Détection et évaluation des infections plasmodiales par sérologie des anticorps anti-plasmodium

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1 REDACTEURS VERIFICATEURS APPROBATEUR DESTINATAIRES David COURTIN Franck REMOUE Participants au projet PALEVALUT Date : 25/08/13 Date : 28/08/2013 Date : 20/11/2013 Biologistes Objet : La procédure définit la méthode d évaluation du niveau d exposition à Plasmodium falciparum (transmission / infection) de l homme par la mesure quantitative (ELISA) des réponses anticorps IgG spécifiques d antigènes de stades pré-érythrocytaires (CSP) et érythrocytaires (AMA-1, MSP-1 19, GLURP). Cette procédure a été mise au point dans le cadre du réseau AMANET (African Malaria Network Trust). Ces indicateurs immunologiques servent à évaluer non seulement la présence (OUI/NON) et l intensité de transmission/infection présentes et/ou passées (1 à 6 mois) mais également l efficacité opérationnelle de la lutte antipaludique. Application : Le document est élaboré pour le personnel chargé de l évaluation immunologique intégrée aux études épidémiologiques et parasitologiques. Documents associés : 0 Annexes : 8 (A à H) Historique des modifications : Date Version Nature de la modification 25/08/ Création de la POS 28/08/ Correction FR (Bénin) 01/09/ Prise en compte des remarques DC (Bénin) 24/09/ Approbation FR 14/11/ Modification IVW et prise en compte DC 05/07/ Correction coquille coating (5.2.1) Table des matières 1 Introduction Objectif Responsabilités Matériels Chimiques Solutions Anticorps secondaire:

2 4.4 Echantillon de références Antigènes Matériels Instruments et logiciel Echantillons Sérums Préparation de la gamme de référence Méthodes Précautions Mode opératoire Références Annexes Introduction Les stratégies de lutte ont pour objectifs de diminuer la morbidité/mortalité et la transmission du paludisme. Elles évoluent au fil des apparitions des résistances des moustiques vecteurs aux insecticides et des parasites aux traitements et le choix des stratégies de lutte devrait reposer sur l identification des mesures les plus efficaces au moindre coût. Pour cela, il est nécessaire de développer des indicateurs fiables pour permettre d évaluer les différents moyens mis en œuvre pour lutter contre le paludisme. La variabilité du risque de transmission palustre au sein des populations est fréquemment décrite mais difficile à évaluer avec les outils classiques d entomologie et de parasitologie car leurs mises en œuvre sont contraignantes. Pour lutter efficacement, identifier le niveau de transmission/infection du paludisme (avant et après intervention) serait utile. Cibler les efforts de lutte rendrait cette dernière plus efficace. Il est donc nécessaire de disposer d indicateurs fiables de la transmission des parasites dans le temps et dans l espace. Les indicateurs immunoépidémiologiques ont l avantage de repérer les infections passées (effet cumulatif) au niveau individuel, d être sensibles (détection Ac anti-plasmodium chez un individu négatif pour méthodes parasitologiques) et simple d utilisation. Cette mémoire de la réponse anticorps aux infections passées permet d être moins sensible aux fluctuations saisonnières et même journalières de l exposition au paludisme que des paramètres directs comme l EIR ou les données de prévalences parasitaires [1, 2]. De plus, dans les zones où la transmission est faible, l évaluation de la lutte par les indices paludométriques «conventionnels» (indice plasmodique, i.e. taux de prévalence des infections plasmodiales chez les enfants de 2-9 ans ; taux d inoculation entomologique) est laborieuse. La sérologie est, dans ce contexte, un outil d intérêt majeur, et en particulier le seul permettant d identifier des infections antérieures (1 à 6 mois avant le prélèvement). La POS BIO-INFECT s intègre aux évaluations épidémiologiques et parasitologiques (POS EfficacInfection et EfficacAPNC) pour lesquelles un prélèvement de sang au bout du doigt sera réalisé (voir POS BIO-PREL). 2

