Analyse des mutations d EGFR. Dr I Rouquette Anatomie Pathologique CHU Rangueil

Transcription

1 Analyse des mutations d EGFR Conditions, premier bilan Dr I Rouquette Anatomie Pathologique CHU Rangueil

2 EGFR Dimérisation

3 La mutation de l EGFR : une mutation clé Une mutation à l originedechangements conformationnels et fonctionnels du récepteur (1) Plus grande affinité pour les inhibiteurs de tyrosine kinase compétiteurs de l ATP (1,3) 1. Gazdar AF. Activating and resistance mutations of EGFR in non-small-cell lung cancer: role in clinical response to EGFR tyrosine kinase inhibitors. Oncogene 2009;28 Suppl 1:S Kumar A, Petri ET, Halmos B, et al. Structure and clinical relevance of the epidermal growth factor receptor in human cancer. J Clin Oncol 2008;26: Carey KD, Garton AJ, Romero MS, et al. Kinetic analysis of epidermal growth factor receptor somatic mutant proteins shows increased sensitivity to the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, erlotinib. Cancer Res 2006;66: Sharma SV, Bell DW, Settleman J, et al. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. Nat Rev Cancer 2007;7:169-81

4 Gène EGFR: bras court du chromosome 7. Mutations: domaine tyrosine kinase exons 18 à 21

5 Mutations d EGFR 3% 5% 3% 48% Femmes, non fumeurs, asiatiques Somatiques, acquises, événement causal. 10 à 16,6% caucasiens, 30 à 50% asiatiques

6 Rechercher la mutation Recherche d anomalies ponctuelles de l ADN: altérations génétiques identifiées exons 18 à 21. Techniques de biologie moléculaire comprenant toutes une étape d extraction de l ADN et une étape d amplification de la zone d intérêt. Résultat qualitatif: OUI/NON La FISH et l immunohistochimie ne font pas partie de ces techniques. La quantité et la qualité de l ADN extrait ont un impact sur la détection des mutations

7 Le matériel disponible en pratique deux cas de figure: - Matériel abondant: patient opéré de sa tumeur en rechute (on a la pièce opératoire initiale) ou opéré d une métastase. Matériel de petite taille: Matériel de petite taille: Biopsies bronchiques Biopsies de sites métastatiques Biopsies sous contrôle TDM Cytologies d épanchement, de cytoponction Attention au volume et au nombre des biopsies, la quantité de tissu est un facteur limitant et le diagnostic est la priorité!

8 Formol neutre tamponné: fixateur de référence Congélation si possible Bouin Dubosq à proscrire

9 Les méthodes de détection Publications: séquençage direct détermination de la succession des nucléotides composant l ADN. Mais plusieurs méthodes de criblage rapides et sensibles. Choix: expertise, équipements. Pas de standardisation à ce jour. Pas d études comparatives à grande échelle.

10 Le séquençage PCR amplification spécifique de l exon Purification Réaction de séquençage Purification Séquençage capillaire (détection des pics de fluorescence des ddntp)

11 Séquençage AVANTAGES INCONVENIENTS Technique de référence publications Typage exhaustif (détection de variants rares) Équipements présents plateformes Reste Intéressant sur échantillon bien sélectionné (Rosell) Longue (ampli, séquençage, purification, lecture délicate, peu automatisable) -coûteuse Peu sensible sur tissu fixé Risque de contamination (ouverture du tube post-amplification) Risque de faux négatif si peu de cellules tumorales dans l échantillon

12 Sequencing on a Genetic analyzer Sequence reading exon 21 heterozygousmutation p.l858r: c.2582 T>G

13 HRM Technique qui permet, après une PCR, de discriminer, sur une montée en température très progressive, les différents variants amplifiés, avec un fluorochrome intercalant qui sature les structures doubles brins et permet de distinguer des variations, même d une seule base, selon le profil de dénaturation.

14 PCR HRM avant normalisation HRM normalisé HRM dérivée seconde Témoins non mutés Patient muté L858R L858R SNP R836R

15 Evolution Internationale: première AMM pour un ITK (Tarceva) obtenue en 2005 mais en deuxième ligne sans obligation de déterminer le statut mutationnel IPASS Mok 2009: bénéfice en première ligne versus chimio pour les patients mutés: AMM Iressa Nationale: Ermetic 2005 Financement INCa 2009: 28 plateformes nationales de génétique moléculaire des cancers: recherche de mutations dans les adénocarcinomes: coûts de désarchivage et réalisation du test.

