GENETIQUE DES PROCARYOTES. Cours proposés par Dr SAIDI Niveau L3

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1 GENETIQUE DES PROCARYOTES Cours proposés par Dr SAIDI Niveau L3

2 Programme National - Structure, organisation et réplication du matériel génétique bactérien : - chromosome - plasmides - bactériophages II- Mutations et Réparation de l ADN III- Recombinaison génétique et éléments génétiques mobiles - Recombinaison homologue, - Recombinaison site spécifique, - Eléments génétiques mobiles et applications IV- Echanges génétiques entre bactéries. Cartographie, analyse et constructions génétiques - Conjugaison - Transformation, - Génétique des bactériophages et transduction - Restriction et modification contrôlées par l hôte

3 V- Expression et régulation de l information génétique chez les bactéries et bactériophages V.1. La transcription chez les procaryotes : Définition, l ARN polymérase, les promoteurs bactériens, déroulement de la transcription. V.2. La traduction chez les procaryotes : Initiation, élongation, terminaison V-3. Régulation de l expression génétique V.3.1. Au niveau transcriptionnel - Notion de force du promoteur - La reconnaissance du promoteur (rôle des facteurs sigma dans la régulation) - Disponibilité du promoteur (modèle de variation de phase chez les bactéries) Régulation par les facteurs de transcription : régulation positive et négative Modes d action des différentes classes de répresseurs et d activateurs Régulation négative inductible : opéron lactose Régulation négative répressible : opéron tryptophane Régulation positive par l activateur CAP/AMPc, cas de l opéron lactose Régulation positive et négative : opéron arabinose - Régulation par l atténuation : opéron tryptophane - Régulation par antiterminaison de la transcription : bactériophage lambda V.3.2. Au niveau traductionnel - Initiation de la traduction, atténuation de la traduction, terminaison de la traduction Mode d évaluation : Contrôle continu et Examen semestriel

4 Chapitre I Structure, organisation et réplication du matériel génétique bactérien Chromosome Plasmide bactériophage

5 Le chromosome bactérien L appareil nucléaire des bactéries (protistes procaryotes,) est constitué d'acide désoxyribonucléique (ADN) ( support de l'information génétique) Le chromosome est une double hélice d'adn circulaire- pelotonnée, surenroulée dans le cytoplasme (action des topoisomérases, au nombre de 4 chez les bactéries). Déplié, le chromosome bactérien a près de 1 mm de long (1000 fois la longueur de la bactérie) et 3 à 5 nanomètres de large. La réplication est selon le schéma de Watson et Crick, chaque chaîne assure la réplication de la chaîne complémentaire selon un mode semiconservatif. L'analyse chimique du chromosome : 80 % d'adn, à 10 % d ARN (rôle de structuration) et à 10 % de protéines ( ADN polymérases topoisomérases, ADN gyrases, ARN polymérases) Les constituants de l'appareil nucléaire sont la cible d'action de plusieurs antibiotiques : les quinolones inhibent les topoisomérases et les rifamycines inhibent les ARN polymérases, tandis que les nitromidazoles entraînent la fragmentation de l'adn chez les anaérobies stricts.

6 Structure de l ADN Bactérien Structure primaire de l ADN Structure primaire de l ADN résulte de la condensation de nucléotides monophosphates, par des liaisons phosphodiésters entre le carbone 3 d un premier nucléotide et le résidu phosphorylé porté par le carbone5 du nucléotide suivant La structure est formée de 2 chaînes de polynucléotides orientées dans le sens 5 3, antiparallèles.

7 La structure secondaire Une Hélice formée de deux chaines hybridées deux à deux. Caractéristiques 1/ antiparallèles : l extrémité 5 d une chaine est du côté de l extrémité 3 de l autre chaine. 2/ complémentaires : les nucléotides d une chaîne sont complémentaires aux nucléotides de la 2 ème chaine. Les règles de complémentarité universelles : en face la base A on trouve la base T, en face la base C on trouve la base G. rapports A/T, C/G constants. Cette complémentarité est due à la conjonction de deux phénomènes : Des contraintes sériques : la complémentarité purinepyrimidine fait que chaque paire de base ayant la même dimension, la structure d ADN est très régulière. La création de liaisons d hydrogènes: entre les bases complémentaires., 2 liaisons entre A-T et de 3 entre C-G. Ce nombre influe sur la stabilité de l appariement. Pour rompre l appariement A-T, il faut une énergie de 21kj, et 63kj pour rompre C-G. 3/ Chaines hélicoïdales : l ADN s enroule autour d un axe central imaginaire en formant une double hélice droite (ADN A, ADNB). Le pas de l hélice est de 34Â (10pb), la distance entre deux bases voisine est de 3.4Â et le diamètre de 20Â.