3 2 Objectif Quantifier les anticorps IgG dirigés contre les antigènes des stades pré-érythrocytaire (CSP) et érythrocytaire (AMA-1, MSP-1, GLURP) de P. falciparum afin d estimer l intensité d exposition des individus aux infections plasmodiales, intensité de transmission (stade pré-érythrocytaire) versus infection (stade érythrocytaire). 3 Responsabilités - Epidémiologiste : intégration de la procédure biomarqueur d infection dans la demande de la clairance éthique ; coordination de la mise en œuvre des prélèvements de sang (sérum cf. POS BIO- PREL), de la formation et de la supervision du personnel infirmier responsable de la collecte des échantillons de sang. - Infirmier de terrain : réalisation de la collecte des échantillons de sang au cours des études épidémiologiques et parasitologiques - Biologiste/immunologiste : stockage des échantillons et dosage ELISA des réponses IgG anti-csp (NANP), AMA-1, MSP1 et GLURP, analyse des résultats immunologiques. 4 Matériels 4.1 Chimiques Acide Sulfurique (H 2 SO 4 10M, Bie&Berntsen, Ref : BBB ) Tween-20 (Merck Eurolab, Ref : ) TMB ONE (KEM EN TEC, Ref : 4380) PBS tablets (Gibco, Ref : ) BSA (Bovine Serum Albumin IgG and protease free, Interchim, Ref : WU1640) Lait en poudre (écrémé 0% de gras, Régilait/Vitamilk) Chlorure de sodium (NaCl, Merck Eurolab, Ref : ) Rouge de Phénol (Merck Eurolab,, Ref : ) Azide de sodium 10% (Boom, Ref : ) Eau distillée 4.2 Solutions Solutions : Annexes : Tampon de coating (PBS 1X / Rouge de phenol 0,001%) Annexe A Tampon de saturation (PBS 1X / 0,1% Tween-20 / 3% Lait) Annexe B Tampon de dilution de l échantillon biologique (PBS 1X / 0,1% Annexe C Tween-20 / 1% Lait / 0,02% Azide de sodium) Tampon de lavage (PBS 1X / 0,1% Tween-20 / 0,5% NaCl) Annexe D Tampon de révélation (TMB ONE) Annexe E Tampon de dilution des anticorps secondaires (PBS 1X / 0,1% Annexe F Tween-20 / 1% lait) Tampon de fixation (H 2 SO 4 0,2M) Annexe G 4.3 Anticorps secondaire: IgG de chèvre anti-igg humaines couplées à la peroxydase HRP (Caltag/Invitrogen, Ref: H10007) 3

4 4.4 Echantillon de références Echantillon Réference : Fournisseur : IgG humaines purifiées (5 mg/ml) BP055 The Binding Site Positif Pool d individus immuns UMR216 IRD Négatif Pool Non Immuns UMR216 IRD Blanc : PBS 1X Gibco 4.5 Antigènes Antigène Réference : Fournisseur : AMA Pichia pastorius BPRC (E. Remarque) MSP-1 19 Baculovirus IP Paris (S. Longacre) BSA-GLURP Peptide GPS 1358 GENECUST BSA-CSP Peptide CSP GENECUST BSA Interchim WU1640 ou GENECUST Peptide GLURP (GPS 1358) couplé à la BSA : EDKNEKGQHEIVEVEEIL Peptide CSP couplé à la BSA: NANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNVDPNVDP 4.6 Matériels Pipettes 1-20µl, µl, µl, µl Pipettes Multicanaux (P200, P1000) Réservoir en plastique 50 ml (distribution des tampons, Dominique Dutscher, Ref : ) Plaques 96 puits fond plat en polystyrène (Nunc / Dominique Dutscher, Ref : Maxisorp F ) Film adhésif transparents pour plaque ELISA (SIGMA, Ref : A EA) Cônes pour micropipettes de 0-20, µl, µl et µl Tubes Falcon 50 ml et 15 ml (Dominique Dutscher, Ref : et Ref : ) Tubes Eppendorf 1,5 ml et 2 ml (Dominique Dutscher, Ref : et Ref :012000A) Tubes de transfert 1,2 ml (Dominique Dutscher, Ref : ) Capuchon tube de transfert (Dominique Dutscher, Ref :104418) Récipients / béchers (verrerie) de 500 ml, 1000, 2000 ml Mouchoirs Sopalin Papier aluminium 4.7 Instruments et logiciel Laveur de plaque ELISA Lecteur de plaque ELISA Agitateur magnétique Chronomètre Ordinateur Logiciel de calcul des données (Excel) 4.8 Echantillons Sérums Sérums prélevés sur Microtainer : voir POS BIO-PREL 4

