Mémoire Présenté SUR LE THEME:

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1 N d Ordre.../LABIOGENE UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE EN SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE (UFR/SVT) LABORATOIRE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET DE GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE (LABIOGENE) Mémoire Présenté Par : Ragnagnewendé Serge Théophile SOUBEIGA Pour l obtention du Master II de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées de l Université de Ouagadougou SUR LE THEME: Evaluation de la performance des tests Abbott Real Time HIV-1 Qualitative (Abbott) et Generic HIV DNA Cell (Biocentric) pour le diagnostic de l infection au VIH-1 chez les enfants de moins de 18 mois nés de mères séropositives Soutenu le. devant le jury composé de : Président : Pr Lassana SANGARE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Membres : Pr Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Dr Virginio PIETRA, Chargé de Recherche, Université de Brescia, Italie

2 Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA De nos jours, les connaissances avancées en génétique et biologie moléculaires sont incontournables pour conduire des études de hautes valeurs ajoutées en sciences biologiques. Les outils de la Biologie moléculaire ont permis d accomplir de grands progrès dans le domaine du diagnostic, de la pharmacie, de la thérapeutique, de l agriculture et même dans l aide à la justice par l identification humaine. Les Universités et les laboratoires de recherche des Pays membres de l UEMOA dans leur grande majorité, restent arrimés aux pays et laboratoires de recherche du Nord pour leurs besoins en recherches et activités en génétique et biologie moléculaires. Cet état de fait est lié au déficit en personnel qualifié et le manque de ressources financières et matériel pour conduire les recherches en local in situ. Cela a pour conséquence, une non maîtrise de la finalité ainsi que de l utilisation des résultats et produits des recherches que nous conduisons, une surenchère du coût des examens et des études en biologie et génétique moléculaires. Un autre corollaire et non des moindres de cet état de fait est la fuite de capitaux mais également la fuite des cerveaux car les étudiants les plus compétents envoyés dans les pays du Nord ont tendance à y rester. Le master en Biologie Moléculaire et en génétique moléculaires appliquées (BioGeMA) a pour but de combler le vide constaté dans l expertise en génétique et biologie moléculaires par la mise à disposition des pays de l espace UEMOA, de personnels qualifiés, de haut niveau de compétences pour conduire des études et recherches en génétique et biologie moléculaires. Le master BioGeMA est : Un Master à dimension sous-régionale Géré par un réseau de chercheurs et praticiens en génétique et biologie moléculaires Soutenu par une plateforme technologique sous-régionale à LABIOGENE Ce Master a pour objectif de former des biologistes, des pharmaciens, des vétérinaires et des médecins biologistes capables d effectuer des diagnostics biomoléculaires dans des centres hospitaliers et d élaborer des études d investigations dans des structures de recherches. En outre, il ouvrira la porte d études doctorales aux meilleurs étudiants pour permettre la formation de chercheurs et d enseignants-chercheurs afin d assurer la relève du corps enseignants, la constitution d une masse critique d experts africains et la mise en place d un véritable réseau africain de recherche dans le domaine ci-dessus cité. Professeur Jacques SIMPORE Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire UFR/SVT -École Doctorale Sciences et Technologies Université de Ouagadougou

3 Dédicaces Nous dédions ce travail de recherche : A mon père François SOUBEIGA, A ma mère Marie Rose YONI A mes frères et sœur Joël, Damien, Nadine et Laurent A toutes les mères suivant le protocole de la PTME au CMSC A toutes les personnes Enfants et Adultes vivant avec le VIH/SIDA au Burkina Faso

4 Remerciements Ce travail a été réalisé au laboratoire du Centre Médical Saint Camille à Ouagadougou au Burkina Faso (CMSC) et au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI (CERBA). Nous tenons à exprimer notre profonde gratitude : Au Professeur Lassana SANGARE, Professeur titulaire, Chef de service du laboratoire de Bactériologie-Virologie du CHU-YO, pour avoir accepté de présider le jury de notre soutenance. Au Professeur Jacques SIMPORE, Professeur titulaire, Coordonnateur du Master de Biologie et de Génétique Moléculaires Appliquées (BioGeMA), Directeur du laboratoire du Centre Médical Saint Camille à Ouagadougou, Directeur du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI /Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (CERBA/LABIOGENE), Recteur de l Université Saint Thomas d Aquin à Saaba, notre Directeur de Mémoire pour son encadrement et pour son soutien dans la réussite de notre Master de recherche. Au Docteur Virginio PIETRA, Chargé de Recherche à l Université de Brescia en Italie, pour sa collaboration et pour avoir accepté être membre du jury de notre soutenance Au Docteur Cyrille BISSEYE, Enseignant en master 2 BIOGEMA, pour l encadrement au laboratoire et dans la rédaction de ce mémoire de Master 2 A Rebecca COMPAORE et à Elsa ASSENGONE pour leur soutien lors de nos manipulations Au personnel du laboratoire du CMSC et du CERBA pour leur bonne collaboration A toute autre personne qui de près ou de loin ont participé à la réalisation et à la qualité de notre travail A mes parents, frères et sœur pour leurs soutiens et encouragements

5 Résumé Introduction : La PCR qualitative en Temps Réel est une technique largement utilisée dans le cadre médical, pour la détection virale en analyse clinique de routine. Plusieurs tests qualitatifs comme Abbott Real Time HIV-1 Qualitative d Abbott et Generic HIV DNA Cell de Biocentric peuvent en effet, être utilisés pour le diagnostic précoce du VIH-1 chez les enfants de moins de 18 mois nés de mère VIH positive dans le cadre de la Prévention de la Transmission Mère-Enfant (PTME) au Centre médical Saint Camille à Ouagadougou. Leur performance peut être évaluée en comparant les résultats ainsi que leur sensibilité et leur spécificité. Méthode : Des échantillons de DBS ont été collectés chez 160 enfants nés de mères séropositives suivant le protocole de la PTME et 40 enfants dont les mères ne suivent pas le protocole de la PTME. Tous les échantillons ont été testés avec le test Abbott Real Time HIV- 1 Qualitative et les 40 échantillons ont en plus été testés avec le test Generic HIV DNA Cell. Pour le test Generic HIV DNA Cell, l ADN a été extrait avec le kit Qiagen et l appareil 7500 Fast Real Time PCR de Applied Biosystems a été utilisé pour l amplification. Les données ont été analysées avec SPSS version 17.0 et EpiInfo version 6,0. Résultats : Les résultats de notre étude ont montré une concordance de 100 % (Kappa=1, Z=32, p < 0,001) entre les tests Abbott Real Time HIV-1 Qualitative et Generic HIV DNA Cell. Cette étude de recherche a permis de montrer la forte sensibilité (1 copie d ADN VIH/PCR), la simplicité, la rapidité ainsi que le faible coût du test Generic HIV DNA Cell par rapport au test Abbott Real Time HIV-1 Qualitative (50 copies d ADN VIH/PCR. Aussi le taux de transmission était nul (0,0 %) chez les enfants dont les mères étaient sous traitement (prophylaxie ou HAART) et de 15,0 % chez les enfants dont les mères ne suivent pas le protocole de la PTME. Conclusion : Le test Generic HIV DNA Cell peut aussi être utilisé en routine au centre médical Saint Camille dans le cadre de la PTME. Aussi, le protocole de la PTME appliqué chez une mère VIH (+) est très efficace et réduit très significativement (p < 0,001) le risque de transmission du VIH à l enfant par rapport à une mère VIH (+) qui ne suit pas ce protocole. Mots clés : PCR qualitative en Temps Réel ; VIH ; PTME