8 La Réplication Définition: La réplication est un mécanisme de synthèse de l acide désoxyribonucléique (reproduction exact du génome) mode semi-conservatif: l ADN contient un brin dérivée de la molécule mère (matrice) et un brin néosynthétisé (expérience de Meselson et Stahl, 1958) sens de la synthèse: 5 vers 3.

9 La réplication du chromosome bactérien Le chromonème possède une origine de réplication (oric); à ce niveau se fait la séparation des deux brins: Formation de fourches de réplication (2 fourches qui progressent dans les deux sens opposés/ bidirectionnelle). Les deux fourches fusionnent. La réplication s achève au point (terc). Remarque : le chromonème est un réplicon. Un réplicon est toute molécule d ADN avec une origine de réplication.

10 Eléments impliqués dans la réplication 1- ADN matrice, 2- désoxyribonucléotides (datp, dgtp,dctp, dttp), 3- ions Mg 2+ 4-Topoisomérases (DnaA): élimine les contraintes de surenroulement crées par l hélicase (DnaB). 5 - Hélicase (DnaB) additionné de DnaC: sépare les brins d ADN 6- SSB (Single Strand Binding) : protéines qui stabilise l ADN monocaténaire 7- ADN polymérase III : polymérise les désoxyribonucléotides dans le sens 5 3 (composé de sous unités α2 ε2 β4 γ δ δ χ et ψ) 8- Primase (DnaG) : synthétise les amorces d ARN nécessaire à la polymérase 9- ADN ligase : attache les fragments d Okazaki sur le brin retardé.

11 Eléments du mécanisme de réplication chez E.coli

12 1- Initiation de la réplication 1)formation de la fourche de réplication : au niveau d une origine de réplication (ori C). a) oric: composé de trois régions riche en A-T (TTATCCACA) et de 4boites DnaA. De 10 à 12 molécule de protéines DnaA se lient aux boites DnaA et forme le complexe. Le déroulement se fait dans les deux sens par ce complexe DnaA (topoisomérases) (b)le complexe dissocie la région riche en A-T et ouvre la double hélice. 2) Séparation des deux brins : par l action d une enzyme (hélicase/ DnaB), maintenus séparés par des protéines, SSB (single strand binding) c) Une fois ouvert, DnaC se lie au DnaB (hélicase) pour démêler encore ce domaine. d) Finalement DnaG primase initie (commence) la synthèse par polymérisation d un brin d ARN.

13 2- Elongation Après l initiation, sur un fragment (matrice) de la fourche, l élongation est continue (brin précose), sur l autre matrice, l élongation est discontinue (fragments d Okazaki). L avancée de la réplication illustrée est de droite vers la gauche. Sur le brin continu la synthèse se fait par DNA Pol III, liée à DnaQ qui fourni la fonction editing. Le domaine C-terminal de DnaQ se lie à la DNApol III et le domaine N-terminal contient l activité exonucléasique ( editing function). Le brin retardé est synthétisé en fragments d ADN (Okazaki) qui sont liés ensemble par la ligase après avoir enlevé le brin d ARN par la DNA Poly I. Correction des paires de bases dépareillées: editing function

14 3-terminaison La terminaison de la réplication se fait quand les deux fourches de réplication fusionne au point opposé à OriC, le site (ter C)sous l action de la DNA de terminaison de la réplication (Dnat). La séparation des deux molécules filles d ADN se fait grâce à l action de la DNA gyrase (topoisomérase II)

15 Mécanismes d action des topoisomérases a) Les topoisomérases catalysent la conversion interne des molécules d ADN circulaires. Les molécules d ADN peuvent être relâchées ou superenroulées, nouées ou dénouées, caténaire ou non, par l action des topoisomérases. b) b) Deux types de topoisomérases classées en fonction du nombre de coupure faite sur l ADN. Topo I : une cassure sur une des deux molécules. Topo II : cassures faites sur les deux molécules.

16 ADN polymérase I et fragment de Klenow L enzyme est composé : D un petit domaine central avec une activité exonucléasique orientée de 3'->5' qui constitue l'activité de correction d'épreuves (édition). C'est grâce à cette activité que l'enzyme effectue une réplication fidèle, avec un taux d'erreurs extrêmement faible. Le gros domaine C-terminal possède l'activité de polymérisation, orientée de 5'->3'. Une protéolyse ménagée par la subtilisine permet de détacher très spécifiquement le petit domaine N-terminal. Les deux autres domaines restent liés et constituent le "fragment de Klenow" dépourvu d'activité exo 5'- >3' (les nombres rouges indiquent les positions des acides aminés). Le fragment de Klenow est très largement utilisé au laboratoire dans les expériences de réplication in vitro.