5 Dilution de l'échantillon : 1/200 pour l ensemble des antigènes excepté AMA-1 (dilution au 1/2000). NB : Un ajustement de la dilution peut être nécessaire selon le type d échantillons (Enfants, Adultes), d antigènes et le degré d exposition au paludisme Préparation de la gamme de référence Pour la quantification des anticorps, inclure dans chaque plaque, une gamme de référence (courbe standard) composée d'igg purifiée de concentration connue (1mg/ml). Pour la courbe standard, des dilutions en séries (1/2) seront réalisées dans les colonnes 1 et 2 (duplicat, voir partie ). Les concentrations de la gamme sont 100; 50; 25; 12.5; 6.25; 3.13; 1.56; 0.78 ng / ml. Préparer la solution de gamme pour 12 plaques nécessite la préparation d'une solution stock à 500 ng/ml par transfert de 5 µl d'igg purifiée standard à 1 mg / ml dans 9,995 ml de coating buffer (1:2000). Ensuite, préparer 8 tubes marqués de 1 à 8 pour réaliser une série de dilution (1/2) de la gamme a. Dans le tube 1, déposer 8 ml de tampon de coating. b. Déposer 3 ml de tampon de coating dans les tubes 2 à 8. c. Transférer 2 ml de la solution stock (500 ng/ml) dans le tube 1, et bien mélanger. d. Transférer 3 ml du tube 1 dans le tube 2, et bien mélanger. e. Transférer 3 ml du tube 2 dans le tube 3, et bien mélanger. f. Transférer 3 ml du tube 3 dans le tube 4, et bien mélanger. g. Transférer 3 ml du tube 4 dans le tube 5, et bien mélanger. h. Transférer 3 ml du tube 5 dans le tube 6, et bien mélanger. i. Transférer 3 ml du tube 6 dans le tube 7, et bien mélanger. j. Transférer 3 ml du tube 7 dans le tube 8, et bien mélanger. Les 12 plaques permettent de quantifier les anticorps de 432 échantillons dirigés contre un même antigène 5 Méthodes 5.1 Précautions - Respecter les temps et les conditions d'incubation - Bien laver les plaques afin d'éviter des biais issus de résidus de lavage - Préparer les tampons selon les protocoles et bien respecter les conditions de conservation (c.f. annexes) 5.2 Mode opératoire Sensibiliser (coater) la plaque en déposant a) 100 µl/puits de la gamme (voir ) dans les colonnes 1 et 2 de chaque plaque et b) 100 µl/puits d'ag (CSP, MSP1, AMA1, GLURP et BSA) dilué dans du coating buffer (Annexe A) à 1 µg/ml dans les colonnes 3 à 12. Couvrir la plaque avec un film en plastique. Chaque plaque doit être identifiée : nom de l antigène, type d anticorps, numéro 5

6 de série, date et le nom du manipulateur. Incuber les plaques une nuit à 4 C. Les plaques peuvent être stockées pendant 7 jours entre 2 et 8 C Les échantillons biologiques (plasmas ou sérums ou éluats) doivent être dilués au 1:200 (antigènes CSP, MSP1, GLURP) ou au 1:2000 (antigène AMA1) dans le tampon de dilution d'échantillon (Annexe C). Les dilutions peuvent être stockées pendant 2 jours. entre 2 et 8 C Retirer la plaque du réfrigérateur et laver 4 fois avec du tampon de lavage (Annexe D). Après chaque étape de lavage, laisser le tampon de lavage dans la plaque pendant 1mn. Tapoter la plaque sur du papier absorbant après le dernier lavage. Déposer 150 µl de tampon de saturation (Annexe B) et incuber la plaque à température ambiante (22 C-25 C) pendant 1h Vider la plaque, tapoter et laver 4 fois avec du tampon de lavage. Après chaque étape de lavage, laisser le tampon de lavage dans la plaque pendant 1mn. Déposer 100 µl de tampon de dilution (Annexe F) dans les puits des colonnes 1 et 2, 100 µl de contrôles positifs, de contrôles négatifs, et de blanc en duplicat dans les puits correspondants des colonnes 3 et 4 (voir plan de plaque en ), puis 100 µl des échantillons tests dilués dans les puits correspondants des colonnes 3 à 12 selon le plan de plaque. Incuber pendant 2h sous agitation à température ambiante (22 C-25 C) Laver 4 fois les plaques avec du tampon de lavage. Après chaque étape de lavage, laisser le tampon de lavage dans la plaque pendant 1mn et bien tapoter la plaque après le dernier lavage Déposer 100 µl/puits d'anticorps secondaire anti-igg humaines couplé à la peroxidase dilué au 1:3000 dans du tampon de dilution (Annexe F). Incuber pendant 1h sous agitation à température ambiante (22 C-25 C). NB : Attention, sortir et laisser revenir le tampon de révélation (TMB ONE) à température (22 C- 25 C) ambiante 1h avant utilisation Laver 4 fois les plaques avec du tampon de lavage. Après chaque étape de lavage, laisser le tampon de lavage dans la plaque pendant 1mn et bien tapoter la plaque après le dernier lavage Déposer 100 µl/puits de tampon de révélation (Annexe E). Incuber à température ambiante (22 C-25 C) pendant 30 mn à l'abri de la lumière Déposer 100 µl de H 2 SO 4 à 0,2M (Annexe G) et lire la plaque à 450 nm dans le lecteur de plaque. Enregistrer les résultats sous fichier texte sans la colonne des lettres (A à H) et la ligne des nombres (1 à 12), et sans les espaces dans les données. Ce fichier texte peut être enregistré sous notepad ou wordpad La conversion des valeurs de l'absorbance en Unité Arbitraire est réalisée en utilisant Microsoft Excel et un autre logiciel 6

