TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE-PHYSIOLOGIE STRESS EXCITOTOXIQUE

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1 CONCOURS EXTERNE SESSION 2001 TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE-PHYSIOLOGIE STRESS EXCITOTOXIQUE Le glutamate est l un des principaux neurotransmetteurs excitateurs du système nerveux central. Dans certaines situations pathologiques ou lésionnelles, il est responsable de stimulations exagérées des neurones appelées stress excitotoxique. Une des caractéristiques principales de ce stress est la surproduction de radicaux libres. L'acide kaïnique est un analogue fonctionnel du glutamate, obtenu à partir de l'algue Digenea simplex. Initialement utilisé comme remède populaire dans le traitement de l'ascariasis, il sert à présent d'agent pharmacologique capable d induire des crises de type épileptique chez les mammifères en causant des dommages sélectifs à certaines structures cérébrales. Il a été montré que les enzymes d'élimination des radicaux libres, telles que la superoxyde dismutase (Cu/Zn SOD), protègent les cellules contre l'action excitotoxique de l'acide kaïnique. On se propose d'étudier l'effet d'un stress excitotoxique au kaïnate ou au glutamate, d une part sur l'activité et la quantité de Cu/Zn SOD, d autre part sur le profil électrophorétique de l ADN génomique. La Cu/Zn SOD (E.C ), première enzyme de la voie de détoxification des radicaux libres, catalyse la réaction suivante : 2 O H + H 2 O 2 + O 2 Les mutations du gène de la SOD chez l homme sont responsables des formes familiales de la sclérose latérale amyotrophique (maladie neurodégénérative). 1

2 1. Mesures de l activité spécifique de la superoxyde dismutase (Cu/Zn SOD) de l hippocampe de souris Une souris témoin et une souris traitée à l acide kaïnique (10 mg/kg par voie intra-péritonéale 3 heures auparavant) sont fournies après euthanasie. Pour chaque souris, prélever les deux hippocampes (suivre les indications des examinateurs) et les placer dans un microtube. Ajouter 100 µl de tampon de lyse. Broyer à l aide du piston GDS fourni. Ajouter alors 100 µl de tampon de lyse et vortexer 15 secondes. Centrifuger 5 minutes à x g. Prélever la totalité du surnageant et mesurer le volume Dosage des protéines par la méthode au BCA Le réactif est constitué d'acide bicinchoninique (BCA) et d'ions cuivriques en milieu alcalin. Les ions cuivreux générés par réduction par les protéines forment avec le BCA un complexe stable et intensément coloré (λ max = 562 nm). Mode opératoire Introduire dans une semi-microcuve pour spectrophotométrie : - Extrait d hippocampe 10 µl - Liquide physiologique 90 µl - Réactif BCA 1 ml - Incuber à l étuve à 37 C pendant 30 minutes. - Lire l'absorbance à 562 nm contre un témoin de compensation convenable. Réaliser une gamme d'étalonnage de 0 à 100 µg de protéines par tube à partir d'une solution de sérumalbumine bovine (SAB) à 1 mg/ml. Compte tenu de l étendue de la gamme d étalonnage proposée, l absorbance n est pas une fonction linéaire de la concentration en protéines. Réactifs - Tampon de lyse : tampon phosphate sodique 0,1 mol/l ; ph 7,0 ; Triton X100 à 0,5 % ; - BCA : mélange extemporané de 5 volumes de BCA ph 11,25 et de 0,1 volume de CuSO 4 à 4 % ; - Liquide physiologique : NaCl à 9 g/l ; - Etalon SAB : SAB à 1 mg/ml en liquide physiologique. Compte-rendu - Présenter un tableau de gamme d étalonnage complet. - Exprimer les résultats obtenus pour les essais en mg de protéines par ml d'extrait. 2

3 1.2. Mesures des activités SOD La mesure nécessite une réaction enzymatique auxiliaire générant un flux de radicaux superoxydes. Cette réaction est catalysée par la xanthine oxydase en présence de xanthine. Les radicaux superoxydes oxydent un chromogène, le chlorure de 2-(4-iodophényl)-3-(4- nitrophénol)-5-phényltétrazolium (INT), en un formazan rouge dont le maximum d'absorption est de 505 nm (réaction indicatrice). Ces mêmes radicaux sont aussi substrats de la SOD. L activité SOD est mesurée par le degré d inhibition apparente de la réaction colorée indicatrice. La relation entre l'activité SOD et le pourcentage d'inhibition de la réaction d'oxydation du chromogène est logarithmique. La vitesse de formation du formazan est mesurée en absence de SOD, définissant ainsi le 0 % d'inhibition. Une gamme croissante de SOD est établie. Pour chaque activité SOD la vitesse est mesurée. Le pourcentage d'inhibition est calculé et la courbe (% d'inhibition) = f (log(activité SOD)) est tracée. Mode opératoire Introduire dans des semi-microcuves pour spectrophotométrie : Substrat SOD à 37 C 0 % d'inhibition 25 µl de diluant 850 µl Etalon 1 25 µl 850 µl Etalon 2 25 µl 850 µl Etalon 3 25 µl 850 µl Etalon 4 25 µl 850 µl Etalon 5 25 µl 850 µl Echantillon de contrôle 25 µl 850 µl Extrait d hippocampe témoin 25 µl 850 µl Extrait d hippocampe «kaïnate» 25 µl 850 µl Les étalons 1, 2, 3, 4 et 5 correspondent respectivement à des dilutions au 1/2, 1/5, 1/10, 1/25 et 1/50 d un étalon SOD fourni à 5,4 U/mL, réalisées avec le diluant. Pour chaque cinétique, mélanger, préincuber 30 secondes à 37 C dans le porte cuve du spectrophotomètre puis ajouter 125 µl de xanthine oxydase et mesurer la variation d'absorbance à 505 nm pendant 2 minutes. Remarque : régler le zéro du spectrophotomètre sur l'air. 3