16 Locale: 2005 projet ligue: séquençage de 100 patients acquisition d une expertise formation technicien Tenon 2007 demande d activité nouvelle: acquisition d équipements et budget fonctionnement sur 2 ans pour commande réactifs 2009 : intégration plateforme biologie moléculaire des cancers du CHU (E Delabesse) 2009 ORPAMIP: Structuration de la biologie moléculaire.(kras, EGFR, MSI, 1p19q). 2010: Subvention EGFR INCa: pas de facturation clinicien patient, remboursement déstockage

17 Circuit des examens de biologie moléculaire EGFR Kras MSI1p19q Pathologiste de la plateforme Pathologiste détenteur du matériel CHG, CHU, Secteur Privé

18 Le prescripteur: «Je veux demander une recherche de mutation d EGFR à la plateforme, que dois-je faire?» 1- je m assure de l indication Tous les patients atteints d un adénocarcinome du poumon devraient pouvoir avoir accès au test EGFR pour déterminer le statut mutationnel de leur tumeur.

19 PRESCRIPTION DE GENOTYPAGE EGFR exons 19 à je remplis la fiche de prescription Service d'anatomie Pathologique et Histologie-Cytologie du Pr M.B. Delisle CHU Rangueil, Bt L2-1 avenue Jean Poulhès - TSA Toulouse Cedex 9 Responsables : Dr Isabelle Rouquette, Camille Allera Moreau. Tél Accueil Fax Comment se la procurer? Identification PATIENT Nom :. Nom de jeune fille : Prénom :.. Date de naissance :././. Adresse :. -Sur le site Oncomip Identification MEDECIN PRESCRIPTEUR (Nom et coordonnées dont tel et fax) Identification A. PATHOLOGISTE REFERENT détenteur du matériel tumoral (Nom et coordonnées dont tel et fax) Date de la demande de génotypage EGFR : / / je l adresse au pathologiste qui détient le prélèvement Matériel tumoral à analyser : Tabagisme : Biopsie bronchique Fumeur Biopsie pulmonaire sous scanner Non fumeur Pièce opératoire (lobectomie, pneumonectomie) Site métastatique, préciser : Indication : Date du prélèvement : / / 20.. Stade de la maladie :. Remarques : FICHE à compléter par le médecin prescripteur de l examen et à envoyer au médecin pathologiste en possession du prélèvement tumoral du patient. Cette fiche sera secondairement envoyée au laboratoire de génotypage par le pathologiste avec le

20

21 L anatomo-pathologiste détenteur du matériel: «je reçois la fiche de prescription que dois-je faire?» 1 - je complète la fiche de transfert pour génotypage et 2- je l adresse à l anapath référent de la plateforme avec mon compte-rendu anapath et le bloc sélectionné - Auparavant je m assure que la quantité de matériel est suffisante (plus de 20% de cellules tumorales viables) et le fixateur adéquat et congélation tumorothèque régionale? Comment se la procurer? -Sur le site Oncomip TRANSFERT de MATERIEL TUMORAL pour GENOTYPAGE Service d'anatomie Pathologique et Histologie-Cytologie du Pr M.B. Delisle CHU Rangueil, Bt L2-1 avenue Jean Poulhès - TSA Toulouse Cedex 9 Responsables : Dr Isabelle Rouquette, Camille Allera Moreau. Tél Accueil Fax MATERIEL TUMORAL A ENVOYER Prescripteur : o 1 fragment de tumeur (fixée et incluse en paraffine ou congelée) o Choisir un bloc riche en cellules tumorales MATERIEL TUMORAL TRANSMIS PAS DE FIXATION BOUIN, ni autre fixateur à base d acide picrique. Eviter AFA. Bloc n % de cellules tumorales : Tumeur primitive Métastase Congelé C Transport tumorothèque Régionale RNA later Fixé et inclus en paraffine Fixateur utilisé (indispensable) : Fixé Formol 10 % Date de fixation. Autre formol AFA Autre : Fiche à compléter par le pathologiste et à envoyer au laboratoire réalisant le génotypage, accompagnée : 1. Du prélèvement tumoral 2. De la fiche de prescription du clinicien 3. Du compte-rendu anapath. A l adresse suivante : Service d'anatomie Pathologique et Histologie-Cytologie du Pr M.B. Delisle CHU Rangueil, Bt L2-1 avenue Jean Poulhès - TSA Toulouse Cedex 9

22 Sur la plateforme, le personnel de l accueil, le technicien référent S assurent de la conformité de la demande: - Formulaire de demande d examen: Nom et adresse du prescripteur, renseignements cliniques, justification de l examen - Formulaire de transfert: Nom de l anatomo-pathologiste, compte-rendu associé, fixateur et qualité du matériel vérifiés En cas de non-conformité la personne concernée est prévenue pour correctif et le dossier mis en attente: la date de demande de l examen prise en compte est celle à laquelle la plateforme est en possession du dossier complet.

