Diagnostic biologique des maladies infectieuses

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1 Diagnostic biologique des maladies infectieuses Maria Mamani Matsuda 20 janvier 2016 Pour... Pourquoi identifier l agent infectieux? définir le traitement comprendre l épidémiologie définir les conseils de prévention recherche fondamentale 1

2 Diagnostic traditionnel de Plasmodium falciparum Diagnostic maladie du sommeil: ponction lombaire 2

3 Smear fécal / filtration d urine pour le diagnostic des Schistosomoses. Diagnostic bactérien Examen cyto-bactériologique d'une urine (ECBU), d'une expectoration (ECBC), d'un liquide pleural, d un liquide articulaire, 1- Examen macroscopique 2- Examen microscopique Etat frais Après coloration (simple ou différentielle) 3

4 Diagnostic bactérien Exemple : Culture du bacille tuberculeux (BAAR) sur milieu de Lowenstein-Jensen après > 3 semaines d'incubation à 37 C milieu protégé de la dessication Diagnostic biologique d infection virale - Observation au microscope - Isolement du virus - Sur œuf de poule embryonné (Influenza) - Sur animal (CoxackieA et B paralysie?) - Sur lignée cellulaire : modification des cellules ou du tapis cellulaire? Exemples : nécrose : destructeur des entérovirus amas de cellules arrondies réfringentes, à bords nets, aspect en dentelle, rétraction de la masse cellulaire et son détachement du verre : adénovirus (effet lié à l'action directe d'une protéine virale) syncitium (cellules géantes) : paramyxovirus, oreillons, rougeole, cellules arrondies, très réfringentes, de taille irrégulières, en gouttelettes de mercure : Rhino virus cytomégalies = cellules arrondies et augmentées de volume en petits foyers isolés peu extensifs : CMV cellules arrondies, ballonisées, d'abord groupées en foyers : herpès + Tests immunologiques 4

5 Que cherche-t-on dans ces approches? VOIR le pathogène = techniques de diagnostic biologique direct Problèmes en diagnostic biologique? Diagnostic traditionnel des infections trouver le pathogène certains parasites sont morphologiquement indifférentiables parasites cachés dans différents tissus de l hôte Les techniques actuelles de laboratoire ne sont pas entièrement satisfaisantes Besoin de personnel expérimenté Besoin d équipement Lenteur des résultats 5

6 Solution? Développement de tests (moléculaires) rapides 1. Biochimique (première génération) 2. Immunologique (anticorps) 3. Acide Nucléique Développement de tests cellulaires 4. Suivi des sous-populations cellulaires chez le patient Solution? Développement de tests (moléculaires) rapides 1. Détection d acides nucléiques 2. Détection de protéines (1ère génération) 3. Détection d anticorps 4. Suivi des populations cellulaires de l hôte 6

7 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques A- PCR B- Hybridation avec des sondes spécifiques C- Séquençage D- Micropuces 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques : PCR A- PCR : polymerase chain reaction Amplifie la séquence cible & augmente la sensibilité Connaïtre la séquence? 7

8 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques : PCR DNA/RNA Ribosomales 16s rrna hautement sensible, non spécifique Amplification par amorçage aléatoire (Random primer amplification (PCR-RADP) Extrêmement sensible & non spécifique Amplifier des séquences spécifiques de l ADN génomique hautement spécifique pour une espèce. 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques : PCR 8

9 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques : PCR 16S rrna percent identity within and between genera. Srinivasan et al., Diagnostic basé sur les acides nucléiques : PCR 9

10 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques : séquençage B- Séquençage 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques : hybridation de sondes C- Hybridation avec des sondes spécifiques 10

11 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques : micropuces D- Micropuces (microarrays) 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques : micropuces 11

12 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques : micropuces 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques : micropuces 12