6 Abstract Introduction: Qualitative Real-Time PCR is a technique widely used in the medical setting, for viral detection in clinical routine analysis. Several qualitative tests such as Abbott Real Time HIV-1 Qualitative (Abbott Molecular) and Generic HIV DNA Cell (Biocentric) tests can indeed be used for early diagnosis in children who are less than 18 months old, born to HIVpositive mothers in Prevention of Mother To Child Transmission (PMTCT) in Saint Camille medical Center in Ouagadougou. Their performance can be assessed by comparing the results of two tests and their sensitivity and specificity. Method: Dried blood spots (DBS) samples were collected from 160 children born to HIVpositive mothers following PMTCT protocol and 40 children born to HIV-positive mothers not following PMTCT protocol. All samples were tested with test and 40 samples were tested with Abbott Real Time HIV-1 Qualitative and Generic HIV DNA Cell tests respectively. For the Generic HIV DNA Cell test, DNA was extracted with a Qiagen kit and the equipment used for amplification was Applied Biosystem s 7500 Fast Real-Time PCR. Data were analyzed using SPSS version 17.0 and EpiInfo Version 6.0. Results: The results of our study showed 100% concordance (Kappa=1, Z=32, p < 0,001) between the Abbott HIV-1 Real Time Qualitative and the Generic HIV DNA Cell tests. This research study has demonstrated the high sensitivity (1 copie of HIV DNA / PCR), simplicity, speed and low cost of the Generic HIV DNA Cell test from the Abbott Real Time HIV-1 Qualitative test (50 copies of HIV DNA / PCR). As the transmission rate was zero (0.0 %) in children whose mothers were under treatment (prophylaxis or HAART) and 15.0% in whose mothers do not follow the PMTCT protocol. Conclusion: The Generic HIV DNA Cell assay can also be used routinely in Saint Camille Medical Center in the PMTCT. Also, the PMTCT protocol applied on mothers HIV (+) is very efficacy and very significantly (p < 0,001) reducing HIV transmission risk to infants contrary to mother HIV (+) not following up this protocol. Key words: Qualitative Real-Time PCR; HIV; PMTCT

7 Table des matières Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA...2 Remerciements...4 Résumé...5 Abstract...6 Liste des figures...9 Liste des tableaux Liste des sigles et abréviations Introduction REVUE BIBLIOGRAPHIQUE Diversité génétique du VIH Organisation structurale du VIH Structure du VIH Organisation du génome du VIH Mécanisme d infection par le VIH et évolution de l infection Mécanisme d infection par le VIH Evolution de l infection virale Modes de transmission du VIH Prévention de la transmission mère-enfant du VIH Techniques de diagnostic de l infection par le VIH Diagnostic indirect Test ELISA Tests de dépistage rapides (TDR) Techniques de PCR en Temps Réel PCR quantitative en Temps Réel Méthodes de quantification de la charge virale PCR qualitative en Temps Réel : Dried Blood Spot (DBS) OBJECTIFS DE L ETUDE Objectif principal Objectifs spécifiques MATERIEL ET METHODES Cadre et période d étude Matériel d étude... 35

8 3.2.1.Population d étude et collecte des échantillons Recrutement des patients Aspect éthique Analyse des données Matériel utilisé Méthodes PCR qualitative avec Abbott Real Time HIV-1 Qualitative Extraction de l ADN viral Amplification de l ADN viral extrait PCR qualitative avec Generic HIV DNA Cell Extraction de l ADN viral Amplification de l ADN extrait RESULTATS Protocole de Prévention de la Transmission mère-enfant du VIH au CMSC Taux de transmission mère-enfant du VIH-1 au CMSC Performance en terme de détection de l infection au VIH-1 chez les enfants de moins de 18 mois au CMSC Coût des tests DISCUSSION CONCLUSION ET PERSPECTIVES REFERENCES... 50

9 Liste des figures Figure 1 : Les différents groupes de VIH-1 infectant l homme...15 Figure 2 : Structure du VIH Figure 3 : Organisation du génome du VIH Figure 4 : Etapes du cycle viral...18 Figure 5: Evolution de l infection par le VIH Figure 6 : Etapes de la PCR...22 Figure 7 : Principe de la reverse transcription...23 Figure 8 : Principe de la PCR en Temps Réel...25 Figure 9 : Chimie des sondes Beacons...26 Figure 10 : Principe des sondes FRET en tandem...28 Figure 11 : Principe des sondes Taqman...30

10 Liste des tableaux Tableau 1 : Les options de programme de la PTME...20 Tableau 2 : Comparaison des tests Abbott Real Time HIV-1 Qualitative et Generic HIV DNA Cell...33 Tableau 3 : Prophylaxie chez les enfants...43 Tableau 4 : Répartition des mères suivant ou non le protocole de la PTME et résultats des PCR des enfants...44 Tableau 5: Concordance des tests Abbott Real Time HIV-1 Qualitative et Generic HIV DNA Cell

11 Liste des sigles et abréviations Ac : Anticorps ADN : Acide désoxyribonucléique Ag : Antigène ARN : Acide ribonucléique ARV : Antirétroviral AZT/3TC : Zidovudine/Lamivudine CERBA/LABIOGENE : Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI/ Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire CMH : Complexe Majeur d Histocompatibilité CMSC : Centre Médical Saint Camille CNLST : Conseil National de Lutte Contre le SIDA et les IST CRF : Circulating Recombinant Form DBS : Dried Blood Spot EFV : Efavirenz ELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay Env : Enveloppe Gag : Groupe antigène Gp : Glycoprotéine HAART : Highly Active Antiretroviral Therapy HLA : Human Leucocyte Antigene Ig : Immunoglobuline 11