23 Déroulement d une manip LUNDI M: enregistrement et validation des derniers dossiers arrivés par courrier ou mail.à partir de 10 h: coupes colorées des blocs extérieurs et congelés pour contrôle morphologique: validation ou rejet Coupes cryotome ou cryostat dédié en vue de l extraction AM: déparaffinage + digestion overnight protéinase K MARDI M: Fin Extraction ADN puis contrôle qualité ADN extrait sur gel et nanovue AM: HRM MERCREDI M:analyse lecture courbes HRM +PCR AM: contrôle produit PCR sur gel JEUDI M: purification, dosage nanovue produit PCR et dilution AM : réaction séquence et purification VENDREDI: suite purification LUNDI: séquenceur MARDI: analyse des séquences: 15 à 20 min par cas. MERCREDI: secrétariat

24 LUNDI

25 LUNDI

26 Déparraffinage digestion LUNDI MARDI Extraction Hotte PSM

27 MARDI Contrôle qualité ADN génomique (1) Nanovue quantité qualité

28 électrophorèse MARDI MERCREDI Lecteur de gel Témoin de masse Paraffine Formol Matériel congelé 300PB

29 MERCREDI L858R T>G R836R C>T

30 MERCREDI PCR

31 JEUDI PURIFICATION PRODUITS PCR Nanovue pour adapter la concentration par rapport à la taille de l amplicon

32 Réaction de séquence ADN amplicon+ amorce + dntp + ddttp ADN amplicon+ amorce + dntp + ddatp ADN amplicon + amorce + dntp + ddctp ADN amplicon+ amorce + dntp + ddgtp 8 heures JEUDI séquenceur Purification produit de séquence LUNDI électrophorégramme Absorbe taq p ddntp fluos 45 minutes par patient VENDREDI

33 MARDI Lecture de séquence: LONG++ tous prélèvements en dupliquat forward et reverse

34

35 Bilan 2009 De mai à décembre (7 mois): 55 cas, 54 adénocarcinomes 24 hommes, 31 femmes Prescriptions: CHU:39 (71%) CHG Rodez: 8 (15%) ICR: 2 (3%) Divers: 6 (11%) 13 mutations (23%), 18%F, 5%H: 5 mutations 19, 4 femmes, 1 homme 6 mutations 21, 4 femmes, 2 hommes 2 mutations exon 20, 2 femmes JANVIER 2010: 50 CAS

36

37

38

39 Mutation EGFR pour le cancer du poumon 2 e Trimestre Technique utilisée et mutations recherchées HRM et séquençage Nombre de laboratoires effectuant le test au sein de la plateforme Nombre d examen effectués au cours du 2 e trimestre Nombre de patients Nb de patients avec mutation ou autre anomalie Résultats du test EGFR Nb de patients sans mutation ou autre anomalie Nb de patients avec un résultat non interprétable 16 patients soit 13,9 % Nombre de prescriptions établissement plateforme (CHU-ICR) Nombre de prescriptions établissements hors plateforme CHG PRIVES 7-21 jours Délais de rendu du résultat (jours) Dont moins de 15 jours jours ,11% 49,37% 13,29% Nombre d exclus (matériel insuffisant, histologie 32 épidermoïde, fixateur Bouin) Nb de patients avec mutation ou autre anomalie : 14 Nb de patients avec un résultat non interprétable ou 16 (14 AFA) non amplifié Non interprétable ou non amplifié Exon (AFA) Non interprétable ou non amplifié Exon (AFA) Non interprétable ou non amplifié Exon 19 uniquement 1 (AFA) Non interprétable ou non amplifié Exon Nb de patients re-techniqués 13 % de patients mutés 12,17% Prélèvements hors indications (épidermoïde) 7 Panne de séquenceur Repasses techniques. 14/16 prélèvements (87,5%) ayant un résultat non interprétable étaient fixés à l AFA.