17 Plasmides naturels Les plasmides: éléments génétiques extrachromosomiques capables d une réplication autonome (le terme plasmide est donné par Lederberg, 1952). A côté du chromosome, la bactérie peut contenir des plasmides de petite taille (0,5 à 5 % du chromosome bactérien ou 5 à 4000 fois plus petit que le chromosome).

18 * Le plasmide peut s intégrer dans un chromosome bactérien (épisome). détecté lorsque les gènes qu'ils transportent confèrent à la bactérie de nouvelles propriétés. Les plus connus de ces plasmides sont: - Le facteur sexuel ou facteur F Le facteur sexuel ou facteur F assure le transfert de fragments de chromosome bactérien par conjugaison. - Les plasmides de résistance aux antibiotiques (ou facteurs R)

19 Classification des plasmides 1. Propriétés de transfert a) Plasmides conjugatifs - permettent la conjugaison. - généralement grands (65Md) - la réplication est de type strict : sa réplication est synchronisée avec celle du chromosome - En petit nombre (1-3 copies/ cellule) - Plasmides : R1, R6, EntP 307

20 b) Plasmides non-conjugatifs - ne peuvent pas médier la conjugaison. - généralement petits (4 à 6 Md) - ils leur manquent un ou plusieurs gènes nécessaires pour le transfert d ADN. - Un plasmide non-conjugatif peut être transféré par conjugaison si la cellule porte aussi un plasmide conjugatif. - Le contrôle de la réplication est de type relâché (en l absence de protéine cellulaire) Exemple de Plasmides conjugatifs: ColE1, RSF1030, clodf13

21 2-Effets phénotypiques a) Plasmide de fertilité (Facteur F) b) Plasmides bactériocinogéniques [ gènes de bactériocines ou colicines] c) Plasmides de résistance (facteurs R) gènes de résistance aux antibiotiques, confèrent aux bactéries la résistance à divers antibiotiques (RSF1030). Les gènes peuvent être organisés dans le plasmide au sein de transposons (Tn) RTF (Facteur de Résistance Transfert)- porte les gènes de transfert. Déterminant R- porte les gènes de résistance. Les gènes de résistance sont souvent des parties de transposons.

22 Exemples Les staphylocoques portent un gène qui code pour la production d'une pénicillinase qui inactive la pénicilline G et les pénicillines du groupe A (ampicilline) ce qui rend la bactérie résistante à ces pénicillines (idem chez E.coli, gonocoque,...).

23 Réplication des plasmides La synthèse d ADN plasmidique se fait à partir de l origine de réplication est soit: -a) unidirectionnelle (a): Pt181 synthétise un brin d ADN dans une direction à partir de l origine, puis son brin complémentaire. b)bidirectionnelle (b) R1 initie la synthèse d un brin et juste après le second brin. pt181: Staphylococcus aureus R1: Salmonella paratyphi

24 Structure de l ADN au niveau de l origine de réplication des plasmides Deux exemples de structure d ADN au niveau de l origine (ori): a) Origine contiennant une région riche en A-T et des sites de liaison de protéine d initiation ou RNA. b) P1 code une protéine initiatrice RepA qui se conjugue avec DnaA au niveau de l ADN pour ouvrir la région A-T et commencé la réplication

25 code toutes les protéines initiatrices (RepA, RepB et RepC) et n utilise pas les protéines de l hôte pour commencer sa réplication. Plasmide RSF1010

26 Plasmide ColE1 utilise une molécule d ARN pour ouvrir et initier la synthèse d ADN.

27 Stratégies de répartition du nombre de copies de plasmide a) la Répartition inégale d un nombre élevé de copies au hasard dans les cellules filles sera résolu par la réplication

28 Stratégies de répartition du nombre de copies de plasmide b)certains plasmides à nombre de copies élevé contiennent un mécanisme pour résoudre les dimères de plasmide en monomères qui seront répartit indépendamment

29 Stratégies de répartition du nombre de copies de plasmide c) système de répartition utilisé pour les plasmides à nombre de copies faible d) Chez P1 la région par code pour deux protéines Par A et Par B. Le complexe ParA-ParB se lie en position cis, au niveau d un site appelé site S ceci va dirigé toutes les molécules du plasmide au milieu de la cellules jusqu à ce que les cellules filles soient bien distinctes, ainsi les copies seront répartit équitablement

30 Plasmides incompatibles Deux plasmides sont dits incompatibles s ils portent la même origine de réplication et dans ce cas la cellule fille finira par n en gardé qu un des deux.