12 INNTI : Inhibiteur non Nucléosidique de la Transcriptase Inverse NVP : Névirapine OMS : Organisation Mondiale de la Santé ONUSIDA : Organisation des Nations Unies Syndrome de L immunodéficience acquise Pol : Polymérase PTME : Prévention de la Transmission Mère-Enfant du VIH RT-PCR : Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction SIV : Simian Immunodeficiency Virus TARV : Traitement antirétroviral ZDV : Zidovudine 12

13 Introduction Le nombre de personnes vivant avec le VIH/SIDA dans le monde est estimé à 34,0 millions en fin 2011 (ONUSIDA, 2011 et 2012). Les adultes (15-49 ans) représentaient 30,1 millions, les femmes 16,8 millions et les enfants (de moins de 15 ans) 3,4 millions (ONUSIDA,2011). L Afrique sub-saharienne compte à elle seule 23,5 millions soit 69% des personnes infectées dans le monde (ONUSIDA, 2012). Au Burkina Faso, la prévalence du VIH est variable. Elle représente 2,5% chez les individus âgés de 15 à 24 ans ; 2,3% chez les femmes enceintes et 16,0% chez les travailleuses de sexe (CNLST, 2009). Grâce à la forte disponibilité des antirétroviraux (ARV), le nombre de personnes nouvellement infectées par le VIH a chuté depuis En 2011, le nombre de nouvelles infections établies était de 2,5 millions en recul par rapport aux 3,2 millions en 2001 (ONUSIDA,2012). Le Burkina Faso relevait une décroissance de % entre (ONUSIDA,2012). Le diagnostic moléculaire du VIH-1 chez les sujets infectés ainsi que le suivi des sujets sous traitement antirétroviral sont possible grâce à la PCR (réaction de polymérisation en chaîne). La PCR est devenue un outil essentiel en biologie moléculaire et son application dans la détection des acides nucléiques a révolutionné l analyse quantitative des gènes et de leurs messagers. Ce concept technologique a rapidement évolué au cours de ces dernières années, et le nombre croissant des applications de la PCR a contribué au développement de la PCR quantitative et/ou qualitative en Temps Réel. La PCR en Temps Réel, est une technique très utilisée pour la détection qualitative des génomes viraux. Elle est beaucoup plus fiable et plus sensible que les techniques en point final (PCR classique). La PCR en Temps Réel est une technique qui donne la possibilité de suivre au cours du temps (en temps réel ), cycle par cycle le processus de la PCR à l aide de la fluorescence (Higuchi et al.,1992). Le nombre d enfants infectés par an ne cessait d augmenter jusqu en 2002, année où il a atteint son niveau maximum d environ En 2010, il est passé à selon les estimations (OMS, 2012). La transmission mère-enfant du VIH-1 peut se faire in utero, pendant l accouchement, et après la naissance à travers l allaitement maternel (Kourtis et al., 2001). 13

14 Le risque de transmission est de 5-10% (grossesse), 10-20% (accouchement) et de 5-10% (6 premiers mois de l allaitement) et de 10-15% (24 mois de l allaitement) (OMS, 2005). Au Burkina Faso, le nouveau protocole de la Prévention de la Transmission Mère-enfant (PTME) est en vigueur depuis 2007 au Centre Médical Saint Camille. Ce protocole vise à améliorer le traitement des mères VIH (+) et à réduire significativement le risque de transmission du VIH de la mère à l enfant. Les circonstances de diagnostic de l infection par le VIH-1 chez l enfant font appel à différentes techniques de diagnostic qui doivent être mises en œuvre en fonction du contexte thérapeutique et de l âge de l enfant. La technique de PCR qualitative en Temps Réel demeure de nos jours la plus utilisée dans le diagnostic précoce du VIH-1 chez les enfants de moins de 18 mois nés de mère séropositive. Cette technique, plus sensible, contrairement à la PCR classique permet d obtenir un meilleur résultat qu en à la détection du VIH-1 chez les enfants infectés. Plusieurs tests d amplification par PCR en Temps Réel existent et permettent tous de détecter le VIH-1 chez les enfants infectés. Afin d améliorer la qualité des résultats, il serait alors nécessaire d évaluer certains tests comme celui de Abbott (Abbott Real Time HIV-1 Qualitative) et de Biocentric (Generic HIV DNA Cell) qui sont tous des tests d amplification par PCR qualitative en Temps Réel utilisés dans notre laboratoire dans le cadre du diagnostic précoce du VIH-1 chez les enfants de moins de 18 mois nés de mère séropositive. 14

15 1. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE 1.1. Diversité génétique du VIH Le virus du SIDA présente une très forte variabilité génétique. Il existe deux principaux types de virus : le VIH-1 et le VIH-2. Le VIH-1, le plus répandu dans le monde, comprend quatre groupes ( M (Major), N (New), O (Outlier) et P ) qui présentent des caractéristiques génétiques différentes. A l'intérieur du groupe M, le plus fréquent, on distingue encore 9 sous-types (A, B, C, D, F, G, H, J, K) comportant des souches recombinantes appelées formes recombinantes circulantes (CRF01 à CRF37) (Peeters et al., 2008). Pour le VIH-2, 8 groupes (A, B, C, D, E, F, G, H) ont été définis. Les groupes A et B sont les plus représentés. L infection par le VIH-2 touche majoritairement des patients originaires d Afrique de l Ouest et d Afrique Centrale, en particulier au Sénégal, en Côte d Ivoire, au Mali, en Guinée-Bissau, au Burkina Faso, en Angola et au Mozambique. Figure 1 : Les différents groupes de VIH-1 infectant l homme (Source : ) 15

16 1.2. Organisation structurale du VIH Structure du VIH-1 La structure du VIH comporte : o Une enveloppe virale constituée d'une double bicouche lipidique et de deux sortes de glycoprotéines : gp120 (VIH-1) et gp 41. La molécule gp 120 joue le rôle de récepteur viral de la molécule membranaire CD4 des cellules hôtes. o Un core viral ou nucléocapside, qui inclut une couche de protéine p17 et une couche plus profonde de protéines p24. o Un génome constitué de deux copies d'arn simple brin associées à deux molécules de transcriptase inverse (p64) et à d'autres protéines enzymatiques (protéase p10 et intégrase p34). Figure 2 : Structure du VIH-1 (Karlson Hedestam et al., 2008) Organisation du génome du VIH-1 Le génome du VIH-1 se compose d'un ARN simple brin de nucléotides. Il comporte trois gènes principaux (Gag, Pol, et Env), ainsi que quelques gènes de régulation. Le VIH possède 9 gènes codant pour différentes protéines virales : les protéines de structure et les protéines régulatrices. 16