13 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques Avantages : L ADN Génomique est constant parasite& hôte ont des séquences d ADN uniques Très sensible Nécessite une petite biopsie/prélèvement Les sondes peuvent être aisément définies Spécifique pour détecter une seule souche parasitaire Moins spécifique pour détecter un groupe de parasites 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques Inconvénients : Cher PCR en particulier (Besoin de sondes non radioactives) La PCR peut faillir contaminations ou faux positifs Les sondes d ADN ne peuvent distinguer entre les microorganismes vivants et morts 13

14 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques Ex : Maladie de Chagas Kit de PCR pour les protocoles au Brésil But: remplacer le Xenotest 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques Ex : Coqueluche 14

15 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques Ex : Diagnostic de parasitoses vétérinaires Eimeria Southern blot : utilise des sondes ARN ribsosomales (nécessite µg d ADN) PCR: identification d une séquence de 500 pb d ARN ribosomale (nécessite 1pg d ADN-< 10 oocystes) 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques Ex : Diagnostic de parasitoses vétérinaires Cryptosporidium parvum L analyse microscopique fécale (limitéeà 50,000 oocystespar gramme) PCR: amplifie une séquence de 400 pb dans les selles (sensible à 6 oocystes par gramme) 15

16 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques Ex : Diagnostic par PCR de l ADN de Cryptosporidium parvum Échantillon positif 1- Diagnostic basé sur les acides nucléiques Ex : Diagnostic par RT-PCR : Chikungunya Et tant d autres 16

17 2- Diagnostic basé sur les protéines A- Détection d Isoenzymes B- Western Blot C- Immunohistochimie (IHC) D- Immunofluorescence (IF) 2- Diagnostic basé sur les protéines A- Détection d Isoenzymes mêmes activités MAIS migration différente sur gel 17

18 2- Diagnostic basé sur les protéines : Isoenzymes Ex : Les parasites avec profils sur gel différents sont génétiquement distincts Analyse d isoenzymes dans la maladie de Chagas 2- Diagnostic basé sur les protéines : Isoenzymes Enzymes séparées par leur taille : SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide) 18

19 2- Diagnostic basé sur les protéines : Isoenzymes Iso-enzymes séparées par leur charge: électrophorèse bi-dimensionnelle 2- Diagnostic basé sur les protéines : Isoenzymes Diagnostic basé sur le profil enzymatique : Avantages : Technique simple Large nombre d enzymes disponibles Analyse simultannée de plusieurs prélévements Distinction possible de parasites morphologiquement identiques 19

20 Inconvénients : Besoin des tissus spécifiques pour l analyse leishmaniose viscérale (rate, foie), Technique lente 2- Diagnostic basé sur les protéines : Isoenzymes Diagnostic basé sur le profil enzymatique : peut durer plusieurs jours Quelques diagnotics erronés enzyme labile Technique simple mais équipements chers 2- Diagnostic basé sur les protéines : Western blot B- Western blot Marqueurs de PM Echantillons + E Ag? 1-Séparation des protéines en gel de polyacrylamide 2-Transfert sur membrane de nitrocellulose E 3- Révélation par conjugué Ig-enzyme 20

21 2- Diagnostic basé sur les protéines : Western blot But : Recherche d antigènes spécifiques du pathogène par Western blot 2- Diagnostic basé sur les protéines : Western blot Exemple : recherche de HIV 21

22 2- Diagnostic basé sur les protéines : IHC C- Immunohistochimie But :Visualiser un Ag sur une biopsie + ENZ Ag? Toxoplasma IHC ENZ +Substrat coloration MICROSCOPE 2- Diagnostic basé sur les protéines : IF directe D- Immunofluorescence directe But :Visualiser un Ag sur un frottis + F Ag? Bactéries: Legionella F Parasites: Giardia Cryptosporidium MICROSCOPE U.V. 22

23 2- Diagnostic basé sur les protéines Dépend de l identification d anticorps SPECIFIQUES contre le parasite recherché 3- Diagnostic basé sur les anticorps Dépend de l identification d anticorps SPECIFIQUES contre le parasite recherché Indirecte : recherche d anticorps, pas du microorganisme 23