4 Réactifs - Diluant : tampon phosphate sodique 10 mmol/l ; ph 7,0 ; - Kit RANSOD (RANDOX) - Substrat SOD : xanthine 0,05 mmol/l ; INT 0,025 mmol/l en tampon CAPS 40 mmol/l ; ph 10,2 ; EDTA 0,94 mmol/l ; - Xanthine oxydase à 80 U/L ; - Etalon SOD à 5,4 U/mL. - Contrôle SOD à 1,25 U/mL. Compte rendu - Présenter un tableau précisant le mode opératoire utilisé pour réaliser les dilutions de l étalon. - Quel paramètre statistique serait nécessaire pour exploiter le résultat du contrôle? - Comment pourrait on déterminer ce paramètre? - Calculer les pourcentages d'inhibition pour les étalons et les échantillons. Expliciter le mode de calcul. - Tracer la courbe d'étalonnage. - Déterminer les concentrations d'activité catalytique de chaque extrait et de l échantillon de contrôle. - Calculer l activité spécifique de chaque extrait. - Conclure. 2. Détection immunohistochimique de la SOD dans l hippocampe de rat On se propose de détecter la présence de l'enzyme SOD dans le cerveau de rats témoins et de rats traités à l'acide kaïnique. Environ 16 heures après l'injection intra-péritonéale de 1 ml d'acide kaïnique (10 mg/kg), les animaux sont anesthésiés, sacrifiés. Ils sont ensuite perfusés par voie intra-aortique avec une solution physiologique de rinçage à 37 C puis avec une solution de fixateur (paraformaldéhyde à 4 %, acide picrique à 0,4 % dans du PBS à 4 C). Les cerveaux sont disséqués, rincés en PBS, puis incubés une nuit dans un milieu cryoprotecteur (12 % de saccharose, 0,01 % d'azide de sodium dans du PBS). Les cerveaux sont ensuite congelés par immersion dans de l'isopentane refroidi à -60 C. Des coupes transversales (18 µm d'épaisseur) sont réalisées au niveau de l'hippocampe sur un cryostat, récupérées sur des lames gélatinées, et stockées au congélateur à -20 C. Deux coupes de cerveau sont fournies sur une même lame (rat témoin et rat traité). La détection immunohistochimique met alors en œuvre un anticorps polyclonal de chèvre anti-sod puis un anticorps secondaire anti-chèvre couplé à de la biotine puis un système de révélation conjugué streptavidine-peroxydase avec substrat diaminobenzidine (DAB). Les coupes ont été préincubées 30 minutes dans une solution contenant 1 % d albumine sérique bovine dans du PBS (PBS-BSA) additionné de 0,1% de Triton X-100. Elles ont été traitées pendant une nuit à 4 C par l'anticorps primaire anti-sod, dilué au 1/500 dans une solution de PBS-BSA. 4