17 Figure 3 : Structure du génome du VIH-1 (Peterlin et Trono, 2003) 1.3. Mécanisme d infection par le VIH et évolution de l infection Mécanisme d infection par le VIH Il existe au moins deux récepteurs sur les lymphocytes T sur lesquels le VIH se fixe : le récepteur fondamental, CD4 qui présente une haute affinité pour la molécule gp120 et les co récepteurs CCR5, CXCR4 appartenant à la famille des chimiokines (Kim et al.,2009). La principale cible du VIH est le lymphocyte T CD4 bien qu il existe d autres types de cellules comme les macrophages, les monocytes et les cellules dendritiques qui sont infectées par ce dernier. 17

18 Figure 4: Etapes du cycle viral du VH-1 (Adapté de Engelmann et Cherepanov, 2012) Evolution de l infection virale Trois phases se distinguent lors d une infection par le virus du SIDA : La phase de primo-infection : elle correspond aux premières semaines qui suivent l entrée du virus dans l organisme. Le virus se multiplie alors intensivement dans ses cellules cibles, les lymphocytes T CD4. Durant cette période, appelée syndrome rétroviral aigüe, la charge virale plasmatique est élevée et on observe une déplétion des T CD4. Plus tard, le nombre de lymphocytes augmente mais est généralement inférieur à la normal. La phase asymptomatique : l individu atteint ne présente aucun symptôme de la maladie. Le virus continue de se répliquer, tandis que le taux de lymphocytes T CD4 circulants continue de baisser régulièrement. Nonobstant le contrôle de la maladie par le système immunitaire, les lymphocytes T sont progressivement détruits par le virus. La phase SIDA : le nombre des lymphocytes CD4 diminue et par conséquent, il se produit une dépression du système immunitaire principalement de type cellulaire mais également de type humorale. Ces événements conduisent à l apparition des premiers symptômes de la maladie et des infections opportunistes (Tuberculose, pneumocystose, Toxoplasmose cérébrale, Sarcome de Kaposi, infection à Cytomégalovirus etc.) 18

19 Figure 5: Evolution de l infection par le VIH-1 (Munier et Kelleher, 2007) 1.4. Modes de transmission du VIH Trois modes de transmission de l infection à VIH ont été éventuellement identifiés : Le premier est la transmission directe à travers des contacts sexuels non-protégés entre deux personnes dont l'une au moins est infectée par le VIH. Le deuxième mode est également direct. C'est la transmission mère-enfant ou transmission verticale. Cette transmission du VIH de la mère à l'enfant peut s'effectuer pendant la grossesse (10%), au moment de l'accouchement (15%) et après la naissance au cours de l'allaitement maternel (10%) (Simporé et al., 2007). Le troisième mode est indirect, c'est la transmission parentérale par le sang. Cette transmission par le sang se fait selon différentes modalités : La première unanimement reconnue est la transfusion de sang contaminé, La deuxième modalité est la transmission par une aiguille ou par tout instrument contaminé par le VIH perçant la peau d'une personne, La troisième modalité est la pénétration dans l'organisme du VIH véhiculé par le sang à travers une peau ou une muqueuse lésée. 19

20 1.5. Prévention de la transmission mère-enfant du VIH Les nouvelles lignes directrices 2013 de l OMS recommandent une initiation du traitement antirétroviral (TAR) pour toutes les femmes enceintes et allaitantes vivantes avec le VIH. Tableau I: Les options du programme de la PTME (OMS, 2013) 1.6. Techniques de diagnostic de l infection par le VIH Diagnostic indirect Test ELISA Deux tests ELISA existent pour le dépistage du VIH : ELISA indirect : les anticorps anti-vih à doser réagissent dans un premier temps avec l Ag immobilisé. Dans un deuxième temps, la quantité d Ac anti-vih fixé sur l Ag en excès est mesurée à l aide d un deuxième Ac anti-immunoglobuline (anti-igm, IgG) conjugué à une enzyme. L activité enzymatique est proportionnelle à la quantité d Ac anti-vih à doser. 20

21 ELISA sandwich : Un Ac spécifique d un Ag est immobilisé sur un support. Dans un premier temps, l Ag à doser est capté par l Ac spécifique immobilisé sur le support. Dans un deuxième temps, la quantité d Ac complexé avec l Ag est mesurée après sa réaction avec un Ac rajouté dans le milieu réactionnel, de même spécificité et couplé à une enzyme (ou Ac conjugué). C est ce test qui donne les résultats les plus satisfaisants aussi du point de vue de la spécificité que de la reproductibilité Tests de dépistage rapides (TDR) Le test de dépistage rapide du VIH détecte la présence des anticorps du VIH dans le sang. Ces anticorps apparaissent de quelques semaines à quelques mois après que le virus ait pénétré à l intérieur du corps. Il existe plusieurs TDR actuellement pouvant être effectués soit à partir du plasma, du sang total ou à partir de la salive Techniques de PCR en Temps Réel PCR quantitative en Temps Réel La réaction PCR La PCR par définition est une réaction en chaîne au cours de laquelle les produits issus d un cycle d amplification servent de matrice pour le cycle suivant. Ainsi, la réaction en chaîne qui s établit par la répétition des cycles de dénaturation-hybridation-élongation aboutit à une accumulation exponentielle théorique de 2 n fois par molécule d ADN. Autrement dit, la quantité de produits de PCR double à chaque cycle d amplification suivant la relation mathématique suivante : N = N 0. 2 n (Où : N est le nombre de molécules amplifiées au final, N 0 le nombre initial de molécules et n le nombre de cycles d amplification). 21

22 Figure 6 : Etapes de la PCR (Laudenbach, 2006) La Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) La Reverse Transcriptase PCR, est une PCR après transcription inverse d'un acide ribonucléique (ARN) en ADN complémentaire (ADNc). En réalité, il s'agit d'une PCR "classique" réalisée sur un ADN complémentaire (ou ADNc), qui est une copie d'un ARN obtenue par une transcription inverse. La transcription inverse est une réaction délicate du fait d une part, de sa faible reproductibilité et, d autre part, de la fragilité de l ARN et de sa contamination fréquente par de l ADN. Il faudra aussi dans certains cas obtenir une amplification spécifique dans un milieu où des séquences homologues peuvent être présentes en quantité très largement supérieure à celle de la séquence d intérêt (Cave et al., 2003). 22