24 3- Diagnostic basé sur les anticorps Avantages : Développement possible de tests rapides Analyse individuelle et analyse de masse Analyse simultannée de plusieurs prélévements Distinction possible de parasites morphologiquement identiques 3- Diagnostic basé sur les anticorps Principales techniques basées sur la détection d anticorps : A- ELISA B- Immunofluorescence Indirecte C- Western blot D- Tests d agglutination E- Bandelettes (TDR) 24

25 3- Diagnostic basé sur les anticorps : ELISA A- ELISA Secondary antibody with label Primary antibody Antigen Ag Ag Ag Microtitre plate well Block unbound sites 3- Diagnostic basé sur les anticorps : ELISA Ex : Diagnostic de la TOXOPLASMOSE ELISA + + E E + S S E Ag Coating Sérum à tester Conjugué Suite plus tard Substrat 25

26 3- Diagnostic basé sur les anticorps : ELISA Ag Marqueur Ac Méthode directe Ag? Intensité du signal Méthode indirecte Ac? Méthode sandwich ou double capture Ag? Concentration en Ag ou en Ac Intensité du signal Méthode par compétition Ag? Concentration en Ag 3- Diagnostic basé sur les anticorps : ELISA Variante : Immunoanalyse par chimioluminescence Ex - Diagnostic d infection par HVC par automates (ARCHITECT, Abbott) -A Particule + VHC Ag Sérum à tester Anti-IgG humaines Conjugué à l acridinium + solution d activation 26

27 3- Diagnostic basé sur les anticorps : IFI B- Immunofluorescence indirecte Ex - Diagnostic de la TOXOPLASMOSE Ac anti-toxoplasme 3- Diagnostic basé sur les anticorps : IFI Ex :Diagnostic d une maladie infectieuse: BILHARZIOSE Recherche d Ac dirigés contre l Ag de l épithélium intestinal de Schistosome 27

28 3- Diagnostic basé sur les anticorps : IFI Ex :Diagnostic d une maladie infectieuse: BILHARZIOSE Ac anti-épithélium intestinal de Schistosoma mansoni 3- Diagnostic basé sur les anticorps : Western blot C- Western blot Ex : infection par cestode. Sera from patients with cysticercosis react with cysticercosisspecific proteins. Sera from patients with echinococcosis do not react. 28

29 3- Diagnostic basé sur les anticorps : Western blot Ex : Diagnostic d une maladie infectieuse: VIH Ag Electrophorèse sur gel nitrocellulose gel E Transfert sur nitrocellulose Révélation par un conjugué anti Ig - enzyme Feuille de nitrocellulose incubée dans le sérum p 120 p 41 E E Spécificités antigéniques reconnues par les Ac du malade 3- Diagnostic basé sur les anticorps : Western blot Ex : Suivi d une infection par le VIH Témoin positif Témoin négatif Séroconversion 6fev 13fev 20fev 25fev 29

30 3- Diagnostic basé sur les anticorps : Western blot Ex : Suivi d une infection par le VIH Positif si au moins 2 bandes: - soit 2 des 3 glycoprotéines (gp 160, 120 ou 41) - soit p 24 et gp 160 (début de séroconversion) 3- Diagnostic basé sur les anticorps : agglutination D- Agglutination + Agglutination conditionnée Ac Particule Antigène 50 µl sérum + 1 gtte Kline Ag Test négatif Test positif 30

31 3- Diagnostic basé sur les anticorps : agglutination 3- Diagnostic basé sur les anticorps : agglutination 31

32 3- Diagnostic basé sur les anticorps : agglutination Ex : dépistage Maladie du sommeil (THA) IgM anti-trypanosome detectées par simple/rapide CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis) goutte de sang mélange avec parasites fixés carte dépôts granulaires bleutés = infection $ 0.25 / test 3- Diagnostic basé sur les anticorps : agglutination Ex :SERODIAGNOSTIC DE LA SYPHILIS Réaction du V.D.R.L. = Réaction de Kline + Négatif Antigène = cardiolipide Support : charbon 32