40 Résultats Nationaux 2 E trimestre: 3215, délai 11 jours de médiane De 3 à 30 jours selon plateformes

41 203 patients 14,28% de mutations 8,8% d échecs liés à AFA Premier semestre 2010 Fin deuxième trimestre: 50% moins de 15 jours temps secrétariat +WE compris Délais allongés: repasses techniques, panne séquenceur, une manip semaine. Actuellement: 11 jours. Comment progresser encore?

42 Démarche Nationale

43 II.3. Assurer des tests de qualité «La mise en place d un programme de contrôle qualité. Celui-ci concernera les 28 plateformes pour la phase analytique de l analyse. Des programmes de contrôles qualité de la phase préanalytique seront aussi mis en place pour les pathologistes».

44

45 Démarche de la plateforme Fixateur: passer au formol et congeler++ Fixateur et petits fragments: Changer les amorces, passer à des techniques qui souffrent moins de la fragmentation de l ADN: taqman, analyse de fragments, WGA. Délais: passer à deux manip semaine: pb créneaux machines, personnel, simplifier les techniques, moins de séquençage direct. Transmission des résultats: patients mutés: téléphone, mail Contrôle qualité National: ERMETIC ORPAMIP: Lien informatique dossier ONCOMIP: alertes RCP prescription et lien direct compte-rendu validé. Simplification formulaires Réunions d information Qualité: simplification des procédures, validations de méthode un interlocuteur pour tous les dossiers hors plateforme contrôles qualité croisés au sein de la plateforme.

46

47

48

49 PRESCRIPTION DE GENOTYPAGE EGFR POUMON Numéro INSC : Numéro ONCOMIP : A COMPLETER PAR LE MEDECIN PRESCRIPTEUR DE L EXAMEN ET A ENVOYER AU MEDECIN PATHOLOGISTE EN POSSESSION DU PRELEVEMENT TUMORAL DU MALADE Identification du Malade Date de la demande du test EGFR: / / NOM : Matériel tumoral à analyser : Biopsie PRENOM : Résection chirurgicale DATE DE NAISSANCE : Date de prélèvement : / / Statut tabagique : Identification MEDECIN PRESCRIPTEUR NOM /COORDONNEES : Remarques : Tel : Fax : A COMPLETER PAR LE PATHOLOGISTE ACCOMPAGNEE : 1. Du prélèvement tumoral (1 fragment de tumeur fixée et incluse en paraffine ou congelée/ choisir un bloc riche en cellules tumorale). 2. De cette fiche de prescription remplie. 3. Du compte-rendu anapath. ET A ENVOYER AU LABORATOIIRE REALISANT LE GENOTYPAGE EGFR, A l ADRESSE SUIVANTE : Service d Anatomie Pathologique du Pr Delisle Service d Anatomie Pathologique et Histologie Cytologie CHU Rangueil 1 avenue Jean-Poulhès TSA TOULOUSE Cedex 9 Responsables : Dr Isabelle Rouquette, Mélanie Boussard tel Secrétariat fax ! PAS DE FIXATION BOUIN, ni fixateur à base d acide picrique. Eviter AFA. Identification PATHOLOGISTE REFERENT MATERIEL TUMORAL TRANSMIS : (détenteur du matériel tumoral) NOM/COORDONNEES : N examen anapath + n du bloc : Tumeur primitive Métastases : ganglionnaires Cérébrales Autres : Tissu congelé OUI NON TEL : - Enregistrement en Tumorothèque OUI NON FAX : - Si oui préciser le n : Bloc fixé en paraffine OUI NON Préciser le fixateur (indispensable):

50 Conclusion Le séquençage d EGFR entre en «routine» Cercle vertueux: amélioration continue Concilier exigence de qualité/rapidité Importance d homogénéiser les pratiques et du contrôle qualité local, national, européen? Quid des nouveaux biomarqueurs (matériel dédié?) Importance du rôle de l anatomo-pathologiste. Possibilité de développer une biologie moléculaire de proximité (techniques simples fiables reproductibles) mais contrôle qualité ++.

51 II.2.4. Vers une inscription des tests à la nomenclature des actes médicaux À terme, ces examens ont vocation à être inscrits à la nomenclature : la CCAM pour les examens d anatomie et cytologie pathologiques et la NABM pour les examens de biologie. Il seront alors réalisables par l ensemble des pathologistes et des biologistes quel que soit leur lieu d exercice, à condition qu ils respectent les conditions d assurance qualité mises en place au sein des plateformes.