31 LES BACTERIOPHAGES Un phage est une particule qui infecte une bactérie. Le phage est composée essentiellement d un matériel génétique (ADN ou ARN) protégé par une enveloppe appelé capside constituée de protéines.

32 Le phage lambda (λ) est un phage qui infecte Ecoli La tête du phage renferme l ADN viral. La queue renferme des protéines. Elle permet la fixation du phage sur la cellule-hôte bactérienne (protéine J). Le phage lambda

33 L ADN du phage est un DNA double brin, linéaire, de longueur 48.5kb. Plusieurs dizaine de gènes. Extrémité simple brin de 12 nucléotides, complémentaires. Extrémités cohésives (bout collant).

34 Les cycles du phage λ Le phage se multiplie selon deux modes: - multiplication lytique - multiplication lysogénique.

35 La multiplication lytique 1- Infection : liaison du phage à E.coli par la protéine J, qui se lie à une porine à la membrane d E.coli. 2- Adsorption et pénétration : injection de l ADN phagique par diffusion passive à travers la membrane. L ADN virale se circularise immédiatement par complémentarité des extrémités cohésives (séquences cohésives) formant un site cos. Une ligase bactérienne scelle les brins.

36 3- La multiplication du phage expression des gènes codants divers protéines pour la réplication de l ADN phagique, pour la synthèse des protéines de la tête et la queue. Formation d un concatémère.

37 4-Empaquetage d une molécule d ADN dans la tête puis assemblage tête et queue. 5-Libération des phages : lyse bactérienne par action de deux protéines du phage (endolysine et holine), 200 phages sont produits par bactérie.

38 La multiplication lysogénique L ADN viral s intègre à l ADN bactérien par recombinaison spécifique de site et sera répliqué en même temps que lui. Les gènes qui codent les protéines de la tête et de la queue ainsi que les gènes du cycle lytique sont réprimés par un répresseur codé par le gène viral Ci.

39 Le bactériophage M13 Infecte E.coli Le matériel génétique du phage: - un simple brin de DNA circulaire, - de longueur 6.4kb appelé brin +. - Il comprend 10 gènes et 2petites régions «intergéniques». - Le DNA est recouvert de protéines donnant un phage en forme de batonnêt «filamenteux».

40 La transfection La transfection des bactéries par M13 et l expression du phage dépendent de la présence d un chromosome surnuméraire bactérien (épisome F ): la présence de cet épisome permet le cycle normal du phage : synthèse d un brin d ADN complémentaire, réplication et en fin de cycle synthèse spécifique d un seul des deux brins de l ADN (brin +) qui sera pourvu d une membrane et sécrété hors de la cellule.

41 Le cycle lytique du phage M13 divisé en trois étapes : 1- Entrée dans l hôte: Le phage M13 entre dans la bactérie via le pilus F codé par un plasmide F (facteur de fertilité). 2- Multiplication: une fois dans le cytoplasme le brin+ est répliqué en une forme double brin dite «RF» (replicative form). Après 100 à 200 RF la synthèse de DNA devient asymétrique. Seul le brin+ est produit. 3- Expulsion : à travers la membrane cytoplasmique (sans produire de plage mais de petite dépression dans la couche de milieu solide) les phages M13 sont expulsés revêtu de protéines. Comme M13 n est pas enfermé dans une tête (comme λ), il n y a pas de stricte limite à la longueur de DNA expulsé.

42 Cycle lytique du phage M13

43 Cycle lysogénique Lorsque l épisome ne contient pas les gènes permettant le cycle lytique (épisome F ), l ADN du phage s incorpore sous la forme d un ADN double brin capable d exprimer les gènes qu il contient

44 résumé Les procaryotes (bactéries) possèdent un matériel nucléaire appelé le chromonème et des éléments génétiques extrachrachromosomiques que sont les plasmides. Les bactéries sont infectées par des bactériophages qui sont des particules virales constituées d ADN ou d ARN protégés par une enveloppe, la capside. Le chromonème, le plasmide et le bactériophage, peuvent échanger des fragments d ADN par des mécanismes de transfert attribuant à la bactérie de nouveaux phénotypes contribuant à la diversité chez les procaryotes. Les plasmides et les phages sont modifiés par les chercheurs (géni génétique) et servent de vecteurs de transfert de matériel génétique.