23 Figure 7: (a) : Séparation de l ARNm des autres ARN cellulaires (b) : Transformation de l ARNm en ADNc par la reverse transcriptase (Pray, 2008) 23

24 Principe de la PCR quantitative en Temps Réel Le principe de la PCR quantitative en Temps Réel repose sur le suivi cycle par cycle de la réaction d amplification enzymatique au moyen d une molécule reporter fluorescente capable d émettre dans des conditions bien définies un rayonnement fluorescent dont l intensité sera directement mesurée à un moment donné au cours de chaque cycle PCR. L intensité de la fluorescence émise par la molécule reporter augmente à chaque cycle PCR. Par ce suivi, il est alors possible de tracer une courbe, de caractériser les différentes phases de la cinétique PCR et de mesurer la quantité de produit d amplification généré en un point de la phase exponentielle (figure 8). C est uniquement au cours de cette phase qu il sera possible d extrapoler la quantité de matrice cible initialement présente avant amplification. Au cours des premiers cycles d amplification, l intensité de la fluorescence émise est très faible et va permettre de définir la ligne de base de la courbe. Après un certain nombre de cycles, l accumulation des produits de PCR entraîne une variation mesurable de l intensité de la fluorescence émise. Le point de départ de la phase exponentielle, phase au cours de laquelle l efficacité d amplification est supposée rester constante, est appelé cycle seuil optique. Plus précisément, le cycle seuil optique est le nombre fractionnaire de cycles pour lequel l intensité de la fluorescence émise a dépassé une valeur seuil (ou seuil de détection optique) significativement différente du bruit de fond. Selon l algorithme utilisé pour son calcul, il est symbolisé par les lettres Ct (threshold cycle) ou Cp (crossing point). Le cycle seuil est un point remarquable de la cinétique d amplification car il se trouve inversement proportionnel au logarithme du nombre N 0 de molécules d acide nucléique cible initialement présentes avant amplification par PCR (Heid et al., 1999). Si l on suit la fluorescence au cours du temps d une PCR en Temps Réel, on observe une augmentation de cette fluorescence et donc du nombre de fragments PCR en 3 phases distinctes : Phase de bruit de fond : La quantité de fragment amplifié est insuffisante pour générer un signal fluorescent supérieur au seuil de détection. Phase exponentielle : La quantité de fragment amplifié génère un signal fluorescent supérieur au seuil de détection de l appareil, puis le nombre de produits amplifié double à chaque cycle. 24

25 Phase de plateau (ou de saturation) : certains composants de la réaction (et en particulier le nombre de molécules de Taq disponibles) deviennent limitant. Le système ne permet plus une amplification exponentielle. Figure 8 : Principe de la PCR quantitative en Temps Réel (Source : Dans les approches de quantification par RT-PCR, une séquence endogène sert de standard interne. Cette séquence est co-amplifiée avec la séquence cible au cours d une même réaction PCR utilisant deux couples d amorces spécifiques. La méthode permet d évaluer la quantité relative de gène cible par rapport au gène de référence, ce dernier permettant de normaliser la quantité et la qualité d acide nucléique extrait (Tse et Capeau, 2003) Méthodes de quantification de la charge virale Méthode Beacons Le principe est basé sur l'utilisation d'une seule sonde doublement marquée avec un rapporteur et un bloqueur, possédant une structure complémentaire lui permettant de se replier sur elle-même. Quand la sonde s'hybride à la séquence cible, elle subit un changement de conformation spontané forçant les deux fluorophores à s'éloigner, et permettant ainsi au rapporteur d'émettre une fluorescence (Tyagi et Kramer, 1996). L inconvénient majeur du système Beacon est la difficulté de conception des sondes. 25

26 Figure 9 : La chimie des sondes Beacons (Tse et Capeau, 2003) Méthode FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Le système utilise un couple de sondes d hybridation très courtes portant chacune un fluorophore (figure 10). La sonde en amont porte le fluorophore donneur à son extrêmité 3 et la sonde en aval porte le fluorophore accepteur à son extrêmité 5. La particularité de ce système réside dans le fait que le processus de transfert d énergie par FRET s effectue entre 26

27 les deux fluorophores séparés par moins de cinq nucléotides, le fluorophore donneur ayant un spectre d émission se chevauchant avec le spectre d excitation du fluorophore accepteur. Les sondes sont conçues afin qu elles s hybrident à leur séquence cible en restant adjacentes. Une fois que les sondes sont hybridées, les fluorophores donneurs et accepteurs sont proches l une de l autre (Simon et al., 2004). Le transfert d énergie est alors direct et hautement efficace : l énergie libérée par le fluorophore donneur de haute énergie est directement captée par le fluorophore accepteur de moindre énergie qui ainsi excité émet à son tour un signal fluorescent mesurable. À la différence du signal fluorescent émis par une sonde TaqMan, celui émis à l aide d un couple de sondes FRET en tandem est directement lié à l hybridation des sondes sur une cible qui leur est spécifique. De plus, les sondes ne subissant pas d hydrolyse, l émission de fluorescence est réversible et la production d une courbe de fusion est réalisable après PCR. Le système des sondes FRET en tandem est simple mais cependant limité par le choix du couple de fluorophores. Le transfert d énergie par FRET n est efficace que lorsque la fluorescéine est associée à l un des fluorophores très particuliers que sont les Red Light Cycler LC Red 640 et LC Red 705, ce qui limite à deux cibles maximum la capacité du système à quantifier simultanément plusieurs cibles (Tse et Capeau, 2003). Les sondes FRET sont extrêmement utiles pour le génotypage, la détection des SNP (Single Nucleotide Polymorphism) et la détection d autres mutations. 27

