criblage d une banque d ADN (voir II. A. 3) 21

22 III. Applications des technologies du clonage moléculaire A. Réalisation d un organisme génétiquement modifié 1. Utilisation en industrie et agriculture Les techniques permettent de produire des : - microorganismes (bactéries, levures) produisant des protéines : vaccins, hormones - plantes transgéniques : figure 12 Figure 12 : principe de réalisation d une plante transgénique La réalisation de plantes transgéniques repose sur l utilisation d un plasmide d une bactérie : Agrbacterium tumefaciens qui provoque une maladie appelée la galle du collet (la plante produit des excroissances incontrôlées = tumeurs ou galles, en général au niveau du collet). La formation de tumeurs résulte de l insertion d un fragment (ADN-T) du plasmide Ti (tumor-inducing plasmid) dans le génome de la cellule végétale infectée. On réalise un vecteur à partir de ce plasmide Ti (trop grand pour être manipulé en entier) : ce vecteur possède : - les séquences qui permettent son intégration dans le génome de la cellule infectée - deux gènes de résistance à des antibiotiques - le gène d'intérêt que l on veut introduire dans la plante (par exemple un gène permettant de résister à un insecte). Quels OGM végétaux connaissez-vous? - animaux transgéniques : saumon ayant un transgène codant pour une hormone de croissance figure 13 (les 2 saumons ont le même âge) Figure 13 : saumon transgénique 22

23 2. Utilisation en recherche fondamentale : exemple des KO La technique du KO permet d invalider (=inactiver) un gène Principe : - des cellules souches (cellules ES) sont transformées avec un vecteur portant un gène inactivé - le gène s'insère dans le génome par recombinaison homologue on obtient des cellules ES KO pour le gène étudié - les cellules ES KO sont injectées dans un embryon à un stade précoce : les descendants sont des individus chimériques : certains tissus proviennent de la cellule ES, d autre des cellules de l embryon. - Les souris chimériques sont croisées pour obtenir des souris hétérozygotes puis homozygotes, dont les 2 copies du gène sont KO = invalidées. 23

24 B. Utilisation des RFLP Figure14 + figure 15 L individualité chez l Homme et d autres espèces résulte pour une grande part du polymorphisme élevé de l espèce. Ainsi, les chromosomes humains présentent des différences de séquence environ tous les 1250 kb. Ces différences portent parfois sur des sites de restriction, qui sont ainsi éliminés ou crées. Les fragments obtenus suite à l action d enzymes de restriction auront donc des longueurs variables selon les individus : ce polymorphisme est appelé polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP). Les fragments sont visibles grâce à l utilisation d une sonde (technique du Southern). Les RFLP sont très utilisés en médecine pour poser par exemple le diagnostic d une maladie héréditaire. Ces diagnostics sont réalisés à partir de cellules fœtales prélevées : - dans le liquide amniotique - au niveau des villosités chrorioniques (cellules du placenta) Remarque : le fragment étudié est dans un premier temps amplifié par PCR, avant d être soumis à la digestion. Exemple : détection de la drépanocytose 24

25 Figure 14 : détection des RFLP Expliquer pourquoi on ne peut pas identifier directement les fragments sur gel d agarose avec du BET. 25

26 Document 15 : utilisation des RFLP Expliquer les résultats du document 15. Préciser quelle technique a été utilisée. C. Utilisation des microsatellites et minisatellites De courtes séquences telles que GTGTGT... se répètent en tandem de façon extrêmement variable selon les individus. Les fragments de restriction n ont donc pas, dans ce cas également, la même longueur selon les individus. La probabilité que 2 individus sans liens familiaux aient un microsatellite ayant le même nombre de répétitions est d environ 1/1milliard. Lorsque plusieurs microsatellites sont analysés en même temps, la probabilité diminue encore et est théoriquement de zéro. Auparavant, les microsatellites étaient analysés, entre autres, par la méthode RFLP. Cette méthode est aujourd hui remplacée par une amplification par PCR ciblant certaines régions polymorphiques de l ADN. Après électrophorèse des fragments amplifiés, la taille de ceux-ci étant représentative du nombre de répétitions, on peut identifier l individu auquel appartient l échantillon d ADN. Figure 16 Concluez sur le test de paternité présenté figure 16. Figure 16 : test de paternité 26

27 D. Thérapie génique somatique L objectif de cette méthode est de corriger un phénotype de maladie en traitant quelques cellules somatiques chez la personne atteinte ( thérapie génique germinale, où l on introduit le gène dans des embryons à un stade précoce de développement). Cette technique s applique à des maladies dont le phénotype est dû à des gènes exprimés de façon prédominante dans un tissu. Les vecteurs utilisés actuellement sont des virus inactivés : - rétrovirus : historiquement, le premier à avoir été utilisé. Il pose le problème de l insertion aléatoire du transgène dans le génome (voir cours sur les virus). - adénovirus : il attaque en temps normal l épithélium respiratoire en y injectant son génome. L intérêt est que le génome ne s intègre pas dans les chromosomes de la cellule hôte. Ce virus est actuellement utilisé dans le traitement de la mucoviscidose. 27

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