7 Pour chaque manipulation, remplir le protocole de travail (Annexe H) Plan de plaque A Ref IgG 100 ng/ml Ref IgG 100 ng/ml Ctrl+-1 Ctrl+-1 Ech -5 Ech -5 Ech 13 Ech 13 Ech 21 Ech 21 Ech 29 Ech 29 B C D E F G H 50 ng/ml 50 ng/ml Ctrl--1 Ctrl--1 Ech -6 Ech 6 Ech 14 Ech 14 Ech 22 Ech 22 Ech 30 Ech ng/ml 25 ng/ml Blanc Blanc Ech -7 Ech 7 Ech 15 Ech 15 Ech 23 Ech 23 Ech 31 Ech ng/ml 12.5 ng/ml Blanc Blanc Ech 8 Ech 8 Ech 16 Ech 16 Ech 24 Ech 24 Ech 32 Ech ng/ml 6.25 ng/ml Ech - 1 Ech -1 Ech 9 Ech 9 Ech 17 Ech 17 Ech 25 Ech 25 Ech 33 Ech ng/ml 3.13 ng/ml Ech -2 Ech -2 Ech 10 Ech 10 Ech 18 Ech 18 Ech 26 Ech 26 Ech 34 Ech ng/ml 1.56 ng/ml Ech -3 Ech -3 Ech 11 Ech 11 Ech 19 Ech 19 Ech 27 Ech 27 Ech 35 Ech ng/ml 0.78 ng/ml Ech -4 Ech -4 Ech 12 Ech 12 Ech 20 Ech 20 Ech 28 Ech 28 Ech 36 Ech 36 6 Références 1 Drakeley CJ, Corran PH, Coleman PG, et al Estimating medium- and long-term trends in malaria transmission by using serological markers of malaria exposure. Proc Natl Acad. Sci. U S A 102: Bousema T, Drakeley C, Gesase S, et al Identification of Hot Spots of Malaria Transmission for Targeted Malaria Control J.Infect.Dis. 201: Dodoo, D., M. Theisen, J. A. Kurtzhals, B. et al Naturally acquired antibodies to the glutamate-rich protein are associated with protection against Plasmodium falciparum malaria. J.Infect.Dis. 181: Oeuvray, C., Theisen M., Rogier C.et al Cytophilic immunoglobulin responses to Plasmodium falciparum glutamate-rich protein are correlated with protection against clinical malaria in Dielmo, Senegal. Infect.Immun. 68: Courtin D., Oesterholt M., Huissman H et al., The quantity and quality of African children s IgG responses to Plasmodium falciparum asexual stage antigens reflect protection against infection and disease. PLoS ONE 4:e

8 7 Annexes Annexe A Tampon de coating PBS 1X contenant 0,001% rouge de phénol Volume: 1L Date de production: Produits Volume lot no.: Volume utilisé PBS 2 tablettes Etapes effectuées ( ) 0,001% rouge de phénol Déposer 1 ml de 1 % de rouge phenol dans 1L H 2 O distillée 1000 ml PROCEDURE: 1. Déposer 2 tablettes de PBS dans une flaque contenant 1000 ml d'h2o distillée et un barreau magnétique, 2. Placer la bouteille sur agitateur magnétique sans chauffage. 3. Ajouter 1 ml d'une solution à 1 % de Phénol rouge. La solution de 1 % de Phénol rouge est préparée par ajout de 0,1 g de Phénol rouge dans 10ml d'h 2 O distillée. ETIQUETTE: - Tampon de coating + date + initiales STOCKAGE: 3 mois entre 2 C et 8 o C Rédigé par:, le Nom Date 8