28 Figure 10: Principe des sondes FRET en tandem (Tse et Capeau, 2003) 28

29 Méthode TaqMan De nombreuses techniques sont applicables à la RT-PCR en Temps Réel (SybrGreen, test d'hybridation, sonde Beacon etc.) ; néanmoins, la plus utilisée pour la quantification des génomes viraux est la méthode TaqMan. À l'heure actuelle, le TaqMan est très utilisé en recherche, car il présente de très nombreux avantages et, malgré son coût élevé, son utilisation en diagnostic clinique au sein des laboratoires d'analyses se développe de plus en plus. La PCR Taqman est une procédure PCR basée sur l hydrolyse quantitative de sonde fluorescente, qui peut être employée pour la détection de la sensibilité et de la spécificité des acides nucléiques (Valasek et Repa, 2005). De nos jours, les nouvelles sondes Taqman ne possèdent plus de Quencher à leur extrêmité 3, mais le principe demeure le même. La fluorescence émise par le Reporter n est plus absorbée du fait de l absence du Quencher. La particularité du système Taqman est d exploiter l activité 5-3 nucléase de l ADN polymérase qui permet d hydrolyser la sonde hybridée à sa cible spécifique lors de l étape d élongation des amorces (Holland et al,.1991). À chaque brin synthétisé, la molécule fluorescente est libérée et la quantité de fluorescence est par conséquent directement proportionnelle au nombre de copies du gène amplifié. Par ailleurs, elle n'est pas influencée par l'accumulation de produits non spécifiques (comme des dimères d'amorces) sur lesquels la sonde marquée ne s'hybride pas. 29

30 Denatured DNA Primers and probe annealing 5 3 R 3 5 R Reporter dye Polymerisation Primers R R Fluorescent emitting Reporter dye Probe displacement by 5 exonuclease of Taq polymerase Synthesised DNA R Polymerisation completed R Figure 11 : Principe de la méthode Taqman (Adapté de Yang et Rothman, 2004) 30

31 PCR qualitative en Temps Réel : Dried Blood Spot (DBS) La PCR qualitative en Temps Réel est une technique d amplification in vitro qui permet la détermination qualitative des acides nucléiques du VIH-1 à partir de plasma humain et de sang total sur papier buvard DBS. Elle est utilisée lors du diagnostic de l infection au VIH chez les enfants et adultes. Les tests de détection des acides nucléiques du VIH-1 ont été recommandés pour la détection de l infection chez les patients pédiatriques jusqu à l âge de 18 mois (Read, 2007 ; Prendergast et al., 2007). La PCR qualitative en Temps Réel utilise la technologie PCR associée à une méthode de détection par fluorescence en temps réel pour détecter des acides nucléiques du VIH-1. Elle permet l obtention d un résultat qualitatif. Cette technique est utilisée dans le cadre de la PTME au CMSC à Ouagadougou pour vérifier une infection probable au VIH-1 chez des enfants de moins de 18 mois nés de mère séropositive. Principe du test Abbott Real Time HIV-1 Qualitative Le test Abbott Real Time HIV-1 qualitatif utilise la PCR pour créer des produits amplifiés à partir des acides nucléiques du VIH-1. La présence de la séquence cible VIH-1 est indiquée par un signal fluorescent généré grâce à l utilisation de sondes oligonucléotidiques marquées par des fluorochromes en utilisant l appareil Abbott m2000rt. Une séquence d ARN ne correspondant pas à la séquence cible du VIH-1 est introduite dans chaque échantillon au début de la préparation des échantillons. Cette séquence sert de contrôle interne (IC) afin de démontrer le traitement correct de chaque échantillon. Pendant la réaction d amplification, l ADN cible est amplifié sous l activité de l ADN polymérase thermostable rth ADN. La séquence cible du test Abbott Real Time HIV-1 qualitatif se situe dans la région codant l intégrase gène pol du génome du VIH-1, une région hautement conservée (Myers et al., 1994). La sonde VIH-1 possède une fraction fluorescente liée de manière covalente à l extrémité 5. Un oligonucléotide servant d inhibiteur (quencher) est complémentaire de l extrémité 5 de la sonde VIH-1 et possède un fragment désactivant à son extrémité 3. En présence d une séquence cible VIH-1, la sonde VIH-1 s hybride de préférence avec la séquence cible, la dissociant du quencher et permet ainsi la détection par fluorescence. Le résultat du test est soit "Detected" soit "Not Detected". 31

32 Principe du test Generic HIV DNA CELL de Biocentric Le test Generic HIV DNA CELL (Biocentric, Paris, France) est un test de PCR en temps réel pour la détection qualitative ou quantitative de l ADN VIH-1. Ce test exploite le principe de PCR par hydrolyse d une sonde nucléotidique doublement marquée avec un groupement 5 reporter et un groupement 3 quencher. Pendant la PCR, les amorces sens et anti-sens s hybrident à une séquence spécifique au niveau des amplicons. La sonde contenue dans le même mélange réactionnel s hybride à une séquence cible de l amplicon. Elle se fixe spécifiquement entre les deux sites où sont hybridés les amorces sens et anti-sens et inhibe toute activité polymérase de la Taq polymérase, mais active sa fonction 5-3 exonucléase qui clive la sonde entre le reporter et le quencher. Le reporter, libéré du quencher, émet un signal fluorescent enregistré en temps réel par des capteurs. L augmentation du signal fluorescent est détectée seulement si la séquence cible est complémentaire à la sonde et si elle est amplifiée par PCR. Ainsi, une amplification non spécifique ne peut pas être détectée. Le kit Generic HIV DNA CELL inclut un standard composé d ADN extrait de la lignée cellulaire 8E5 et contient 3x10 6 copies/ml. Cette lignée cellulaire est chroniquement infectée par le VIH-1 à raison d une copie d ADN par cellule. 32

33 Tableau II : Comparaison entre les tests Abbott Real Time HIV-1 Qualitative et Generic HIV DNA CELL Abbott Real Time HIV-1 Qualitative Generic HIV DNA CELL Système Fermé Ouvert PCR en temps réel Qualitative ou Quantitative Qualitative ou Quantitative Amplification 3h 2h Méthode Taqman Taqman Sensibilité copies/ml (DBS) soit 50 copies d ADN VIH/PCR 1 copie d ADN VIH/PCR Spécificité 100% 100% Durée du test 6 h minimum 5 h Coût Très élevé Peu élevé Contrôles -Contrôle interne -Contrôle négatif -Contrôle positif Absence de contrôle Région cible Intégrase du gène pol LTR Thermocycleur Détection sous-types Abbott m2000rt VIH-1, groupe M (A à H), groupe N et groupe O et CRF Biorad CFX96 Applied 7500 etc. VIH-1, groupe M (A à H), groupe N et groupe O 33