33 3- Diagnostic basé sur les anticorps : agglutination Ex : SERODIAGNOSTIC DE LA TOXOPLASMOSE TESTS AU LATEX 3- Diagnostic basé sur les anticorps : TDR E- Tests rapides sur bandelettes (chromatographies phase liquide) SANDWICH Sensibilité >> Inhibition hémagglutination 33

34 R Ac monoclonal de souris anti HCG - 3- Diagnostic basé sur les anticorps : TDR TEST de GROSSESSE négatif T Ac polyclonaux de souris anti HCG C Ac de chèvre anti souris Or colloïdal Mobile en phase liquide Immobile Immobile Urine Or colloïdal R Ac monoclonal de souris anti HCG 3- Diagnostic basé sur les anticorps : TDR TEST Test de de GROSSESSE grossesse négatif négatif T Ac polyclonaux de souris anti HCG C Ac de chèvre anti souris Or colloïdal Mobile en phase liquide Immobile Immobile Urine Or colloïdal 34

35 R Ac monoclonal de souris anti HCG 3- Diagnostic basé sur les anticorps : TDR TEST de GROSSESSE positif T Ac polyclonaux de souris anti HCG C Ac de chèvre anti souris Or colloïdal Mobile en phase liquide Immobile Immobile Or colloïdal Urine + Or colloïdal Or colloïdal HCG 3- Diagnostic basé sur les anticorps : TDR Dépistage salivaire de STUPEFIANTS 35

36 3- Diagnostic basé sur les anticorps : TDR Dépistage salivaire (ou urinaire) de STUPEFIANTS COMPETITION Absence de bande dans la zone Test : Présence de drogue dans le prélèvement C: Ac anti Fc Ac antidrogue*libre(excès) T: Drogue immobilisée Dépôt Positif Négatif 3- Diagnostic basé sur les anticorps : TDR Ex : Maladie de Chagas 1. FATALA kit : mesure les anticorps anti-t. cruzi dans le sang utilisant 2 protéines recombinantes. 2. BIO CHAGAS kit : utilise un cocktail d antigènes recombinants de T. cruzi. Les infections se traduisent par des précipités bleus sur une bandelette en 60 minutes. (0.2 par kit) 36

37 3- Diagnostic basé sur les anticorps : TDR Ex : Malaria Résultats : Négatif Positif 3- Diagnostic basé sur les anticorps Quels progrès à accomplir dans le diagnostic basé sur les Anticorps? Prélèvement non-invasif? salive, excrétions? Définition de nouveaux Ac spécifiques Bons résultats pour les Ac dans salive pour la Trypanosomose Africaine. 37

38 3- Diagnostic basé sur les anticorps Inconvénients : Distinction infection en cours/infection passée? IgM vs IgG ok Distinction de pathogènes morphologiquement similaires? besoin d épitopes immunogènes différents Mise au point longue recherche en amont de la commercialisation R&D 4- Suivi des populations cellulaires CYTOMETRIE EN FLUX Mesures optiques transformées en signaux électriques analysés par système informatique 38

39 4- Suivi des populations cellulaires Paramètres mesurés: - taille - granularité - Ag de surface après marquage avec un anticorps / sonde couplé à un fluorochrome 4- Suivi des populations cellulaires Cellules sanguines : antigènes de surface = CD Marquage par un anticorps couplé à un fluorochrome Excitation 488 nm Emission 525 nm Excitation 488 nm Emission 575 nm 39

40 4- Suivi des populations cellulaires Ex : Identifier des cellules en suspension par leur Ag de surface Marquage Anti CD 4 - FITC Anti CD 8 - PE * * * LT CD 4 + LT CD Suivi des populations cellulaires Cytométrie en flux Ex : Typage CD4/CD8 pour le suivi de l infection par VIH. 40

41 CONCLUSIONS Difficultés dans les méthodes actuelles. Nouvelle méthodes moléculaires 3 directions : Biochimique isoenzymes Anticorps ex. CATT pour le trypanosomiasis; kits pour les Chagas & malaria; Westerns pour les cestodes. ADN ex. kit PCR pour la maladie de Chagas; PCR pour les protozoaires vétérinaires. 41

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