5 Mode opératoire - Rincer les coupes 3 fois 10 minutes avec 200 µl de PBS. - Déposer 200 µl d une solution de PBS-BSA contenant l anticorps secondaire biotinylé dilué au 1/200 et incuber 30 minutes à température ambiante. - Rincer les coupes 3 fois 10 minutes avec 200 µl de PBS. - Déposer 100 µl d une solution de PBS-BSA contenant le conjugué streptavidine-peroxydase dilué au 1/200 et incuber 30 minutes à température ambiante. - Rincer les coupes 2 fois 10 minutes avec 200 µl de PBS. - Rincer les coupes 1 fois 10 minutes avec 200 µl de tampon Tris HCl 0,05 mol/l ; ph 7,6. - Incuber les coupes avec 100 µl de solution de DAB additionnée de 2 µl d H 2 O 2 à 9 % et surveiller l apparition du précipité au microscope. - Rincer en tampon Tris HCl 0,05 mol/l ; ph 7,6. - Respecter scrupuleusement les consignes de sécurité lors de la manipulation de la solution de DAB. - Recouvrir d une lamelle et observer le signal dans les cellules granulaires de l hippocampe (voir schéma fourni en annexe). Réactifs - PBS : tampon phosphate sodique 6,5 mmol/l ; ph 7,2 + NaCl 131 mmol/l ; - PBS-BSA : PBS + albumine sérique de bœuf à 1 % ; - DAB : solution de diaminobenzidine à 0,025% en tampon Tris HCl 0,05 mol/l ; ph 7,6 ; - PBS-BSA + anticorps biotinylé ; - PBS-BSA + conjugué streptavidine-peroxydase ; - Tris HCl 0,05mol/L ; ph 7,6. Compte rendu - Analyser et interpréter les observations. - Justifier la perfusion intra-aortique d'une solution physiologique de rinçage à 37 C. - Quelle est l action du fixateur et quelles sont ses limites d utilisation? 3. Extraction et analyse électrophorétique de l'adn génomique On dispose d'une lignée cellulaire dérivée par immortalisation conditionnelle à partir de culture primaire d'hippocampe embryonnaire de souris (HiB 5 ; Renfrantz, P.J., Cunningham M.G. et Mc Kay R.D.G Cell 66, ). Deux cultures de HIB 5 ont été réalisées, l'une en absence et l'autre en présence de glutamate à une concentration de 2,5 mmol/l pendant 24 heures. Les cellules ont été récoltées et lavées en PBS. Deux culots cellulaires sont finalement à disposition. Mode opératoire 5

6 Extraction de l ADN génomique - Resuspendre les deux culots cellulaires dans 500 µl de tampon PK préchauffé à 55 C. - Ajouter 40 µl de protéinase K à 20 mg/ml, incuber 1 heure à 55 C avec une agitation toutes les 20 minutes environ. - Extraire l'adn en ajoutant 500 µl d'un mélange phénol - chloroforme - alcool isoamylique (PCAIA) (25/24/1 v/v/v), vortexer 15 secondes puis centrifuger 10 minutes à x g à température ambiante. - Prélever 450 µl de la phase aqueuse sans prélever l'interface. - Ajouter 45 µl d'acétate de sodium à 3 mol/l, mélanger vigoureusement et ajouter 1 ml d'éthanol absolu. - Mélanger par retournements. Centrifuger 10 minutes à x g à température ambiante. - Eliminer le surnageant, laver avec 500 µl d'éthanol à 80 %. - Centrifuger 5 minutes à x g à température ambiante - Eliminer la totalité du surnageant. - Laisser sécher le culot 10 minutes sous la hotte. - Ajouter 50 µl de tampon TE et placer 15 minutes à 37 C. - Resuspendre par aspirations - refoulements. Quantification par photométrie - Diluer dans une semi-microcuve pour photométrie U.V. 5 µl d extrait d ADN génomique dans 500 µl d eau distillée. - Mesurer les absorbances à 260 nm et à 280 nm. Electrophorèse - Prélever la même quantité d ADN génomique pour les deux extraits (10 µg maximum). Compléter à 16 µl avec de l eau distillée et ajouter 4 µl de solution de dépôt. - Déposer sur un gel d'agarose à 2 % en TBE additionné de bromure d éthidium (BET) la totalité de chaque échantillon préparé ainsi que le marqueur de taille (échelle 100 pb). - Mettre sous tension à 10 V/cm. - Visualiser le résultat de l'électrophorèse par transillumination U.V. Donnée : une solution d ADN double brin à 50 µg/ml a une absorbance de 1,00 à 260 nm. 6

7 Réactifs - Tampon PK : Tris HCl 10 mmol/l ; ph 8,0 ; NaCl 300 mmol/l ; EDTA 2 mmol/l ; SDS 0,5 % m/v (à conserver à température ambiante) ; - Protéinase K à 20 mg/ml en eau distillée ; - Mélange phénol - chloroforme - alcool isoamylique (3-méthyl-1-butanol) en proportions volumiques 25/24/1. Le phénol utilisé est saturé en TE ; - Tampon TE : Tampon Tris HCl 8 mmol/l ; ph 7,4 et EDTA 0,8 mmol/l ; - Tampon TBE : tampon Tris Borate EDTA ; - Gel d'agarose : gel à 2 % d'agarose en TBE contenant 0,2 µg/ml de bromure d'éthidium ; - Tampon d'électrophorèse : TBE ; - Solution de dépôt : 20 % de glycérol ; 0,2 % de bleu de bromophénol et 0,2 % de xylène cyanol en TBE ; - Acétate de sodium 3 mol/l ; - Ethanol absolu ; - Ethanol 80 %. Compte rendu - Analyser et interpréter les résultats. 7

8 ANNEXE Cellules granulaires de l hippocampe Coupe transversale de cerveau de rat 8