34 2. OBJECTIFS DE L ETUDE 2.1. Objectif principal L objectif principal est d évaluer la performance des tests qualitatifs Abbott et Biocentric dans le diagnostic de l infection au VIH-1 chez les enfants de moins de 18 mois nés de mères séropositives Objectifs spécifiques Les objectifs spécifiques liés à l objectif principal sont : o Evaluer le protocole de la PTME au centre médical Saint Camille o Effectuer le test de PCR avec chacun des tests Abbott et Biocentric ; o Comparer les résultats obtenus par les deux tests ; o Voir la possibilité d utiliser le test Generic HIV DNA Cell pour le diagnostic précoce du VIH-1 chez les enfants de moins de 18 mois au Centre Médical Saint Camille. 34

35 3. MATERIEL ET METHODES 3.1. Cadre et période d étude Notre étude s est déroulée à Ouagadougou, Burkina Faso : Au laboratoire du Centre Médical Saint Camille ; Au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI / Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (CERBA/LABIOGENE) L étude s est déroulée pendant une période d une (01) année allant d Août 2012 à Août Matériel d étude Population d étude et collecte des échantillons Notre étude a concerné au total 200 enfants âgés de moins de 18 mois parmi lesquels 160 enfants sont nés de mères suivant le protocole de la PTME et 40 enfants orphelins nés de mères mortes ou inconnues. Des spots ont été réalisés sur des papiers buvards (DBS) avec 50 µl de sang total ou directement par piqûres des doigts et ensuite conservés à température ambiante Recrutement des patients Critère d inclusion o Les enfants de moins de 18 mois nés de mère séropositive o Les enfants nés de mère suivant ou pas le protocole de la PTME au CMSC Critère de non inclusion o Les enfants dont les mères ne sont pas suivies au CMSC o Les enfants âgés de plus de 18 mois 3.3. Aspect éthique et confidentialité Le comité d éthique du CMSC a approuvé cette étude et les mères ont librement consenti de participer à l étude et toutes les informations recueillies auprès de ces mères ont été rendues confidentielles. 35

36 3.4. Analyse des données Les données cliniques ont été saisies sur Excel 2007 et ensuite analysées avec le logiciel standard Statistical Package for Social Sciences (SPSS) version 17,0 pour Windows et par le logiciel EpiInfo version Matériel utilisé Photo 1: ABBOTT m2000rt Photo 2: 7500 Fast Real Time PCR Systems 36

37 3.6. Méthodes PCR qualitative avec Abbott Real Time HIV-1 Qualitative Extraction de l ADN viral L ADN viral a été extrait à partir des spots (DBS) en utilisant le kit d extraction manuelle «Abbott TM msample Preparation System DNA» (Promega Corporation Madison ; WI USA 53711) selon le protocole suivant : 1. Préparation des réactifs d extraction Ajouter 35 ml d éthanol dans le flacon mlysis DNA Ajouter 23 ml d éthanol dans le flacon mwash1 DNA Ajouter 70 ml d éthanol dans le flacon mwash2 DNA Vortexer le contrôle interne 3 à 5 secondes et ajouter 750 µl dans le flacon de mlysis DNA Inverser doucement tous les réactifs sauf les microparticules Agiter vigoureusement le flacon de mmicroparticules DNA 2. A l aide d un ciseau bien nettoyé, découper 2 spots valides dans le papier buvard Whatman 903 et les transférer dans le tube correspondant ; 3. Ajouter 1,7ml de tampon mlysis Buffer DNA dans chaque tube ; s assurer que les spots sont entièrement immergés dans le tampon mlysis DNA 4. Incuber à température ambiante pendant 20 mn tout en remuant délicatement à intervalles réguliers à l aide d une pipette Pasteur stérile ; 5. Ajouter 40 µl de mmircoparticules DNA dans chaque tube de 5ml puis ajouter ensuite 2,4 ml de mlysis DNA ; 6. Ajouter 1ml de chaque contrôle et de chaque échantillon dans chaque tube de 5 ml et placer les tubes dans le bloc de 50 C pendant 20 mn ; 7. Au bout des 20 mn, retirer les tubes du bloc et homogénéiser le mélange et replacer les tubes dans le bloc à 50 C pendant 10 mn ; 8. Au bout des 10 mn, placer les tubes dans un support de capture magnétique (rouge) pendant 2 mn ; Retirer soigneusement et complètement le lysat avec une pipette Pasteur stérile ; Transférer ensuite les tubes dans un support non magnétique ; 37

38 mwash1 DNA 9. Ajouter 700 µl de mwash1 DNA dans chaque tube et resuspendre les particules magnétiques délicatement puis placer les tubes au bloc chauffant à 50 C pendant 5 mn ; 10. Retirer les tubes du bloc et homogénéiser le mélange et placer les tubes dans un portoir magnétique (rouge) pendant 1 mn pour permettre la capture des particules; 11. Retirer soigneusement et complètement le mwash1 DNA avec une pipette Pasteur stérile et transférer ensuite les tubes dans un support non magnétique. mwash2 DNA - Premier lavage 12. Ajouter 800 µl de mwash2 DNA dans chaque tube et resuspendre les particules magnétiques délicatement et transférer le mélange dans un tube de 1,5ml à bouchon et à vis étiqueté ; 13. Placer les tubes dans un portoir magnétique (bleu) pendant 1 minute afin de permettre aux particules d être capturées ; 14. Retirer soigneusement et complètement le mwash2 DNA avec une pipette Pasteur stérile et transférer ensuite les tubes dans un support non magnétique ; mwash2 DNA -Deuxième lavage 15. Ajouter 800 µl de mwash2 DNA dans chaque tube et resuspendre les particules magnétiques délicatement ; puis placer les tubes dans un portoir magnétique (bleu) pendant 1 minute afin de permettre aux particules d être capturées ; 16. Retirer soigneusement et complètement le mwash2 DNA avec une pipette Pasteur stérile ; transférer les tubes dans le bloc chauffant à 75 C pendant 10 mn pour permettre l évaporation de l éthanol. melution DNA 17. Ajouter 88 µl de melution DNA dans chaque tube et resuspendre les particules magnétiques délicatement et placer les tubes dans le bloc chauffant à 75 C pendant 5 mn ; 18. Retirer les tubes du bloc et homogénéiser le mélange puis replacer les tubes dans le bloc chauffant à 75 C pendant 5 mn ; placer ensuite les tubes dans un portoir magnétique (bleu) pendant 1 minute afin de permettre aux particules d être capturées ; 38