9 Annexe B Tampon de saturation PBS 1X contenant 3 % de lait en poudre, 0,1% Tween-20 Volume: 1L Date de production : Produits Volume Lot no.: Volume utilisé Etapes effectuées ( ) PBS Lait en poudre Tween 20 H 2 O distillée 2 tablettes 30 g 1 ml 1000 ml PROCEDURE: 1. Déposer 2 tablettes de PBS dans une flasque contenant 1000 ml d'h 2 O distillée et un barreau magnétique, puis placer la flasque sur agitateur magnétique sans chauffage. 1. Ajouter 30 g de lait en poudre. 2. Ajouter 1 ml de Tween 20 et agiter jusqu'à obtenir une solution homogène. ETIQUETTE: - Tampon de saturation + date + initiales STOCKAGE: Utiliser le tampon de saturation frais. Rédigé par :, le Nom Date 9

10 Annexe C Tampon de dilution de l échantillon biologique (plasma, sérum ou éluat de sang) PBS 1X contenant 1 % lait en poudre, 0,1% Tween-20 et 0,02% d azide de sodium (Na-az) Volume: 1L Date de production: Produits Volume Lot no.: Volume utilisé Etapes effectuées ( ) PBS 2 tablettes Lait en poudre 10 g Tween 20 1 ml 10% azide de sodium 2 ml H 2 O distillée 1000 ml PROCEDURE: 1. Déposer 2 tablettes de PBS dans une flasque contenant 1000 ml d'h 2 O distillée et un barreau magnétique, 2. Placer la flasque sur agitateur magnétique sans chauffage. 3. Ajouter 10 g de lait en poudre. 4. Ajouter 1 ml de Tween Ajouter 2 ml de la solution d azide de sodium à 10 % et agiter jusqu'à obtenir une solution homogène. La solution à 10 % d azide de sodium est préparée par dissolution de 4 g d azide de sodium dans 40 ml d'h2o distillée. ETIQUETTE: - Tampon de dilution de l échantillon biologique + date + initiales STOCKAGE: 3 semaines entre 2 et 8 o C Rédigé par:, le Nom Date 10

11 Annexe D Tampon de lavage PBS 1X contenant 0,1% de Tween-20 et 0,5 M de NaCl Volume: 5L Date de production: Produits Quantité Lot no.: Quantité utilisée PBS 10 tablettes Tween-20 5 ml NaCl 145 g H 2 O distillée 5000 ml Etapes effectuées ( ) PROCEDURE : 1. Mettre 10 tablettes de PBS dans une boîte contenant 5000 ml d'h 2 O distillée et un barreau magnétique, puis placer la bouteille sur agitateur magnétique sans chauffage. 2. Ajouter 145g de NaCl. 3. Ajouter 5 ml de Tween-20 et agiter jusqu'à obtenir une solution homogène. ETIQUETTE: - Tampon de lavage + date + initiales STOCKAGE: 1 semaine à température ambiante Rédigé par:, le Nom Date 11

12 Annexe E Tampon de révélation TMB ONE Volume: 10 ml par plaque de 96 puits Produits Quantité Lot no.: Volume utilisé Etapes effectuées ( ) TMB (3,3, 5,5 - Tetramethylbenzidine) Solution de substrat Prêt à l'emploi, Ajouter 100ul/puits 4380 PROCEDURE: La solution de TMB commerciale est prête à l'usage. 1. Transférer la quantité nécessaire dans un réservoir de 50ml couvrir avec du papier aluminium avant utilisation. ETIQUETTE: - TMB solution de substrat STOCKAGE: La solution de TMB est stockée à 4 C; Attention, laisser revenir à température (22 C-25 C) ambiante avant utilisation Rédigé par:, le Nom Date 12