45 UNIVERSITE DES SCIENCES ET DE LA TECHNOLOGIE MB. FACULTE SNV. DEPARTEMENT GMA GENETIQUE DES PROCARYOTES 3ème année licence SAIDI-OUAHRANI Nadjia Matériel génétique- mutation réparation- transfert-régulation

46 USTO (MB). FSNV. Département GMA. L3. Matière : Génétique des procaryotes Exercice 1 : Que représente la figure ci-dessous? Donner un maximum d information. Exercice 2 : Que peut représenter ce schéma, à condition de le compléter? Dr SAIDI Page 1

47 USTO (MB). FSNV. Département GMA. L3. Matière : Génétique des procaryotes Exercice 3 : J. Cairns (1963) a prouvé que l ADN d E.coli est circulaire (fermé) et que le mode de réplication est semi conservatif en utilisant la thymidine tritiée. R Rodriguez a utilisé la méthode de Cairns et observa que la réplication est bidirectionnelle. Les bactéries sont placées pendant un temps variable dans un milieu contenant de la thymidine tritiée à faible niveau de radioactivité puis à fort niveau de radioactivité. D après vos connaissances, actuelles schématiser les chromosomes observés par les deux chercheurs. Exercice 4 :Expérience de Meselson et Stahl (1958) Des bactéries E.coli sont cultivées dans un milieu de culture contenant l isotope lourd de l azote (N 15 ). Après un grand nombre de division tout l ADN de ces cellules est marqué par l isotope lourd. Les bactéries sont ensuite transférées dans un milieu normal à N 14. Des échantillons bactériens sont prélevés toutes les demi-heures. L ADN des bactéries est extrait des cellules et dissout dans une solution de chlorure de césium (CsCl) puis introduit dans une centrifugeuse. Lorsque le CsCl est centrifugé à très haute vitesse (50000 rpm) pendant plusieurs heures, les ions césium et chlorure migrent vers le font du tube sous l effet de la force centrifuge. Un gradient d ions s établit avec une concentration plus élevée dans le fond. Les molécules d ADN sont également poussées vers le fond mais les repoussent vers le haut en raison de leur densité de flottaison. Le trajet de l ADN s arrête à l endroit du gradient ou la force centrifuge compense exactement la densité de flottaison qui dépend elle-même de sa densité. L isotope lourd augmente la densité de l ADN. L ADN normal peut être donc distingué aisément de l ADN marqué N 15 grâce aux positions qu ils occupent dans le gradient de chlorure de césium. Les résultats expérimentaux sont schématisés dans la figure suivante. Dr SAIDI Page 2

48 USTO (MB). FSNV. Département GMA. L3. Matière : Génétique des procaryotes Analyser et interpréter les résultats, que pouvez-vous déduire? G : Génération EXERCICE 5: compléter la légende du schéma suivant et que représente-il? Dr SAIDI Page 3

49 USTO (MB). FSNV. Département GMA. L3. Matière : Génétique des procaryotes Exercice 6 La figure ci-dessous représente un mécanisme ayant lieu in vivo ou in vitro. De quel mécanisme s agit-il? Compléter la légende en citant les éléments indispensables intervenant dans ce mécanisme. Exercice 7 Certaines souches bactériennes ont développé une résistance à un antibiotique (gentamycine). Quel est le mécanisme classiquement évoqué pour expliquer cette résistance? Un tel mécanisme est-il envisageable dans le cas ou la résistance est très rapidement acquise d une part et d autre part elle s accompagne de résistance à trois autres types d agent antibactériens (le chloramphénicol, l ampicilline et la sulfamide)? Exercice 8 Analyser les propriétés de certains plasmides résumés dans le tableau suivant. Que pouvezvous déduire? Dr SAIDI Page 4

50 USTO (MB). FSNV. Département GMA. L3. Matière : Génétique des procaryotes plasmide Taille Intervient dans Nombre de Phénotypes (mégadaltons) la conjugaison ou non copies de plasmides /cellule R Résistance à de multiples drogues R Résistance à de multiples drogues Ent P Production d entérotoxines Col E Production de colicine E1 RSF Résistance à l ampicilline Clo DF Production de cloacine Exercice 9 : Dans quel état topologique est chaque plasmide schématisé ci dessous? a quelle bande, sur le gel d agarose, correspondre chaque état? Dr SAIDI Page 5

51 USTO (MB). FSNV. Département GMA. L3. Matière : Génétique des procaryotes Exercice 10 : donner la légende de la figure suivante montrant une représentation schématique des deux cycles possibles de λ dans E.coli. Dr SAIDI Page 6