39 19. Retirer soigneusement et complètement l échantillon élué de chaque tube; Transvaser les échantillons élués dans de nouveaux tubes de 1,5ml ou dans une plaque en polypropylène de 96 puits Amplification de l ADN viral extrait Préparation du master mix d amplification Le master mix est composé de différents réactifs qui jouent des rôles bien précis lors de l amplification : 1. Ajouter 271 µl de réactif HIV-1 activation reagent (réactif 1) et 979 µl de réactif HIV-1 oligonucléotide reagent (réactif 2) dans le flacon thermostable rtth DNA polymérase enzyme (réactif 3) puis transférer le mélange dans un tube de master mix. 2. Distribuer des aliquotes de 50 µl du master mix d amplification dans chaque puits de la plaque Abbott de réaction optique à 96 puits. Préparation de l amplification 1. Transférer 50 µl de chaque éluât d échantillon sur la plaque Abbott de réaction optique à 96 puits placés sur le StrataCooler 96. Vérifiez visuellement qu'un total de 100µl (et pas plus!) a bien été distribué dans chaque puits ; 2. Sceller la plaque et la centrifuger à 5000 g pendant 5 mn. 3. Placer la plaque de réaction optique à 96 puits sur l appareil Abbott m2000rt et appuyer sur «set up run» pour lancer le processus d amplification. Les conditions de la PCR sont : (programme installé sur l appareil Abbott m2000rt) o 59 C pendant 30 mn 1 cycle o 95 C pendant 40 secondes o 46 C pendant 30 secondes 4 cycles 39

40 o 92 C pendant 30 secondes o 60 C pendant 30 secondes 6 cycles o 92 C pendant 30 secondes o 56 C pendant 1minute 30 secondes o 35 C pendant 1 minute 37 cycles PCR qualitative avec Generic HIV DNA Cell Extraction de l ADN viral L ADN du VIH-1 a été extrait à partir du protocole d extraction du kit Qiagen "QIAmp DNA Mini kit" selon le protocole suivant : 1. Couper 3 mm (1/8 inch) de diamètre perforé sur le DBS avec un cercle et placer 3 dans un tube de 1,5 ml puis ajouter 180 µl de Buffer ATL 2. Incuber à 85 C pendant 10 mn. Centrifuger brièvement pour récupérer les gouttelettes à l'intérieur du couvercle. 3. Ajouter 20 µl de protéinase K, passer au vortex et incuber à 56 C pendant 1 h. Centrifuger brièvement pour récupérer les gouttelettes à l'intérieur du couvercle. 4. Ajouter 200 µl de Buffer AL, passer au vortex vigoureusement et incuber à 70 C pendant 10 mn. Centrifuger brièvement pour récupérer les gouttelettes à l'intérieur du couvercle. 5. Ajouter 200 µl d éthanol (100%), passer au vortex vigoureusement, Centrifuger brièvement pour récupérer les gouttelettes à l'intérieur du couvercle. 6. Transférer attentivement tout le mélange dans une colonne QIAmp sans toucher le bord. Centrifuger à 6000 x g (8000 rpm) pendant 1 mn. Jeter le tube contenant le filtrat et placer la colonne dans un nouveau tube collecteur 7. Ouvrer attentivement la colonne QIAmp et ajouter 500 µl de Buffer AW1 sans toucher le bord. Centrifuger à 6000 x g (8 000rpm) pendant 1 mn. Jeter le tube contenant le filtrat et placer la colonne dans un nouveau tube collecteur. 8. Ouvrer attentivement la colonne QIAmp et ajouter 500 µl de Buffer AW2 sans toucher le bord. Centrifuger à x g (14 000rpm) pendant 3 mn. 40

41 9. Recommandation : Jeter le tube contenant le filtrat et placer la colonne dans un nouveau tube collecteur et centrifuger à grande vitesse pendant 1 mn pour éliminer le reste de Buffer AW Placer la colonne QIAmp dans un nouveau tube de 1,5 ml et jeter le tube collecteur contenant le filtrat. Ouvrer attentivement la colonne QIAmp et ajouter 150 µl de Buffer AE sans toucher le bord. Incuber à température ambiante (15-25 C) pendant 1 mn, et centrifuger à 6000 x g (8000 rpm) pendant 1 mn. 11. L éluât contient de l ADN viral et peut être utilisé immédiatement pour l amplification ou être conservé à -20 C Amplification de l ADN extrait Préparation des standards Préparer les différents points de gamme en procédant à des dilutions en cascade de 10 en 10 dans la solution d ADN génomique humain jusqu à l obtention des 4 points de gamme ciaprès : 10 µl Standard + 90 µl Solution d ADN génomique humain Vortexer 20 secondes 90 µl Standard (3x10 5 copies/ml) 10 µl Standard + 90 µl Solution d ADN génomique humain Vortexer 20 secondes 90 µl Standard (3x10 4 copies/ml) 10 µl Standard + 90 µl Solution d ADN génomique humain Vortexer 20 secondes 90 µl Standard (3x10 3 copies/ml) 10 µl Standard + 90 µl Solution d ADN génomique humain Vortexer 20 secondes 90 µl Standard (3x10 2 copies/ml) 41

42 Préparation du mélange réactionnel Calculer le nombre d échantillons à tester, sans oublier les quatre standards VIH, Dans un microtube stérile de 1,5 ml, préparer le mélange réactionnel suivant pour un échantillon. Pour un nombre "n" d échantillons, multiplier par "n+1" tous les volumes indiqués : o Amorce A : 1 µl x (n+1) échantillons o Amorce B : 1 µl x (n+1) échantillons o Sonde C : 1 µl x (n+1) échantillons o Mélange réactionnel 2X : 25 µl x (n+1) échantillons o H2O : 2 µl x (n+1) échantillons Volume total : 30 µl x (n+1) échantillons Homogénéiser la solution obtenue au vortex. Récupérer les éventuelles gouttelettes présentes sur les bords du tube en centrifugeant pendant 1 min Répartir dans une plaque Taqman 30 µl de mélange réactionnel obtenu. Passer au vortex chaque standard ou échantillon pendant au moins 30 secondes puis déposer 20 µl d échantillon ou de standard dans chaque puits. Volume réactionnel final : 50 µl Programme d amplification L amplification a été faite avec l appareil 7500 Fast Real Time PCR System selon le programme suivant : 95 C...10 minutes (Activation de l enzyme) 95 C...15 secondes (Dénaturation) x 50 cycles 60 C... 1 minute (Hybridation) Remarque : l élongation des amorces a lieu durant le passage de 60 C à 95 C. 42