13 Annexe F Tampon de dilution des anticorps secondaires PBS 1X contenant 1 % lait en poudre et 0,1% Tween-20 Volume: 1L Date de production: Produits Volume Lot no.: Volume utilisé Etapes effectuées ( ) PBS Lait en poudre Tween-20 H 2 O distillée 2 tablettes 10 g 1 ml 1000 ml PROCEDURE: 1. Déposer 2 tablettes de PBS dans une bouteille contenant 1000 ml d'h2o distillée et un barreau magnétique, puis placer la bouteille sur agitateur magnétique sans chauffage. 2. Ajouter 10 g de lait en poudre. 3. Ajouter 1 ml de Tween 20 et agiter jusqu'à obtenir une solution homogène. ETIQUETTE: - Tampon de dilution des anticorps + date + initiales STOCKAGE: 1 semaine entre 2 et 8 o C Rédigé par:, le Nom Date 13

14 Annexe G Tampon de fixation Solution de H 2 SO 4 à 0,2 M Volume: 1L Date de préparation: Produits Volume Lot no.: Volume utilisé Etapes effectuées ( ) 10M H 2 SO 4 H 2 O distillée 20 ml 980 ml PROCEDURE: 1. Ajouter le volume indiqué d'eau dans une flasque. 2. Ajouter le volume indiqué de 10M H 2 SO Laisser refroidir à température ambiante ETIQUETTE : - 0,2 M H 2 SO 4 + date + initiales STOCKAGE: - 8 mois à température ambiante Rédigé par:, le Nom Date 14

15 Annexe H Fiche de suivi : IgG ELISA Date: Objectif: Valider N de série.: ( ) Init Coating Ajouter 100 µl/puits de a) la solution de gamme en duplicats dans les puits des colonnes 1 et 2 et b) Ag : dans du PBS 1X à 1 µg/ml dans les colonnes 3 à 12. Plaque: NUNC Maxisorp Date du coating: 4 C Lavage Tampon de lavage 4 x 1 min. Saturation 150 l/puits de tampon de saturation 1 h sous agitation à température ambiante Lavage Tampon de lavage 4 x 1 min. Incubation avec l'anticorps primaire Echantillons dilués à 1: dans du tampon de dilution. Ajouter 100 l/puits 2 h sous agitation à température ambiante Lavage Tampon de lavage 4 x 1 min. Incubation avec l'anticorps secondaire anti-human IgG couplé à la peroxidase (Caltag) dilué 1:3000 dans le tampon de dilution. Ajouter 100µl/puits 1 h sous agitation à température ambiante Lavage Tampon de lavage 4 x 1 min. Ajout de tampon de révélation - réaction colorimétrique Arrêt de la réaction 100 l/puits de substrat 30 min. à température ambiante à l'abri de la lumière 100 l/puits de 0,2 M H 2 SO 4, Lire l'absorption à 450 nm A Ref IgG100ng/ml Ref IgG 100 ng/ml Ctrl+-1 Ctrl+-1 Ech -5 Ech -5 Ech 13 Ech 13 Ech 21 Ech 21 Ech 29 Ech 29 B 50 ng/ml 50 ng/ml Ctrl--1 Ctrl--1 Ech -6 Ech 6 Ech 14 Ech 14 Ech 22 Ech 22 Ech 30 Ech 30 C 25 ng/ml 25 ng/ml Blanc Blanc Ech -7 Ech 7 Ech 15 Ech 15 Ech 23 Ech 23 Ech 31 Ech 31 D 12.5 ng/ml 12.5 ng/ml Blanc Blanc Ech 8 Ech 8 Ech 16 Ech 16 Ech 24 Ech 24 Ech 32 Ech 32 E 6.25 ng/ml 6.25 ng/ml Ech - 1 Ech -1 Ech 9 Ech 9 Ech 17 Ech 17 Ech 25 Ech 25 Ech 33 Ech 33 F 3.13 ng/ml 3.13 ng/ml Ech -2 Ech -2 Ech 10 Ech 10 Ech 18 Ech 18 Ech 26 Ech 26 Ech 34 Ech 34 G 1.56 ng/ml 1.56 ng/ml Ech -3 Ech -3 Ech 11 Ech 11 Ech 19 Ech 19 Ech 27 Ech 27 Ech 35 Ech International. Pour accéder à une copie de cette licence, merci de vous rendre à l'adresse suivante ou envoyez un courrier à Creative Commons, 444 Castro Street, Suite 900, 15

16 H 0.78 ng/ml 0.78 ng/ml Ech -4 Ech -4 Ech 12 Ech 12 Ech 20 Ech 20 Ech 28 Ech 28 Ech 36 Ech 36 Commentaires : 4.0 International. Pour accéder à une copie de cette licence, merci de vous rendre à l'adresse suivante ou envoyez un courrier à Creative Commons, 444 Castro Street, Suite 900, 16